荧光PCR直接检测食物中毒样品中A(B)型肉毒梭菌

目的建立食物中毒样品中肉毒毒素基因的荧光PCR快速检测方法。方法对食物中毒臭豆腐样品进行前处理,直接从样品中提取基因组总DNA,对毒素基因保守区域设计特异性引物和探针,分别进行肉毒梭菌、A型、B型、E型和F型肉毒毒素基因的荧光PCR检测,FAM通道采集扩增荧光信号。结果食物中毒臭豆腐样品经过去蛋白和脂肪等前处理后,可直接提取获得食物基因组总DNA,以总DNA为模板同时进行肉毒梭菌及毒素基因的荧光PCR检测,检出含有A型、B型毒素基因,只有A型毒素基因表达的A(B)型肉毒梭菌。结论荧光PCR方法可快速检测食物中毒样品中的肉毒梭菌和毒素基因,对肉毒梭菌污染食品引起的食物中毒诊断具有参考价值。     

多重PCR检测毒力型艰难梭菌的方法学研究及应用

目的建立多重PCR方法检测毒力型艰难梭菌。方法设计艰难梭菌种特异tpi引物和毒力基因tcdA、tcdB特异性引物,建立多重PCR方法。利用已知菌株,验证方法的特异性和最低检出限。与厌氧培养法、ELISA法比较其检测临床菌株和其毒素分泌的准确性。结果多重PCR方法检测艰难梭菌的最低检出浓度为0.7 pg/μ1,特异性为100%。53株厌氧培养法鉴定的艰难梭菌临床分离株,多重PCR方法检测tpi基因均为阳性,其中tcdA+/tcdB+为39株,tcdA-/tcdB-为14株。ELISA法检测毒素A/B显示23株为阳性、30株为阴性。23株ELISA法毒素A/B阳性的艰难梭菌多重PCR方法检测结果均为tcdA+/tcdB+。结论多重PCR方法可用于检测毒力型艰难梭菌具有较高的临床应用价值。     

多重聚合酶链反应方法检测艰难梭菌毒素基因研究

目的探讨同时检测艰难梭菌毒素A、B基因和二元毒素基因的多重聚合酶链反应(PCR)方法。方法收集2014年1-9月医院120例住院腹泻患者的粪便标本,用艰难梭菌选择性培养基CCFA分离培养艰难梭菌;采用法国生物梅里埃公司厌氧菌鉴定试剂盒鉴定;采用酶免夹心与终点荧光检测相结合技术(ELFA),检测艰难梭菌毒素A、B基因,并分析其毒素特征;将艰难梭菌纯培养出的菌落用多重PCR方法测定艰难梭菌的毒素A、B基因和二元毒素基因。结果 120例腹泻患者送检粪便标本中,分离培养出19株艰难梭菌,艰难梭菌分离率达15.8%;应用免疫学方法检测毒素检出率为52.63%;用多重PCR方法艰难梭菌A、B毒素基因检出率为94.7%;15例患者送检粪便标本检测艰难梭菌A、B毒素阳性中,10株分离培养并鉴定出艰难梭菌;105例患者送检粪便标本检测艰难梭菌A、B毒素阴性中,有9例分离培养并鉴定出艰难梭菌。结论利用多重PCR检测艰难梭菌毒素A、B基因和二元毒素基因,较传统的免疫学方法敏感性高,能够准确地区分艰难梭菌毒素基因的类型,多重PCR是一种快速、特异的一步筛选艰难梭菌毒素基因的方法。     

实时荧光PCR快速检测粪便中艰难梭菌方法

目的:建立实时荧光PCR快速检测艰难梭菌的方法。方法:以艰难梭菌磷酸丙糖异构酶(tpi)基因的保守序列为模板设计和合成特异性引物和荧光标记探针,建立实时荧光PCR检测体系,通过检测含有艰难梭菌标准菌株浓度为106-10 CFU/ml的细菌培养物及加标模拟样本进行敏感性分析,并对其特异性和干扰性进行评价。结果:该方法只对艰难梭菌进行特异性扩增,其他常见的病原菌均不能扩增;整个检测过程只需要2 h,对艰难梭菌菌悬液可检测至10 CFU/ml细菌,对加标粪便样本可检测至1000 CFU/ml细菌。结论:本研究建立的实时荧光PCR检测艰难梭菌方法具有快速、特异、敏感性高等优点,能实现对艰难梭菌的快速检测。     

使用Real-Time PCR粪便中检测艰难梭状芽孢杆菌

目的：探讨Real-TimePCR对粪便检测艰难梭菌的可行性。方法：以组织培养细胞毒素试验为标准，参考艰难梭菌的毒素A／B基因相应的引物和分子信标探针，对标准菌株和粪便提取的DNA实行Real-TimePCR扩增。结果：Real-TimePCR的敏感度为96．9％；特异性为100％；阳性预测值为100％；阴性预测值为98．3％。结论：Real—TimePCR与传统诊断方法相比具有快速、敏感、特异等优点，可以提高艰难梭菌的检测水平。     

艰难梭菌在高风险科室医院感染流行趋势研究

目的探讨高风险科室住院患者中艰难梭菌感染或定植流行趋势,为艰难梭菌有效预防与控制措施的提出提供理论依据。方法收集2014年9月医院感染高风险科室住院的128例患者肛拭子标本,经厌氧培养,通过VIDAS荧光酶联免疫技术进行艰难梭菌毒素A/B检测,利用多重PCR技术进行艰难梭菌毒素基因检测,并对艰难梭菌阳性患者的临床病理特征进行分析。结果 128例患者中艰难梭菌培养阳性22例,阳性率17.19%;22株艰难梭菌中有21株为A/B毒素表型呈阳性,占95.45%,1株未检出A/B毒素;22例艰难梭菌培养阳性患者均为无症状携带者,其中90.91%的患者近期使用过抗菌药物。结论医院感染高风险科室的产毒艰难梭菌检出率较高,应注重该类患者的艰难梭菌监测和有效预防控制措施的落实。     

艰难梭菌培养联合酶法检测毒素蛋白(A/B)的临床应用价值探索

目的通过对艰难梭菌培养及毒素检测方法比较,建立艰难梭菌培养联合酶法检测毒素蛋白(A/B)的检测流程,评估其临床应用。方法收集2015年-2017年住院腹泻患者粪便标本852份,采用显色培养法(ChromID~(TM))培养艰难梭菌,阳性菌株用酶联免疫荧光法检测其毒素蛋白A/B(Clostridium difficile toxins A and B,CDAB);用酶联免疫荧光法检测毒素蛋白A/B及阳性菌株,用PCR方法检测其tcdA和(或)tcdB基因进行比较,运用检出率、灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值进行效能评价。结果 852例粪便标本经显色培养共分离菌108株,粪便直接酶法A/B毒素蛋白检出率为5.99%(51/852);阳性菌株联合酶法检测A/B毒素蛋白检出率为10.92%(93/852);108株阳性菌株联合PCR方法93株表达tcdA~+tcdB~+;6株表达tcdA~-tcdB~+;9株未表达,为tcdA~-tcdB~-;阳性菌株用酶法检测毒素蛋白A/B结果93株阳性,15株阴性,且93株阳性经PCR检测基因均表达tcdA~+tcdB~+;以PCR检测艰难梭菌毒素基因作为参考方法,培养阳性菌株联合酶法、粪便直接酶法检测毒素蛋白A/B的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为93.94%、100%、100%、60%和51.52%、100%、100%、15.79%;一致性检验Kappa值分别为0.721和0.150。结论显色培养后阳性菌株联合酶法检测艰难梭菌毒素蛋白A/B可以提高艰难梭菌检出率,与PCR毒素基因检测有较好一致性,操作简单,具有较好的临床应用价值。     

A型肉毒梭菌atx基因TaqMan探针荧光定量PCR检测

目的采用TaqMan探针荧光定量PCR方法对A型肉毒梭菌atx基因进行检测。方法以atx基因为靶基因,设计引物和TaqMan探针,优化反应条件,制作定量标准曲线,进行灵敏度、特异性和重复性验证,建立A型肉毒梭菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果构建质粒pUC57-△atx,标准曲线在103～107拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.997,灵敏度达到22个拷贝数,比普通PCR提高约100倍;能选择性检测A型肉毒梭菌,与其他5种食源性病原菌无交叉反应,结果与普通PCR一致;重复性试验表明,同一浓度的15个平行样品的变异系数为1.0%。结论 A型肉毒梭菌TaqMan探针荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可以快速、准确、定量地检测A型肉毒梭菌。     

艰难梭菌分离培养与病原学分子特征研究

目的：建立艰难梭菌分离培养与鉴定的表型诊断技术,并对分离获得的艰难梭菌进行分子学特征研究。方法采集杭州某医院ICU住院患者肛拭标本,接种厌氧血琼脂平皿,置厌氧培养箱,可疑菌株采用厌氧菌鉴定试剂条鉴定;用VIDAS荧光酶联免疫技术检测A/B毒素;用PCR技术检测艰难梭菌毒素基因和核糖体分型。结果28例 ICU 患者检出艰难梭菌9株,检出率为32.14%。9株艰难梭菌中, A/B 毒素表型阳性7株（77.78%）,毒素基因检测均阳性。9株艰难梭菌可分为3种核糖型,其中R3型为优势株,占77.78%。结论杭州市ICU患者检出艰难梭菌的比例较高,均携带A/B毒素基因,且存在优势型别。     

不同产毒类型艰难梭菌耐药性特征分析

目的通过研究临床艰难梭菌菌株的临床特征和耐药性,为临床防治艰难梭菌提供理论依据。方法收集2015年全年分离自临床的艰难梭菌,采用PCR技术检测其毒素基因,采用琼脂稀释法检测其耐药性,对患者的临床资料进行分析。结果共收集临床送检粪便标本144份,分离培养出艰难梭菌33株,艰难梭菌阳性检出率为22.92%;科室分布以神经外科、神经内科和消化科为主;分离所得到的艰难梭菌体外实验均对万古霉素、甲硝唑和替加环素敏感,对红霉素和亚胺培南耐药检出株数最多,其次为克林霉素;33株艰难梭菌毒素基因检测结果 A+B+菌株24株,A-B+菌株1株;未检测到二元毒素基因cdtA和cdtB;产毒菌(25株)和非产毒菌(8株),两组菌株均对万古霉素、甲硝唑和替加环素敏感;非产毒艰难梭菌和产毒菌株对抗菌药物红霉素、亚胺培南、克林霉素、利福平和左氧氟沙星的耐药率比较,虽差异无统计学意义,但均高于产毒菌株;患者感染艰难梭菌后,均出现不同程度的腹泻,使患者病情加重,住院时间延长,并出现2例死亡病例。结论非产毒菌株对多种抗菌药物耐药率均高于产毒菌株,并出现对万古霉素敏感性降低的菌株,提示本地区艰难梭菌耐药性可能增加,甚至可能出现耐万古霉素的艰难梭菌。     

中美艰难梭菌A-B+株毒力编码区域转录及B毒素表达的研究

目的研究中国艰难梭菌A-B+型分离株BJ08和美国艰难梭菌A-B+型暴发流行株US1的毒力编码区域PaLoc各基因转录及B毒素的表达,为预防和控制中国可能暴发的艰难梭菌感染提供理论支持。方法每隔3 h提取BJ08与US1艰难梭菌和培养上清,用荧光定量聚合酶链反应（PCR）法测定各时间段两菌株毒力编码区域PaLoc各基因（tcdA、tcdB、tcdC、tcdR、tcdE）的表达;用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测BJ08和US1各时间段的细胞和培养液上清中B毒素的含量。结果US1的生长速率稍快于BJ08,衰退速率显著快于BJ08（P＜0.05）;它们都不表达A毒素,但是都检测到tcdA基因的转录,而且tcdA转录没有明显差异。BJ08的tcdB、tcdC和tcdE基因的转录要比US1早3 h。B毒素在两种菌株的胞内和胞外合成或分泌没有明显差异。结论中国艰难梭菌A-B+型高分离株BJ08与美国艰难梭菌A-B+型暴发流行株US1相比,有相似的毒力表达或更强的基因调控能力,要警惕中国艰难梭菌BJ08暴发流行的可能。     

中国部分地区艰难梭菌PCR 核糖体分型及毒素基因多态性研究

目的了解中国部分地区艰难梭菌聚合酶链反应（PCR） 核糖体型别分布及其A、B毒素基因多态性,为建立适宜中国的艰难梭菌分子检测和分子分型技术提供基础数据,同时在基因水平上为艰难梭菌感染导致的复杂临床表现提供依据。方法对中国3个城市（北京、广州、济南）分离的64株艰难梭菌临床株进行PCR 核糖体分型,并对不同型别的26株代表菌株的A、B毒素基因进行扩增测序。结果64株艰难梭菌中,毒素基因型以A+B+型（45株,70.31%）为主,A-B+型19株（29.69%）。共存在9种PCR 核糖体型别,以017型（21株,32.81%）为主要型别,其次为001型（13株,20.31%）、012型（11株,17.19%）。A-B+菌株中,14株(73.68%)是017型,1株是001型。A、B毒素基因呈现一定的多态性,其中有7种A毒素序列型别（TSTA）,6种B毒素序列型别(TSTB),8种A、B毒素序列型别组合（TSTG）。结论我国部分地区的艰难梭菌可能以PCR 核糖体017型为主,A、B毒素基因在菌株间存在多态性,且核糖体型别与毒素基因多态性间存在相对应的关联。应进一步扩大菌株数量和范围,探寻适合我国的分子检测和分子分型方法,从而帮助医院更好地预防和控制艰难梭菌感染。     

护理举措在预防医院内获得艰难梭菌相关腹泻的作用

目的探讨护理举措在预防医院内获得艰难梭菌相关腹泻中的作用。方法选取2011年6月1日～2012年12月31日期间在我院住院的268例住院后使用抗生素超过3天以上出现腹泻且为CDAD危险因素之一的患者。依选取科室分为观察组146例和对照组122例。观察组采用改良的护理措施实施干预,对照组采用传统的护理措施实施干预,统计分析不同护理方法条件下院内艰难梭菌相关腹泻的发病率。结果两组比较,观察组艰难梭菌相关腹泻在医院内的发病率为4.8%,对照组限难梭菌相关腹泻院内发生率为13.9%,观察组明显低于对照组,差异有统计学意义（p〈0.05）。结论有效的护理举措对医院内获得艰难梭菌相关腹泻的预防有重要的作用。     

产气荚膜梭菌实时荧光定量PCR方法的应用

目的利用荧光定量PCR技术,建立快速敏感特异的产气荚膜梭菌检测方法。方法以产气荚膜梭菌基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以产气荚膜梭菌菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比,同时验证方法的灵敏度、特异性、重复性。结果反应体系在上、下游引物浓度均为1μmol/L,探针浓度为0.1μmol/L时,具有良好的特异性和灵敏度,与创伤弧菌等24种相关细菌均无交叉反应,对纯菌检测的灵敏度为9×102CFU/ml,重复性试验证实该体系重复性好,稳定性高;3例临床样本检测结果与细菌培养结果相符。结论建立的实时荧光PCR方法特异、灵敏、快速,能对临床气性坏疽做出快速准确的报告,实现对气性坏疽战时高发性疾病安全、快速和定量检测。     

Rapid detection of toxigenic Clostridium difficile from stool samples by a nested PCR of toxin B gene

Toxigenic Clostridium difficile is the aetiologic agent of most cases of antibiotic-associated diarrhoea and pseudomembranous colitis. The present standard method for C. difficile diagnosis is a cytotoxicity assay, performed on human fibroblast cultures. It is time consuming and requires special facilities. A nested-PCR assay detecting toxin B gene within a few hours was designed. One hundred and two stool samples were collected during four months. All samples were processed for toxin B-PCR, cultured for C. difficile and tested for cytotoxicity. This approach achieved 99% concordance with the cytotoxic assay. The sensitivity and specificity for the new PCR assay were 96.3% and 100% respectively. The procedure described is easy to perform, does not require special equipment and has produced excellent results. It deserves serious consideration for routine clinical microbiology laboratory use.     

The activity of glutaraldehyde against Clostridium difficile

The sporicidal activity of 2% glutaraldehyde against Bacillus subtilis var. globigii and Bacillus stearothermophilus was compared with that against Clostridium difficile. The aerobic species, normally chosen for test purposes, survived for 2 h but Cl. difficile was killed in under 10 min. In view of the impractical and lengthy immersions required to satisfy standard tests using non-pathogenic spores, a less stringent standard would probably be more appropriate.     

变质兔肉罐头检出尸体梭菌产毒株的研究

从超保质期的红烧兔肉头中分离出一株使罐头腐败变质的尸体梭菌产毒株,并在罐头上清液中检出使小鼠致死的毒素。该菌经形态、生理生化特性及其代谢终产物的气相色谱分析结果,确定为尸体梭菌产毒株。     

酪酸梭菌活菌散与抗菌药联用预防小儿肺炎继发性腹泻疗效观察

【目的】 观察和评价酪酸梭菌活菌散与抗菌药联用治疗小儿肺炎预防小儿肺炎继发性腹泻的临床疗效。 【方法】 将305例肺炎患儿随机分为预防Ⅰ组(104例)、预防Ⅱ组(101例)和对照组(100例),三组均给予抗菌药及对症支持治疗。预防组在治疗的同时联用酪酸梭菌活菌散,0.5 g/次,3次/d,出现腹泻继续服用,其中预防Ⅰ组停用抗菌药后继续服用酪酸梭菌活菌散7 d,预防组Ⅱ组停用抗菌药后即停用酪酸梭菌活菌散;对照组不用酪酸梭菌活菌散预防,出现腹泻用酪酸梭菌活菌散治疗,0.5 g/次,3次/d。对三组继发腹泻的发生率、腹泻持续天数、肺炎治疗的总疗程进行统计分析。 【结果】 预防Ⅰ组继发腹泻发生率为4.8%,预防Ⅱ组继发腹泻发生率为10.9%,对照组继发腹泻发生率为32.0%,预防Ⅰ组、Ⅱ组和对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05);预防Ⅰ组、预防Ⅱ组腹泻持续时间和治疗疗程显著短于对照组(P<0.01)。 【结论】 酪酸梭菌活菌散与抗菌药联用治疗肺炎,能显著降低小儿肺炎继发性腹泻的发生率,预防性应用具有积极的临床意义,且停用抗菌药后再用酪酸梭菌活菌散7 d,预防效果更好。     

Molecular analysis of relapse vs re-infection in HIV-positive patients suffering from recurrent Clostridium difficile associated diarrhoea.

Recurrence is a major complication of Clostridium difficile associated diarrhoea, especially in human immunodeficiency virus (HIV) positive patients, and it is important to distinguish between relapse and re-infection in recurrent episodes. The aim of our study was to analyse C. difficile isolates obtained from HIV-positive patients with recurrent diarrhoea in order to distinguish between relapse and re-infection. This analysis was based on the study of DNA similarities among isolates obtained from different episodes within each patient. Relapses occurred in 64% of patients, 32% suffered re-infections and a combination of relapse plus re-infection was seen in 4%. DNA typing methods can be useful tools to characterize recurrent episodes of C. difficile associated disease.