维甲酸受体变异蛋白酵母双杂交诱饵载体构建

目的 构建维甲酸受体变异蛋白(RARα-V)的诱饵表达载体.为应用酵母双杂交系统筛选与RARα-V相互作用的蛋白建立实验基础.方法 PCR扩增RARα-V,克隆入诱饵载体pGBKT7中,将构建好的诱饵载体pG-BKT7一RARα-v转化到酵母细胞AH109中,并利用蛋白印迹法(Western Blotting)分析诱饵蛋白的表达情况.同时检测诱饵蛋白有无毒性、渗漏和自激活作用.结果 成功扩增了RARα-V基因片断,并克隆入pGBKT7中,测序结果正确.诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,诱饵蛋白无毒性,无自激活和渗漏,Western Blotting分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白.结论 成功构建了RARα-V结合域的酵母诱饵表达载体,为进一步筛选与之相互作用的蛋白提供基础依据.     

重组结核杆菌分泌融合蛋白活性鉴定及应用

目的研究融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP10-ESAT-6或ESAT-6-CFP10免疫学特性.方法将一个柔性的氨基酸接头插入原核表达载体pET32c（＋）中,构建pET32c（＋）-linker.PCR法扩增CFP10、ESAT-6基因.将CFP10克隆入改建的载体pET32c（＋）的linker前,ESAT-6克隆入linker后,构建CFP10-ESAT-6融合基因;或将ESAT-6克隆入改建载体pET32c（＋）的linker前,CFP10克隆入linker后,构建ESAT-6-CFP10融合基因,分别转化大肠埃希菌XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定;在大肠埃希菌BL21中表达,通过Western blot分析其抗原性.结果 2个目的基因分别被按顺序成功克隆入载体pET32c（＋）的linker前或后.重组质粒pET32c（＋）-CFP10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致.融合蛋白在BL21菌中高效表达.Western blot分析表明,融合蛋白与活性肺结核患者血清能发生特异性免疫反应.结论成功地构建了多抗原基因DNA质粒;pET32c（＋）-CFP10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白,该蛋白兼具CFP10和ESAT-6两种蛋白的抗原性.     

重组结核分枝杆菌特异性分泌抗原融合蛋白的活性鉴定及初步应用

目的：融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP10-ESAT-6或ESAT-6-CFP10，研究其免疫学特性，为结核病的血清学诊断提供物质基础。方法：将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c（＋）中，构建pET32c（＋）-linker。PCR法扩增CFP10、ESAT-6基因。将CFP10克隆入改建的载体pET32e（＋）的linker前，ESAT-6克隆入linker后，构建CFP10-ESAT-6融合基因；或将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c（＋）的linker前，CFP10克隆入linker后，构建ESAT-6-CFP10融合基因，分别转化大肠杆菌XL1-blue，抽提质粒，酶切鉴定；在大肠杆菌B121中表达，通过Western blot分析其抗原性。结果：两个目的基因分别被按顺序成功克隆入载体pET32c（＋）的linker前或后。重组质粒pET32c（＋）-CFP10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。融合蛋白在B121菌中高效表达。Western blot分析表明，融合蛋白与活动性肺结核患者血清能发生特异性免疫反应。结论：成功地构建了多抗原基因DNA质粒；pET32e（＋）-CFP10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10质粒在B121菌中能高效表达rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白，该蛋白兼具CFP10和ESAT-6两种蛋白的抗原性。本研究为rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白在结核病血清学诊断中应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌特异性分泌抗原克隆和融合表达及抗原性鉴定

目的融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP 10-ESAT-6或ESAT-6-CFP 10，研究其免疫学特性，为结核病的血清学诊断提供物质基础。方法将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c（＋）中，构建pET32c（＋）-linker。PCR法扩增CFP 10、ESAT～6基因。将CFP 10克隆入改建的载体pET32c（＋）的linker前，ESAT-6克隆入linker后。构建CFP 10-ESAT-6融合基因；或将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c（＋）linker前，CFP 10克隆入linker后，构建ESAT-6-CFP 10融合基因，分别转化大肠杆菌XL 1—blue，抽提质粒，酶切鉴定；在大肠肝菌BL21中表达，通过Westernblot分析其抗原性。结果二个目的基因分别被按顺序成功克隆入载体pET32c（＋）的linker前或后。重组质粒pET32c（＋）-CFP 10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFPl0靶基因的测序结果与预计序列完全一致。融合蛋白在BL21菌中高效表达。Westernblot分析表明，融合蛋白与活动性肺结核患者血清能发生特异性免疫反应。结论成功地构建了多抗原基因DNA质粒；pETB2c（＋）-CFP 10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP 10融合蛋白，该蛋白兼具CFP 10和ESAT-6二种蛋白的抗原性。本研究为rCFP 10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白在结核病血清学诊断的中应用奠定了基础。     

酵母双杂交筛选胎肾上腺cDNA文库中HNP-1结合蛋白

[目的]筛选胎肾上腺cDNA文库中与α防御素HNP-1成熟肽具有相互作用的蛋白分子。[方法]通过聚合酶链反应(PCR)成功获得HNP-1成熟肽基因插入酵母表达载体pGBK-T7中构建诱饵质粒,同时提取胎肾上腺RNA,SMART技术制备人胎肾上腺cDNA文库,并采用Matchmaker LexA酵母双杂交系统从胎肾上腺cDNA文库中筛选与HNP-1成熟肽相互作用的蛋白。最后通过PCR筛选获得阳性克隆并测序,而后经回转实验,GST pull down以及免疫共沉淀再次验证两者的相互作用关系。[结果]成功构建诱饵质粒pGBKT7-HNP-1以及胎肾上腺cDNA文库并在酵母细胞中正确表达,筛选获得HNP-1成熟肽相互作用的蛋白-melanocortin 2 receptor (ACTH-R),CCAAT-enhancer-bind-ing proteins(C/EBP),Tramembrane trafficking protein(TMP21),low density lipoprotein receptor-related protein 6(LRP6)。最终选定促肾上腺皮质激素受体(ACTH-R)作为主要研究对象,且经GST pull down以及免疫共沉淀实验获得了证实两者间具有相互作用的相应的条带。[结论]从胎肾上腺cDNA文库中成功筛选得到α防御素HNP-1成熟肽相互作用蛋白——促肾上腺皮质激素受体。     

神经突起因子酵母双杂交诱饵质粒构建和转化

目的构建和转化神经突起因子（Neuritin）的酵母诱饵重组质粒，为通过酵母双杂交研究Neuritin的功能及作用机制奠定基础。方法用PCR扩增neuritin全长eDNA中编码开放读框的基因片段；将该基因片段与pLexA载体定向重组；用酶切和测序鉴定重组质粒；将核苷酸序列正确的重组质粒转化入EGY48[p8op—LaeZ]酵母菌株。结果成功构建pLexA-neufitin重组质粒。转化有重组质粒和pLexA空载体的2种EGY48[p8op—LaeZ]酵母都能在SD／Gal／Raf／-His／-Ura培养基中长成白色菌落，同时，转化pLexA-pos阳性对照质粒的酵母菌在相同条件下长成蓝色菌落，但都不能在SD／-His／-Leu／-Ura培养基中生长，在SD／-His／-Ura液中培养16h后，A600均值均为0．9。表明重组质粒表达的融合蛋白没有激活LEU2和laeZ酵母报告基因表达的活性，也没有酵母毒性作用。结论构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的人胎脑cDNA文库筛选。     

人巨细胞病毒UL123基因外显子2,3诱饵质粒的构建与鉴定

目的构建和鉴定人巨细胞病毒(HCMV)UL123基因外显子2,3(ie1-exon2,3)的诱饵质粒,并评价其用于筛选胎儿脑文库的可行性。方法以重组质粒pTW IN1/ie1为模板扩增ie1-exon2,3,克隆入pBT质粒,转化E.coli XL1-B lue MRF'Kan,经PCR、限制性酶切和测序鉴定阳性重组子,提取阳性重组质粒转化入细菌双杂交系统报告菌株,诱导表达重组融合蛋白,用SDS-PAGE和W estern B lot对表达产物进行鉴定,并进一步鉴定重组子自身激活作用。结果在细菌双杂交系统中成功构建了细菌双杂交诱饵质粒pBT/ie1-exon2,3,并在报告菌株中表达了重组融合蛋白rIE1-N85/λC1,且pBT/ie1-exon2,3无自身激活作用。结论成功构建了无自激活作用的诱饵质粒pBT/ie1-exon2,3,可用于筛选胎儿脑文库。     

结核分枝杆菌ESAT-6的原核表达与纯化及免疫原性检测

目的构建及鉴定含有GST标签的结核分枝杆菌esat-6基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中高效表达融合蛋白。方法 PCR扩增结核分枝杆菌esat-6基因,并构建到pGEX4T-1上,重组质粒经测序鉴定后进行诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白。结果扩增出了结核分枝杆菌esat-6基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX4T-1-ESAT-6,转化大肠埃希菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物,蛋白纯化后可被结核病患者血清特异性识别。结论构建了质粒载体pGEX4T-1-ESAT-6,并经诱导后高效表达了ESAT-6融合蛋白,为进一步研究结核菌的免疫机制奠定了基础。     

TGF-β1和TGF-βⅡ型受体酵母表达载体构建

目的克隆人转化生长因子β1(TGF-β1)和4个受体基因片段,构建酵母表达载体,为应用酵母双杂交筛选与TGF-β1相互作用的TβRⅡ区域提供技术支持。方法提取人血液中RNA,逆转录转为c DNA,PCR扩增TGF-β1和4个受体(TβRⅡ-A、TβRⅡ-B、TβRⅡ-C、TβRⅡ-D)基因片段,双酶切后,分别插入酵母双杂交表达载体p GBKT7和p GADT7;经过PCR扩增、双酶切和DNA测序鉴定后,构建质粒p GBKT7-TGF-β1和p GADT7-TβRⅡ-A、p GADT7-TβRⅡ-B、p GADT7-TβRⅡ-C和p GADT7-TβRⅡ-D。结果成功扩增TGF-β1基因(1 200 bp)和TβRⅡ-A(453bp)、TβRⅡ-B(366 bp)、TβRⅡ-C(276 bp)和TβRⅡ-D(165 bp)基因片段,经PCR、双酶切和DNA测序鉴定插入到酵母双杂交载体序列正确。结论成功构建p GBKT7-TGF-β1和p GADT7-TβRⅡ-A、p GADT7-TβRⅡ-B、p GADT7-TβRⅡC和p GADT7-TβRⅡ-D酵母双杂交表达载体。     

马红球菌酵母双杂交基因组文库的构建

目的构建马红球菌酵母双杂交基因组文库,为研究马红球菌的致病机理创造条件。方法将马红球菌的基因组DNA部分酶切,克隆到酵母双杂交系统的AD载体中,再检测文库的独立克隆数和插入序列的大小以确定文库的质量。结果获得1×106独立克隆数的基因组文库,插入片段的平均大小为2.3 kb。结论酵母双杂交基因组文库的构建,为进一步研究马红球菌的致病机制打下基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6 His融合蛋白的原核表达及纯化

摘要:目的 构建含有His标签结核分枝杆菌esat-6基因的原核表达质粒,并在体外进行原核表达和纯化。方法 提取结核分枝杆菌基因组DNA,对其采用聚合酶链反应技术扩增esat-6基因,并构建至表达载体pET28a上。将测序正确的载体转化大肠杆菌BL21,然后对His-ESAT6融合蛋白通过IPTG诱导进行表达,最后对重组蛋白使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹进行分析。结果 PCR扩增出结核分枝杆菌esat-6基因,成功构建至表达载体pET28a-ESAT-6上,并在体外优化表达,产生高水平的目的蛋白表达产物。结论 成功构建并表达了含有His标签的ESAT-6融合蛋白,为临床中预防和治疗结核病提供了有效的参考。     

结核分支杆菌抗原ESAT-6真核表达质粒在COS-7中的表达

目的 探讨结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT—6基因真核表达重组质粒在真核细胞(COS—7)中的表达。方法 用LipofectAMINE^TM2000介导真核表达重组质粒pcDNA3．1( )—ESAT—6转染真核细胞COS—7，72h后，通过RT—PCR和Western Blotting试验鉴定ESAT—6基因在COS—7中的表达。结果 通过RT—PCR从转染了pcDNA3．1( )—ESAT—6的006—7中检测到目的基因mRNA的转录；Western Blotting试验鉴定在转染pcDNA3．1( )—ESAT—6的COS—7的细胞裂解上清液中有ESAT—6基因的表达蛋白。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ES—AT—6真核表达重组质粒能够在真核细胞COS—7中表达ESAT—6蛋白，为进一步研究其特性及为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下了基础。     

结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10融合蛋白的构建和表达及其免疫反应性分析

目的 构建结核分枝杆菌H37Rv 株esat-6-cfp-10(简称ec)融合基因及其原核表达载体pET-23b(+).esat-6-cfp-10[以下简称pET-23b(+)-ec],表达、纯化融合蛋白rESAT-6-CFP-10(简称rEC),并分析其免疫反应性.方法 采用基因拼接技术将ESAT-6和CFP-10编...     

人乳腺珠蛋白基因真核表达载体的构建及其表达

[目的]构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础.[方法]利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序分析后,克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM.将重组载体用脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达.[结果]成功扩增hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达.[结论]hMAM基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据.     

携带人肿瘤抑素Tumstatin基因的重组腺相关病毒载体的构建及其在乳腺癌细胞中的表达研究

目的构建携带人肿瘤抑素Tumstatin基因的重组腺相关病毒载体,研究其在乳腺癌细胞MCF-7中的表达。方法以人胚肾293细胞为材料,用RT-PCR方法获取人肿瘤抑素Tumstatin基因,将其克隆入pAAV-MCS载体中形成重组载体pAAV-Tum质粒。用脂质体介导法将重组载体导入乳腺癌细胞株(MCF-7)建立一株稳定的表达Tumstatin基因的乳腺癌细胞株MCF/AAV-Tum,并用RT-PCR检测该细胞系中Tumstatin基因的表达。结果成功构建了pAAV-Tum重组腺相关病毒载体,筛选出乳腺癌细胞株MCF/AAV-Tum,该细胞能表达Tumstatin基因。结论构建的pAAV-Tum重组载体能在MCF-7细胞中表达,为其后的肿瘤抗血管生成治疗研究奠定了基础。     

缺失耶尔森菌HPI irp6基因EAggEC的构建

目的 构建小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛irp6重组自杀质粒，并应用其构建EAggEC上该基因的缺失株。方法 根据已知小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛irp6基因序列，设计PCR引物，扩增并克隆了irp6结构基因，在体外进行精确突变后，插入氯霉素抗性基因。再将含氯霉素的irp6缺失基因亚克隆入自杀质粒pKNGl0l中，构建成irp6基因重组自杀质粒pKH6，并以肠粘附聚集性大肠杆菌EAggECl7.2为出发菌株，通过体内同源重组，置换其irp6基因。结果 经接合转移和同源重组，利用蔗糖抗性筛选，pKH6上的同源序列有效的置换了EA6gECl7-2的ir6基因。结论 以小肠结肠炎耶尔森菌为靶构建的irp6基因重组自杀质粒成功的缺失了EAggECl7-2的ir6基因，获得了携带耶尔森菌强毒力岛的EAggECl7-2 irp6基因缺失株EAG6，为进一步研究其功能打下了基础。     

人乳腺珠蛋白基因疫苗的构建及其免疫原性研究

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因重组质粒pcDNA3.1-hMAM,并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序后克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM。将重组载体脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法和ELISA检测目的基因的表达。结果:成功扩增hMAM基因,酶切测序表明,重组质粒含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM基因疫苗构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

pMD18-T作为A组轮状病毒VP7基因克隆载体的研究

目的:利用RT-PCR法从A组轮状病毒扩增基因片段VP7,再将产物重组于大肠杆菌pMD18-T载体,探讨pMD18-T作为A组轮状病毒VP7基因克隆载体的应用。方法:提取A组轮状病毒总RNA,通过RT-PCR扩增,获得目的基因片段VP7,进行分离纯化和回收,最后把纯化的VP7基因与pMD18-T载体进行连接,进行质粒抽提与鉴定。结果:成功将VP7基因连接到pMD18-T载体,转化感受态菌(DH5α),通过蓝白斑筛选得到DNA阳性重组子(载体+VP7基因片段),经DNA测序鉴定正确。结论:成构建功A组轮状病毒外壳蛋白VP7基因克隆载体,为进一步获得大量VP7基因以及研究和开发轮状病毒基因工程疫苗奠定基础。     

HPV16E6真核表达载体的构建及其在CaSki细胞中的表达及定位

目的:构建pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体,转染CaSki细胞,检测其在CaSki细胞中的表达。方法:用RT-PCR法从CaSki细胞中扩增出带有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点的HPV16E6基因片段,将HPV16E6基因全长片段克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因真核表达载体pEGFP-C2上,通过脂质体将pEGFP-C2-HPV16E6转染入CaSki细胞。结果:pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体构建成功,转染CaSki细胞48h后经RT-PCR及Western-blot检测可见HPV16E6蛋白的高表达,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白主要在CaSki细胞核内表达。结论:成功构建了pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体,为进一步对HPV16E6的研究奠定了基础。