不同光谱组成的人工照明对视网膜色素上皮细胞的影响

目的 探讨不同光谱组成的人工照明对视网膜色素上皮(RPE)细胞的影响。方法 将体外培养的ARPE-19细胞随机分组：无光照对照组、非全光谱照明组(细分为300 lx、600 lx两个亚组)、全光谱照明组(细分为100 lx、300 lx、600 lx、900 lx四个亚组),无光照对照组细胞避光培养,其他组细胞采用相应光谱和光照强度干预。将分组光照24 h、48 h、72 h后的ARPE-19细胞置于倒置荧光显微镜下观察细胞形态变化;CCK-8法检测细胞活力;线粒体膜电位法检测线粒体功能。结果 光学显微镜下可见,光照72 h后,各组细胞密度明显增大,细胞大小不一,细胞多边形不典型;全光谱照明组细胞较非全光谱照明组细胞形态规整,异形细胞数少。光照24 h后,与无光照对照组相比,非全光谱照明300 lx组,全光谱照明300 lx、600 lx、900 lx组细胞活力均降低(均为P<0.05)。全光谱照明900 lx组细胞活力高于非全光谱照明300 lx组(P<0.05)。光照48 h后,各组细胞活力较光照24 h时提高;全光谱照明100 lx、300 lx组细胞活力低于非全光谱...     

蓝光诱导猪视网膜色素上皮细胞复制衰老的实验研究

目的观察蓝光对猪视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞复制衰老过程中衰老相关-β-半乳糖苷酶（senescence associated-beta-galactosidae，SA-β—Gal）的影响。方法将第3—6代猪RPE细胞置于自制蓝光发光二极管（light emitting diode，LED）光源下，波长450～500nm，1h／d；细胞表面水平光照强度分别为（500±100）lux、（1000±200）lux、（2000±500）lux，光照时细胞水平面的温度变化为36．5—37．5℃；对照组用黑纸完全包裹培养瓶。将各组细胞消化后接种于24孔板和96孔板培养24h，进行SA-β-Gal活性的检测和MTT法检测细胞增殖情况。结果随光照强度和传代次数增加，细胞内出现蓝色颗粒的阳性细胞数目逐渐增多，SA-β-Gal活性增高，除高强度与中强度光照组、第4代和第5代之间相比差别没有统计学意义（P〉0．05）外，其余每两组之间的差异均具有统计学意义（P〈0．05）；通过MTT法检测，细胞的增殖能力随光照强度和传代次数增加而降低，除中强度与低强度光照组相比差别没有统计学意义（P〉0．05）外，其余每两组之间的差异均具有统计学意义（P〈0．05）。结论蓝光可以诱导体外培养猪RPE细胞复制衰老，并且光照强度增加可以促进细胞复制衰老。     

不同波长的光照射对视网膜色素上皮细胞生长及其分泌生长因子的影响

背景近视的发病机制是眼科研究的一个热点,近年来发现,由神经视网膜细胞及视网膜色素上皮（RPE）细胞分泌的细胞因子可能参与近视的发病,RPE细胞因子的分泌功能受光照射的影响,而RPE细胞对不同波长光的吸光度（A）值是不一样的。目的研究不同波长的光照射对人胚RPE细胞增生及其分泌肝细胞生长因子（HGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bVGF）和转化生长因子-β（TGF—β）的影响,从细胞水平和分子生物学水平探讨近视的发病机制。方法第4～5代人胚RPE细胞置于白光、波长为775nm的红光及波长为480nm的蓝光下照射和培养48h,MTT比色法检测各组人RPE细胞的增生情况,并用透射电子显微镜观察各组传代细胞的超微结构。分别于光照射后12、24、48、72h收集培养液,采用酶联免疫吸附实验（ELISA）测定培养基中HGF、bFGF和TGF—β的质量浓度。用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测不同波长光照射24h后RPE细胞中HGFmRNA的表达水平,分析蓝光、红光、白光照射对体外培养RPE细胞的影响。结果蓝光组、红光组、白光组和对照组RPE细胞的A490值分别为0．0218±0．0014、0．0353±0．0025、0．0371±0．0024和0．0445-0．0046。4个组中RPE细胞的增生速度明显不同,差异有统计学意义（F=12．579,P〈0．05）,蓝光组和红光组A490值均明显低于对照组,差异均有统计学意义（t=2．043、t=2．024,P〈0．05）。ELISA结果显示人胚RPE细胞可以分泌HGF、bFGF和TGF-β,在受到不同波长的光照射后,不同时间点HGF、bFGF和TGF—β的分泌量不同,随着时间的变化,4个组HGF、TGF—β的质量浓度均逐渐升高,二者在72h和48h均高于12h（P〈0．05）,红光组与蓝光组更为明显,与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。各波长组bFGF的质量浓度随着光照时间的延长在RPE细胞中的表达均逐渐降低,72h与12h时相比差异均有统计学意义（P〈0．05）。RT—PCR结果显示,不同波长光照射后RPE细胞中HGFmRNA的表达水平不同,蓝光下培养的RPE细胞HGFmRNA表达量最少,白光组、红光组和蓝光组HGFmRNA的表达量（A490）与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。透射电子显微镜下红光组、白光组人胚RPE细胞与对照组相比超微结构均无明显变化,但蓝光组RPE细胞核染色质稀疏变淡,细胞器减少,细胞界膜不清或消失。结论不同波长的光照射可影响人RPE细胞的增生及其分泌HGF、bFGF和TGF—β的功能,提示近视的形成可能与不同波长的光相互作用有关。     

不同浓度维拉帕米及不同光照形式对豚鼠RPE细胞Ca^2＋的影响

目的：探讨不同浓度维拉帕米（verapamil,Ver）对体外培养豚鼠视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞内Ca^2＋浓度的影响,并比较有无Ver作用下经不同形式光照后RPE细胞内Ca^2＋浓度的变化。方法：2周龄幼年健康豚鼠10只,体外培养RPE细胞,传代、鉴定后,将细胞分为Ver处理组和未处理组,Ver处理组加入80mg/L Ver作用12h。两组均进一步分为聚焦光组、离焦光组、平行光组和空白对照组,前三组分别接受聚焦光、离焦光（均为将平行光经透镜转化）和平行光照射,空白对照组不接受照射。于照射后立即采用激光扫描共焦显微镜（laser scanning confocal microscopy,LSCM）测定细胞内Ca^2＋荧光强度,分析不同光照形式与效应的关系。统计学方法采用单因素方差分析。结果：Ver作用于RPE细胞12h后,20,40,80mg/L组的细胞凋亡情况与空白对照组相比均无统计学意义（P〉0.05）,Ver可降低RPE细胞内Ca^2＋荧光强度,浓度为20,40,80mg/L时分别降低了10.36%,24.54%,58.05%,仅80mg/L组与无光照组相比差异有统计学意义（P〈0.05）。未加Ver对RPE细胞进行光照,聚焦光组的Ca^2＋荧光强度较其他各组明显升高,离焦光组的荧光强度也较高,组间比较有统计学差异（P〈0.05）。加入80mg/LVer对RPE细胞作用12h后再进行光照,光照各组Ca^2＋荧光强度没有明显提高,组间比较没有统计学差异（P〉0.05）。结论：超过一定浓度的Ver可诱导RPE细胞凋亡,80mg/L可在不引起RPE细胞凋亡的前提下有效降低细胞内Ca^2＋荧光强度;不同光照形式对豚鼠RPE细胞内Ca^2＋有明显刺激作用,聚焦光影响最大;不同光照形式对Ver处理的RPE细胞内的Ca^2＋荧光强度无明显作用。     

光损伤后人视网膜色素上皮细胞血管内皮生长因子A及其受体的表达

目的 观察光损伤后人视网膜色素上皮(RPE)细胞血管内皮生长因子A(VEGF-A)及其受体可溶性fm样酪氨酸激酶受体(sFlt-1)和包含激酶植入区域受体(KDR)的表达.方法 体外培养人RPE细胞,取第8～12代生长良好的传代细胞用于实验.将同代细胞随机分为对照组和光损伤组.以18 W冷白色荧光灯作为光源,自制光照器.采用双层高压消毒锡纸包裹对照组细胞,与光损伤组细胞一同置于自制光照器下,控制光照强度在(2200±300) Lux,持续光照12 h建立光损伤模型.于光损伤后0、6、12、24 h终止培养,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测VEGF-A、sFlt-1及KDR的mRNA及蛋白表达.结果 光损伤组VEGF-A mRNA及蛋白表达在光损伤后6h时明显增加,12h时达到高峰,明显高于对照组(t=2.74,2.93;P＜0.05),随后降低.sFlt-1的mRNA及蛋白表达在光损伤后12h达到高峰,明显高于对照组(t=4.32,P＜0.01);24 h时明显低于对照组(t=2.41,P＜0.05).KDR的mRNA及蛋白表达在光损伤后6、12 h时较对照组无明显变化(t=1.84,P＞0.05),24 h时高于对照组(t=2.89,P＜0.05).结论 光损伤后6、12h时,RPE细胞VEGF-A及sFlt-1的表达明显增高,KDR的表达相对稳定.光损伤后24 h时,RPE细胞VEGF-A及sFlt-1的表达降低,KDR的表达增高.     

蓝光诱导体外培养的人视网膜色素上皮细胞凋亡

目的 观察蓝光光照对体外培养的人视网膜色素上皮（RPE）细胞凋亡的影响。 方法 用蓝光照射体外培养的人RPE细胞，分为3组，A组：不同光照强度；B组：同一光照强度，不同光照时间；C组：同一光照强度和光照时间，不同细胞培养终止时间。利用末端脱氧核酸转移酶介导的原位缺口末端标记（TUNEL）、荧光素标记的连接素V/碘化吡啶（Annexin V-FITC/PI）双染流式细胞检测、透射电子显微镜等手段观察细胞凋亡。 结果 TUNEL染色阳性细胞的体积缩小变圆，细胞核浓缩，边聚成新月形或帽状，细胞核碎裂成数个，细胞膜出胞。透射电子显微镜观察发现细胞内线粒体肿胀，线粒体内膜嵴消失；粗面内质网扩张；溶酶体增加，内含代谢产物。A组低于一定阈值［（500±100）lx］的蓝光光照对RPE细胞损伤较轻，细胞凋亡及坏死随光照强度的增强而增加；B组随着光照时间延长，RPE细胞凋亡数量没有增加，而细胞坏死逐渐增加；C组光照后6、12h，损伤以细胞凋亡为主，但随着光照时间延长，凋亡继发坏死细胞和坏死细胞明显增加。 结论 蓝光照射可引起体外培养的人RPE细胞损伤，损伤形式有凋亡、凋亡继发坏死及坏死；损伤程度呈光照强度和光照时间依赖性。 (中华眼底病杂志, 2005, 21: 384-387)     

蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞钙离子蛋白激酶C信号通路的影响

 目的 观察蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞钙离子（Ca2+）蛋白激酶C（PKC）信号通路的影响。方法 体外培养并鉴定人视网膜色素上皮（RPE）细胞,取第4代人RPE细胞随机分组进行实验。采用蛋白免疫印迹法测定培养细胞PKC蛋白表达,检测佛波酯（PMA）和钙磷酸结合蛋白（calphostin C）对PKC活性的影响,确定PMA与calphostin C影响PKC活性的最适宜浓度。采用非放射性核素法测定蓝光照射处理对培养细胞PKC活性的影响。采用20 W,波长450～500 nm医用蓝光灯作为光源,光照强度（2000±500） Lux,照射6 h,24 h后终止培养,以此制造体外培养人RPE细胞光损伤。将培养细胞随机分成5个组,即无光照、单纯光照、光照联合硝苯地平、光照联合calphostin C、光照联合PMA组。其中,无光照组不接受光照;单纯光照组仅接受光照;光照联合硝苯地平组接受光照和0.1 mmol/L的硝苯地平;光照联合calphostin C组接受光照和100.0 nmol/L的calphostin C;光照联合PMA组接受光照和100.0 nmol/L的PMA。用乙酰氧基甲基酯Ca²⁺荧光探针标记各组培养细胞,激光扫描共焦显微镜测定各组细胞内Ca2+浓度。比较各组细胞内Ca2+浓度差异。结果 经鉴定,体外培养人RPE细胞成功。100.0、200.0 nmol/L PMA处理的RPE细胞中PKC蛋白相对表达量高于0.1、1.0、10.0、50.0 nmol/L PMA处理的RPE细胞,差异有统计学意义（F=217.537,P＜0.05）,但100.0、200.0 nmol/L PMA处理组间PKC蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（P=0.072）。100.0、200.0 nmol/L calphostin C处理的RPE细胞中PKC蛋白相对表达量低于5.0、25.0、50.0、75.0 nmol/L calphostin C处理的RPE细胞,差异有统计学意义（F=164.543,P＜0.05）,但100.0、200.0 nmol/L calphostin C处理组间PKC蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义（P=0.385）。蓝光照射处理后,RPE细胞的PKC活性显著升高,与未接受蓝光照射处理的RPE细胞的PKC活性比较,差异有统计学意义（t=-9.869,P＜0.05）。单纯光照、光照联合硝苯地平、光照联合Calphostin C、光照联合PMA组的RPE细胞内Ca²⁺浓度均高于无光照组,差异有统计学意义（F=26 764.92,P＜0.05）;光照联合PMA组RPE细胞内Ca²⁺浓度高于单纯光照、光照联合硝苯地平及光照联合calphostin C组（P＜0.05）,单纯光照组高于光照联合硝苯地平和光照联合calphostin C组（P＜0.05）。结论 蓝光照射后人RPE细胞内PKC活性增高,Ca²⁺浓度增高。硝苯地平和calphostin C均能降低蓝光照射后人RPE细胞内Ca²⁺浓度,PMA增加细胞内Ca²⁺浓度。     

光诱导对人视网膜色素上皮细胞自噬和凋亡的影响

研究人视网膜色素上皮（RPE）细胞光损伤中自噬与凋亡之间的关系,并探讨自噬抑制剂3甲 基腺嘌呤（3MA）对光诱导下RPE细胞自噬和凋亡的影响。方法：实验研究。将体外培养的人RPE细 胞（ARPE-19）随机分为12 h对照组、12 h模型组、12 h 3MA组以及24 h对照组、24 h模型组、24 h 3MA组。对照组采用锡纸包裹避光培养;模型组接受光照刺激;3MA组中加入3 mmol/ml 3MA后接 受光照刺激,以自制三基色LED（发光二极管）冷光灯作为光源,在（16 500±500）lx光照强度下照 射细胞12 h和24 h。透射电子显微镜观察每组细胞超微结构,流式细胞仪测定细胞存活率,激光共 聚焦结合倒置荧光显微镜定性、定量分析自噬-溶酶体形态及荧光强度,Western blot法检测Beclin 1、 LC3和P62自噬相关蛋白表达量。数据采用单因素方差分析。结果：在光照12 h后,ARPE-19细胞自 噬水平可以抵抗光损伤,降低细胞凋亡率（F=931.53,P<0.001）;光照24 h后细胞自噬水平超过其正 常调节范围,细胞凋亡率升高,差异有统计学意义（F=1156.67,P<0.001）;使用3MA可抑制光诱导 的ARPE-19细胞过度自噬,降低细胞凋亡率（F=2.856,P=0.027）,进而保护细胞以应对光损伤。结论： ARPE-19自噬水平随光照时间而变化;随着光照时间延长,细胞凋亡率升高。抑制细胞的过度自噬 可以保护ARPE-19细胞应对光损伤。     

内质网应激对光照诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的促进作用

背景 视网膜色素上皮(RPE)细胞的光损伤模型是多种视网膜变性类疾病的研究工具,光诱导RPE细胞损伤的主要病理基础是凋亡及炎症反应,但是内质网应激(ERS)反应是否参与其病理机制的研究国内外少有报道. 目的 探讨ERS对光损伤诱导的人RPE细胞凋亡的作用及其机制.方法 体外培养人RPE细胞株(ARPE-19),将培养的细胞分为正常对照组及光照3、6、12和24 h组,各光照组在培养箱内以(2 000± 500) lx的白色荧光灯光照细胞建立光损伤模型,正常对照组细胞在暗环境中培养且不给予光照射,筛选实验最适光照时间.将细胞分为正常对照组、光照组(光照12h)和苯基丁酸(4-PBA)预处理+光照组,4-PBA预处理+光照组先用ERS抑制剂4-PBA培养细胞30 min,然后光照细胞12h.采用流式细胞仪检测各组人RPE细胞的凋亡率和细胞内活性氧(ROS)的荧光强度;采用ELISA法检测各组细胞上清液中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)质量浓度;分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测人RPE细胞中ERS标志物活化转录因子-6(ATF-6)、C/增强结合蛋白同源蛋白(CHOP)和细胞凋亡标志物半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(caspase-12) mRNA及其蛋白的表达. 结果 光照后细胞形态呈长梭形改变,边界不清,细胞质脱颗粒,细胞碎片增多,且随光照时间的延长而加重.流式细胞仪检测发现,随光照时间的延长,人RPE细胞内ROS含量逐渐增加,细胞凋亡率逐渐升高,差异均有统计学意义(F=763.00、119.30,均P＜0.01).ELISA法检测发现,与正常对照组比较,光照后6h细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显升高,12h达峰.实时荧光定量PCR和Western blot检测显示,与正常对照组比较,光照后人RPE细胞中ATF-6、CHOP和caspase-12 mRNA及其蛋白的相对表达量均明显升高,均于光照后12h达峰或升高,故选择光照12 h为最适光照时间作为后续研究.4-PBA预处理+光照组细胞中ATF-6、CHOP和caspase-12 mRNA的相对表达量均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=281.69、473.88、308.45,均P＜0.01);ATF-6、CHOP和caspase-12蛋白的相对表达量均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=47.86、57.93、106.59,均P＜0.01);细胞凋亡率、细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=88.64、245.47、101.01,均P＜0.01). 结论 (2 000±500)lx的光照可诱导人RPE细胞内ROS增加,并激活细胞的ERS反应,导致RPE细胞凋亡及炎症反应.ERS抑制剂4-PBA可抑制光损伤导致的ERS反应,进而降低RPE细胞凋亡率并抑制炎症反应过程.     

巨噬细胞条件培养液及重组人IL-1β对RPE细胞产生MMP-2及MMP-9的影响

目的 观察巨噬细胞条件培养液（MφM）及白细胞介素-1β（IL-1β）对视网膜色素上皮（RPE）细胞分泌基质金属蛋白酶（MMP）-2及MMP-9的影响,探讨巨噬细胞与RPE细胞之间的相互关系.方法 在人RPE细胞培养液中加入50%体积分数的人MφM作用48 h;加入终质量浓度为10、50、100、200 ng/ml重组人IL-1β作用12、24、48 h.用酶谱法检测RPE细胞培养液中MMP-2及MMP-9,凝胶图像扫描分析仪定量.结果 MφCM促RPE细胞分泌MMP-2和MMP-9,促MMP-9分泌尤其明显;48 h内IL-1β促RPE细胞分泌MMP-2和MMP-9具有时间和质量浓度依赖性.结论 MφCM中含有促RPE细胞分泌MMP-2和MMP-9的因子,IL-1β是巨噬细胞产生的主要炎性因子,提示巨噬细胞可能通过分泌细胞因子调节RPE细胞分泌MMP-2和MMP-9,参与细胞增生、迁移等病理过程.     

可见光照对培养的人视网膜色素上皮细胞凋亡的影响

目的 研究可见光照对培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞凋亡的影响。 方法 以白色荧光灯为光源，用500 lx、(2000±500) lx及(3400±200) lx不同光照强度,按不同的光照时间(无光照、6、12、24 h)照射培养的人RPE细胞。利用终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labelling, TUNEL)、荧光素标记的连接素V/碘化丙锭(Annexin V-fluorescein isothiocyanate/Propidium iodium，Annexin V-FITC/PI)双染色流式细胞测定、相差倒置显微镜等手段观察RPE细胞凋亡(分为光照后6、12、24、36 h组)。 结果 可观察到RPE细胞出现两种死亡形式，凋亡与坏死。(1)低于一定阈值(500 lx)的光照对细胞损伤较轻，细胞凋亡及坏死随光照强度的增加而增加。(2)在较短的光照时间(6 h和12 h)内，细胞死亡的增加以凋亡为主；随着光照时间的延长，细胞坏死逐渐明显。(3)随着光照后培养时间的延长，细胞凋亡明显增加(P＜0.05)。光照后6、12、24 h的损伤改变以凋亡为主，但随时间的延长，凋亡继发性坏死的增加显著。光照后36 h，细胞的坏死数显著增高(P＜0.01)。 结论 可见光超过一定照度(500 lx)可导致培养的人RPE细胞凋亡及坏死的显著增加，其损伤程度为光照强度及时间依赖性。较低光照强度及较短光照时间主要诱导细胞凋亡，反之则导致细胞坏死。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 227-230)     

蓝光诱导大鼠视网膜色素上皮细胞复制衰老

目的 探讨蓝光光照强度、时间与大鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞复制衰老的关系.方法 将36只鼠龄12～14周的Wistar大鼠置于悬有波长为(450±10)nm的医用蓝光灯管的自制光照架中.随机分为4组,每组9只大鼠,1组:无光照对照组;2组:自然光照组;3组:500 lx光照组;4组:1000 lx光照组.每组按照照射时间再分为1、2、3个月组3个亚组,分别在1、2、3个月时行10%水合氯醛腹腔注射麻醉后取出眼球,将右眼球行石蜡切片,苏木精伊红(HE)染色;左眼球行冰冻切片,采用衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色方法观察RPE细胞染色阳性情况.采用SPSS 11.5统计软件对结果数据进行统计学分析.结果 不同光照强度组、不同光照时间组大鼠RPE细胞SA-β-Gal染色阳性细胞个数差异有统计学意义(F=510.309,55.016;P=0.000);组间两两比较,除1组与2组之间差异无统计学意义外(P=0.154),其它各组之间差异均有统计学意义(P=0.000).在单一光照强度条件下,除1组大鼠RPE细胞SA-β-Gal染色阳性细胞个数差异无统计学意义外(P=0.897),其余各组差异均有统计学意义(P＜0.01);在单一时间条件下,各组差异均有统计学意义(P=0.000).结论 同一蓝光光照强度下,随着时间的增加大鼠视网膜RPE细胞逐渐出现复制衰老改变;同一时间条件下,随光照强度增加大鼠视网膜RPE细胞也逐渐出现复制衰老改变.     

老龄多巴色素异构酶敲除小鼠视网膜色素上皮细胞中黑色素在视网膜光损伤过程中的作用

目的 观察视网膜色素上皮(RPE)细胞中黑色素含量与光感受器细胞功能之间的关系,探讨黑色素对视网膜光损伤的作用.方法 老龄多巴色素异构酶敲除小鼠(Dct-/-小鼠)和C57BL/6小鼠(野生型小鼠)各20只,分别为Det-/-/小鼠组和野生型小鼠组.采用临床电生理国际标准分别对各型鼠进行视网膜电图(ERG)检查,记录其最大混合反应后各组随机处死2只小鼠,摘除眼球作为阴性对照.余下每组各18只小鼠,将6只小鼠用20 W冷荧光灯行12 h明、12 h暗、12 h明的间断光照36 h,连续3个循环.光照强度为(5000±356)lx.光照结束后第6天再次进行ERG检查,记录ERG结果.随机颈椎脱臼法处死每组各2只小鼠,摘除眼球.所有摘除眼球常规组织切片,光学显微镜、电子显微镜观察.结果 ERG检查结果显示,光损伤前后Dct-/-小鼠a、b波振幅明显低于野生型小鼠(t_(a波光照前)=-7.13,P＜0.01;t_(b波光照前)=-4.414,P＜0.01;t_(a波光照后)=-10.162,P＜0.01;t_(b波光照后)=-6.772,P＜0.01);光损伤后Dct-/-小鼠ERGa、b波的振幅下降幅度明显高于野生型小鼠(t_(a波)=4.975,P＜0.01;t_(b波)=2.908,P＜0.01).光损伤后,光学显微镜检查可见Dct-/-小鼠视网膜水肿、变薄,较野生型明显;电子显微镜检查可见RPE细胞中黑色素颗粒融解、断裂或丢失,光感受器细胞外节盘膜肿胀、碎裂及空泡变,Dct-/-小鼠损伤较野生型小鼠严重.结论 光损伤后RPE细胞黑色素含量减少,光感受器细胞功能下降,提示黑色素对光损伤可能有保护作用.     

蓝光致人视网膜色素上皮细胞凋亡与线粒体膜电位和细胞色素C的关系

目的探讨蓝光光照对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡及对线粒体膜通透性转运功能的影响。方法用蓝光光照体外培养的人RPE细胞。实验分为三部分。第一部分:不同光照度,分为3组,第1组光照度(500±100)lx,第2组光照度(2000±500)lx,第3组光照度(3000±500)lx;光照RPE细胞时间6h,光照结束后24h终止培养。第二部分:同一光照度、不同光照时间,检测RPE细胞亚型时分为3组,第1组光照时间6h,第2组光照时间12h,第3组光照时间24h,光照度均为(2000±500)lx;检测线粒体膜电位时也分为3组,第1组光照时间3h,第2组光照时间6h,第3组光照时间12h,光照度均为(2000±500)lx。第三部分:同一光照度和光照时间,光照度(2000±500)lx,光照RPE细胞时间6h;不同细胞培养终止时间分为4组,第1组终止细胞培养时间为光照后6h,第2组为光照后12h,第3组为光照后24h,第4组为光照后36h。利用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)染色、荧光素标记的AnnexinV-FITC和PI双染流式细胞检测、透射电镜等手段观察RPE细胞凋亡情况。罗丹明123荧光染料孵育人RPE细胞,流式细胞仪检测线粒体膜电位,酶联免疫法测定细胞色素C活性,比色测定法测定Caspase-3的活性。结果第二部分第1组TUNEL染色阳性细胞的体积缩小变圆,胞核浓缩,边聚成新月形或帽状,细胞核碎裂成数个,细胞膜出胞。透射电镜观察发现细胞内线粒体肿胀,线粒体内膜嵴消失,粗面内质网扩张,溶酶体增加。第一部分(500±100)lx光照未引起明显的RPE细胞损伤,但线粒体膜电位明显下降;随着光照度增加,RPE细胞出现凋亡、凋亡继发性坏死及坏死,同时线粒体膜电位逐渐下降。第二部分光照6和12h,凋亡细胞百分比增加,荧光强度明显下降;光照24h凋亡继发性坏死细胞、坏死细胞百分比增加。第三部分光照后6和12h,RPE细胞凋亡百分比逐渐增加;光照后24、36h凋亡继发性坏死细胞和坏死细胞百分比明显增加,光照后各时间点RPE细胞荧光强度明显下降。以光照度(2000±500)lx照射6和12h,可见光照后24和36h两组的细胞色素C浓度明显升高,未检测到Caspase-3活性变化。结论蓝光照射可导致体外培养的人RPE细胞凋亡、凋亡继发性坏死及坏死,其损伤程度与光照度和时间相关;蓝光照射导致培养的人RPE细胞损伤过程与线粒体膜电位降低、细胞色素C释放有关;线粒体膜电位可作为检测蓝光致人RPE细胞凋亡的早期指标。     

瘦素对胰岛素抵抗状态下人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的影响

目的 观察瘦素对胰岛素抵抗状态下人视网膜色素上皮（RPE）细胞氧化损伤的影响。方法 体外培养的人RPE细胞随机分为正常对照组和胰岛素抵抗组。分别加入 0、10、100 ng/ml瘦素干预24、48、72 h。2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法检测细胞内活性氧（ROS）的产生情况;免疫细胞化学法检测细胞内8-羟基-2′-脱氧鸟嘌呤（8-OHdG）的表达量;蛋白质免疫印迹法检测细胞浆中8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1（hOGGl）的表达量。结果 干预后24、48、72 h,正常对照组、胰岛素抵抗组RPE细胞ROS（正常对照组：F=37.136、37.178、49.634;胰岛素抵抗组：F=9.822、28.881、71.150）、8-OHdG表达量（正常对照组：F=88.643、390.920、1039.276;胰岛素抵抗组：F=273.311、299.155、82.237）均随瘦素浓度增加而增加,hOGGl的表达量（正常对照组：F=470.062、1073.113、295.456;胰岛素抵抗组：F=240.032、592.389、527.760）随瘦素浓度的增加而递增,差异均有统计学意义（P＜0.05）。正常对照组、胰岛素抵抗组在相同浓度瘦素干预下,随干预时间延长,胰岛素抵抗组RPE细胞8-OHdG表达量呈现高于正常对照组的趋势。干预后24 h,胰岛素抵抗组RPE细胞hOGGl表达量与正常对照组比较,差异无统计学意义（F=23.392,P＞0.05）;干预后72 h,胰岛素抵抗组PRE细胞hOGGl表达量低于正常对照组,差异有统计学意义（F=129.394,P＜0.05）。在相同浓度瘦素干预下,随干预时间延长,RPE细胞hOGG1表达量呈现先升高后降低的趋势。干预后48 h,正常对照组（F=83.673、268.000、373.492）、胰岛素抵抗组（F=49.021、304.293、294.293）RPE细胞hOGGl表达量均高于干预后24、72 h RPE细胞hOGGl表达量,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 正常状态及胰岛素抵抗状态下瘦素能引起人RPE细胞氧化损伤,随着瘦素浓度的增加、作用时间的延长氧化损伤的程度呈加重趋势;氧化损伤的修复随着时间的延长呈先强后弱的趋势,随着瘦素浓度的增加而呈增强的趋势。     

可见光对视网膜色素上皮细胞氧化损伤的影响

目的 观察可见光对体外培养视网膜色素上皮(RPE)细胞内活性氧(ROS)、8-羟基-2＇-脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)和8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(hOGG1)表达的影响。方法 人RPE-19细胞按1∶4至1∶6传代培养。取第4～6代80％融合细胞用于实验。细胞分为白光、红光、蓝光照射组和对照组,细胞平面光照强度为600 Lux。白光、红光分别照射6、12、24、48 h;蓝光照射1、3、6、12 h;对照组以锡纸包裹避光培养。2＇,7＇-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法检测细胞内ROS表达量,免疫细胞化学(ICG)法检测细胞内8-OHdG表达量,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞内hOGG1表达情况。结果 DCFH-DA法检测结果显示,白光、红光照射组分别照射12、24、48 h,蓝光照射组照射1、3、6、12 h,细胞内ROS表达量均升高且随时间延长而增加,与对照组细胞内ROS表达量比较,差异均有统计学意义（F白光=11.611,F红光=6.706,F蓝光=23.259;P＜0.05）。ICG法检测结果显示,白光、红光照射组分别照射12、24、48 h,细胞胞浆8-OHdG表达量增高,照射后12、24 h表达量随时间延长而增加,48 h有所降低,与对照组细胞胞浆8-OHdG表达量比较,差异均有统计学意义（F白光 =16.032,F红光=6.378;P＜0.05）;蓝光照射组照射后1、3、6、12 h,细胞胞浆8-OHdG表达量均增高,照射后6、12h细胞胞浆8-OHdG表达量较1、3h细胞胞浆8-OHdG表达量有所降低,但与对照组细胞胞浆8-OHdG表达量比较,差异均有统计学意义(F蓝光=19.484,P＜0.01)。Western blot检测结果显示,白光、红光照射组照射12、24、48 h,蓝光照射组照射6、12h,细胞内hOGG1表达量均增高,与对照组细胞内hOGG1表达量比较,差异均有统计学意义(F白光=15.121,F红光=21.041;F蓝光=12.479,P＜0.05)。结论 白光、红光、蓝光能以时间依赖性方式诱导RPE细胞ROS生成增加并导致RPE细胞DNA氧化损伤。RPE细胞在可见光作用下能增加DNA糖基化酶hOGG1的表达量以对DNA氧化损伤进行修复。     

贝伐单抗对视网膜色素上皮细胞抗氧化功能的影响

目的 观察贝伐单抗对人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞抗氧化功能的影响,以探讨抗新生血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)制剂治疗年龄相关性黄斑变性后黄斑部萎缩的可能机制.方法 用含终浓度0.25g·L-1贝伐单抗的DMED/F12培养液培养人RPE细胞系ARPE-19细胞,根据处理时间的不同分为Oh组(对照组)、12 h组、24 h组、48 h组、72 h组共5组,加入H2O2诱导氧化应激反应.用CCK-8法检测细胞活性,MitoSox Red荧光染色检测细胞内线粒体活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生水平,JC-1荧光染色检测细胞线粒体膜电位的变化;分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫蛋白印迹法(Western blot)检测各组促氧化因子NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,NOX4)和抗氧化因子血红素氧合酶-1(heme oxygenase 1,HO-1) mRNA和蛋白的表达水平.结果 CCK-8检测结果显示:上述处理对细胞活性无显著影响,Oh组、12 h组、24h组、48h组和72 h组细胞活性分别为(100.2±3.3)％、(99.2±2.7)％、(102.5±6.4)％、(103.9±3.7)％和(103.6±3.3)％,差异无统计学意义(P＞0.05);与对照组相比,12 h、24h、48 h、72 h组细胞内ROS水平上升,差异有统计学意义(P＜0.05);线粒体膜电位在12 h、24h、48 h、72 h组均较对照组降低,差异有统计学意义(P＜0.01),48 h达最低,72 h时显著提高,但仍低于对照组.RT-PCR和Western blot检测结果显示:与对照组比较,NOX4 mRNA和蛋白的表达在12 h、24h、48 h和72 h组均上升,而且在24h表达最高,之后明显下降,但仍高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).与对照组比较,HO-1 mRNA的表达在24h、48 h和72 h组均下降,而HO-1蛋白的表达在48 h和72 h组下降,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 临床浓度的贝伐单抗可以降低RPE的抗氧化功能,可能是长期抗VEGF治疗后黄斑部进行性萎缩的原因之一.