利用胶体金免疫层析技术快速定量检测单增李斯特菌方法的建立

〔目的〕建立胶体金免疫层析技术快速定量检测单增李斯特菌方法。〔方法〕利用胶体金标记和双抗体夹心免疫层析技术,建立单增李斯特菌的快速检测方法,评价其特异性和敏感性,并拟合标准曲线进行定量检测;在牛奶、橙汁、果冻等即食食品样品中添加单增李斯特菌模拟污染样品,评价该方法对半固体、液体等即食食品、可疑生物恐怖样品的检测能力。〔结果〕该法可在10min内完成定性和半定量检测,定量检测灵敏度为3.5×103cfu/ml,线性范围3.5×105～3.5×108cfu/ml,回收率在99%～101.7%之间。〔结论〕建立的检测单增李斯特菌的胶体金免疫层析方法,能快速、灵敏、特异、准确地对样品中的单增李斯特菌进行定性、定量检测。     

单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测技术研究

目的建立快速检测单增李斯特菌的PCR-ELISA方法,将其应用于人工污染的食物样品检测。方法根据GenBank数据库资料,应用分子生物学软件DNAMAN6.0和Primer Premier5.0,以单增李斯特菌的致病基因hlyA为基础,选用PCR引物,应用地高辛标记试剂盒,获得单增李斯特菌特异的地高辛标记片段。根据PCR目的片段序列,设计特异性捕获探针,建立了单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测方法。应用该方法对不同血清型的单增李斯特菌食品分离株进行了检测,并将PCR方法与PCR-ELISA方法对人工污染单增李斯特菌的牛奶样品的检测敏感性进行了比较。结果应用单增李斯特菌特异的PCR-ELISA方法完成检测约需6h。该方法对单增李斯特菌分离株检测的结果,与国家食源性疾病检测网的鉴定结果100%符合。经过12h的增菌培养,PCR-ELISA方法最低可从25ml样品中检出1CFU,检测敏感性为传统PCR方法的10～100倍。结论建立了单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测方法。该方法敏感性高、特异性强、可靠性好,对于提高食源性疾病预警、预测能力,增强检测的时效性和准确性,具有推广应用价值。     

Taq Man-MGB探针Real-timePCR快速检测单增李斯特菌的研究

目的：建立TaqMan—MGB探针Real—time荧光PCR快速检测单增李斯特菌技术。方法：在对单增李斯特菌invA序列进行分析、比较基础上，设计一对特异性TaqMan—MGB探针法引物及探针，通过Real—timePCR反应条件和反应体系的优化，实现对单增李斯特菌的快速检测；用克隆到pMD18-T载体上的李斯特菌invA基因阳参片段及不同菌株、食品标本验证方法的特异性和敏感性。结果：方法的灵敏性高，其循环阈值与模板浓度的对数值具有很好的对应关系，最低可检测57个拷贝数，经18h增菌，可检测低至4．5cfu／ml的细菌；特异性强，检测6株单增李斯特菌标准株和100株单增李斯特菌样品分离株的PCR循环域值（cT值）均小于25，而90株威氏李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌以及非李斯特菌PCR循环域值（CT值）大于35；快速，最快1h可出结果，实际样品20h可出结果，而常规细菌培养法需要一周以上；对103份速冻米面食品进行检测，13份阳性，与常规方法无显著性差异（P〉0．05）。结论：TaqMan—MGB探针的单增李斯特菌Real—time荧光PCR检测方法具有特异性强，敏感性高，易操作等优点，可推广应用。     

奶液模拟标本中单增李斯特菌real-time PCR检测方法的建立

目的建立了基于TaqMan探针的real-time PCR技术针对奶液模拟标本中单增李斯特菌的快速检测方法。方法用单增李斯特菌hlyO基因的部分片段作为靶基因,制作标准曲线,定量检测奶液中的单增李斯特菌。结果通过对不同李斯特菌及一些较为常见的致病菌的DNA进行扩增,只有单增李斯特菌能够产生扩增曲线,其余菌株均不产生扩增曲线。单增李斯特菌的检测灵敏度可以达到9copies/反应体系。结论该方法特异性好,灵敏度高,整个实验可在1.5h内完成,可用于食品中单增李斯特菌的快速检测和疫情暴发时的相关病原调查。     

多重-巢式PCR检测食品中单增李斯特菌研究

〔目的〕建立多重—巢式PCR联合检测体系快速检测食品中的单增李斯特菌。〔方法〕针对单增李斯特菌中多个稳定的特异性基因(hlyA、plcB、prfAi、ap),设计并筛选出6对引物用于多重PCR、2对引物用于巢式PCR,组成多重—巢式PCR联合检测单增李斯特菌,并对珠海地区6类冷冻冷藏食品中单增李斯特菌的带菌情况进行了初步调查。〔结果〕建立的多重—巢式PCR联合检测体系特异性良好,多重PCR的灵敏度达到1×102cfu/ml,巢式PCR的灵敏度达到1×101cfu/ml。在检测的3439份样品中,单增李斯特菌阳性率达22.39%。〔结论〕该检测体系具有快速可靠、灵敏准确及特异性好的特点,有效缩短了检验周期,从传统的14d缩短到2d。对珠海地区6类冷冻冷藏食品中单增李斯特菌的带菌情况有了一定了解。     

食品中单增李斯特菌国标定量方法实验室验证结果与分析

目的对食品中单增李斯特菌国标定量方法进行实验室验证。方法将单增李斯特菌标准菌株活化,经一系列稀释后染菌样品。再用单增李斯特菌国标定量方法讨论稿中平板计数和MPN法检测样品中单增李斯特菌浓度。使用3种分离培养基鉴定,对比检测效果,确定检出限。结果平板计数法的检出限为100CFU／250ml和10CFU／250ml。MPN计数法的检出限为10CFU／250ml和1CFU／250ml。平板计数法中科玛嘉单增李斯特菌显色培养基检出限低于PALCAM分离培养基,而MPN计数法中,3种分离培养基鉴定结果一致。结论平板计数法和MPN计数法均适合于食品中单增李斯特菌定量检测,MPN计数法灵敏度更高。平板计数法中科玛嘉单增李斯特菌显色培养基普遍优于PALCAM分离培养基,3种培养基都适合MPN计数法,鉴定符合率高。科玛嘉和ALOA上生长典型菌落较PALCAM容易判别。     

单增李斯特菌鉴定方法比较研究

[目的]对单增李斯特菌鉴定方法进行研究。[方法]分别用API检测方法、16SrRNA序列分析法和焦磷酸测序法对17株单核细胞增生李斯特菌进行检测。[结果]3种方法均能准确鉴定单增李斯特菌。[结论]焦磷酸测序方法检测单增李斯特菌特异性强、经济、操作简便、检测快速,为单增李斯特菌的快速、高通量检测提供了一种新的手段。     

套式PCR快速检测单增李斯特氏菌

根据GenBank数据库的单增李斯特氏菌iap基因设计两对引物,建立了套式PCR快速检测单增李斯特氏菌的方法。两对引物分别扩增出约1500bp和500bp片段,与预期大小一致。对菌液、模拟样品的检测表明,本方法能有效地克服食品基质、培养基成分和杂菌对PCR检验的干扰作用。套式PCR方法具有很好的特异性;灵敏性实验检测极限为101CFU／ml;人工污染猪肉检测极限为103CFU／ml;可在7h内完成检测,很适宜于进出口食品中单增李斯特氏菌的快速检测。     

焦磷酸测序法检测单增李斯特菌

目的:建立单增李斯特菌的焦磷酸测序检测方法。方法:通过焦磷酸测序法对hly基因的保守片段进行测序来检测单增李斯特菌,从基因序列上对单增李斯特菌进行鉴定。结果:焦磷酸测序法可准确鉴定94株单增李斯特菌。结论:本方法可用于单增李斯特菌的检测鉴定,具有准确、快速和实时等优点,可满足对单增李斯特菌快速、高通量检测的需求。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证分析

目的提升实验室对食品中单增李斯特氏菌的检测能力。方法以GB4789.30-2010为检验依据,对样品编号TF0580094的3个样品进行单增李斯特氏菌定性检测,采用常规培养检测方法、BAX Q7全自动病原微生物快速检测系统、VITEK2 compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行分析鉴定。结果样品1、样品2均检出单增李斯特氏菌;样品3未检出,经分析鉴定确认为英诺克李斯特氏菌。中检院公布检测结果为满意。结论通过参与此次能力验证,找到影响单增李斯特氏菌检出的因素,验证了本实验室的检测水平,提高了检验员的技术水平、推进了实验室质量管理体系的不断完善。     

单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒在食品检测中的应用

目的研究单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒的准确性和特异性。方法从市场采集自然样品70份,经过2步增菌后,用核酸层析检测试剂盒进行检测,同时用传统方法进行验证。结果 70份样品试剂盒检测阳性3份,阴性67份,而传统方法检测阳性4份,其中1份阳性样品试剂盒检测为阴性。试剂盒检测的准确率达到98.60%。特异性试验表明该剂盒检测标准菌株特异性好,与常见的食源性致病菌均无交叉反应。结论单增李斯特氏菌核酸层析检测层析试剂盒特异性好,检测准确率高,能够满足食品中单增李斯特氏菌检测的需要。     

食品中单核细胞增生李斯特菌PCR快速检测方法

[目的]建立食品中单核细胞增生李斯特菌的快速、敏感、特异的PCR检测方法。[方法]选择Hly基因作为靶序列设计一对引物，用该引物对单增李斯特菌和10株非单增李斯特菌进行PCR扩增，并且用此方法对30份食品进行检测。[结果]扩增片断表现出极好的单增李斯特菌特异性，最低检出限为190cfu/ml。[结论]本实验建立的PCR检测方法为一种简便、快速、敏感、特异的单增李斯特菌检测方法。     

宝鸡市单核细胞增生性李斯特菌污染状况监测结果分析

目的了解宝鸡市食品中单核细胞增生性李斯特菌（简称单增李斯特菌）的污染状况,发现本市受单增李斯特菌污染的高危食品,为预防食物中毒提供科学依据。方法按照国家标准检验方法进行菌株分离,鉴定用APIListe—ria生化鉴定条和VITEK2COMPACT高智能全自动微生物仪。对2005—2011年采集的971份食品进行检测。结果．本市单增李斯特菌的阳性检出率为12．05％。2005年阳性检出率最高,为24％;2011年检出率最低,为6．29％。检测的13类样品中,8类食品受到单增李斯特菌不同程度的污染。生禽肉检出率最高,为32．94％;冰淇淋、果汁、面皮、糕点及饼干、沙拉都均未检出单增李斯特菌。结论宝鸡市单增李斯特菌的污染比较普遍,污染率较高,应该引起监管部门的注意。     

荧光实时定量PCR检测单核李斯特菌方法学建立及应用

目的 建立检测单核细胞增多性李斯特菌的荧光定量PCR方法，并利用此方法检测人工污染的牛奶中单增李斯特菌菌量。方法 选择单增李斯特菌特异性的基因Listeriolysin O基因为靶目标设计引物，采用煮沸法抽提纯单增李斯特菌株（1／2a）DNA，建立SYBRGREEN实时定量PCR检测体系：结果 定量PCR对李斯特菌可产生特异扩增信号，对其他菌（大肠杆菌）无响应。标准曲线的相关系数为0．9521。最小检菌量约为100个菌落形成单位／反应体系。在人为污染牛奶检测中，与传统细菌计数方法结果相比，相关系数为0．839。结论 实时定量PCR是一种快速、灵敏的定量检测单增李斯特菌的方法，可用于牛奶样品的检测。     

应用PCR方法检定单核细胞增多性李斯特菌

目的建立单核细胞增多性李斯特菌（单增李斯特菌）快速、敏感、特异的ＰＣＲ诊断方法。方法选取ｈｌｙＡ基因作为靶序列设计一对引物，用该引物对５４株标准李斯特菌和２１株无关菌进行ＰＣＲ扩增，得到进一步验证。采用ＰＣＲ和常规鉴定方法同时对从国内食品分离的３３株李斯特菌进行鉴定。结果可扩增含有保守ＨｉｎｄⅢ切点的７４３ｂｐ片段。表现出极好的单增李斯特菌种特异性。纯培养的检测极限为５５个菌。发现其中１８株用两种方法都鉴定为单增李斯特菌，两种方法的结果完全符合。当用于食物标本检测时，ＰＣＲ反应遭强烈抑制。经过２５小时的增菌培养，对培养物进行化学抽提、纯化的菌体经加热裂解后直接用作ＰＣＲ反应模板，可使抑制作用大大降低。每毫升牛奶人工接种４个菌可用该法特异检出。结论建立了ＰＣＲ方法，可初步用于单增李斯特菌的快速、特异、敏感诊断。     

食品中产单核细胞增生李斯特菌污染状况的分析

[目的]了解马鞍山市7类食品中单增李斯特菌污染状况,并评价不同方法的检测效果,为食品中单增李斯特菌定量风险评估提供科学依据. [方法]依据国标GB4789.30-2003和国家食源性疾病监测网2007年年度工作手册进行,同时用EB增菌法、LB增菌法和Fraser肉汤培养法对食品样品进行单增李斯特菌分离鉴定并进行比较. [结果]7类482份食品样品,检出单增李斯特菌(L.m)56株,检出率为11.62%;在288份生肉和水产品中检出28株产H2S李斯特菌,阳性率为9.72%. [结论]在7类食品中除冰淇淋外,均不同程度受到L.m污染,尤以速冻面米食品污染严重,其次为熟肉制品、生畜禽肉和水产品.LB增菌法明显优于EB增菌法,Fraser肉汤培养法和LB增菌法检出率相等,而后者操作更方便.     

全自动微生物磁珠分选系统检测单核细胞增生李斯特菌效果研究

目的:研究全自动微生物磁珠分选系统对食品中单增李斯特氏菌的检测效果。方法:取400份自然样品,用磁珠分选系统和国标法对样品进行对比检测。结果:全自动微生物磁珠分选系统相较国标法对自然样品中单核细胞增生李斯特氏菌阳性检出率有一定程度提高。结论:全自动微生物磁珠分选系统简单易用,标准化程度高,可以和国标检测方法相结合以提高单增李斯特氏菌的检出率。     

食品中单增李斯特菌PCR检测方法建立与评价

目的建立单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）快速、敏感、特异的PCR诊断方法。方法采用聚合酶链式反应技术（PCR）特异性扩增单核细胞增生李斯特菌溶血素基因（hlyA），并评价该方法的特异性与敏感性。结果在706bp处出现nuc基因的目的片断，只有单增李斯特菌的目的片段获得扩增，其他菌种扩增均呈阴性；该方法可以检测到3．3ng／L的DNA。结论PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便。为食品中单增李斯特菌的快速检测提供了新的手段。     

2012年张家港口岸进境冷冻猪肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌污染调查简

目的 了解进境冷冻猪肉制品单增李斯特菌污染状况,建立流行病学监测网,以便制定良好的预防控制措施,更有效地预防和控制由该菌引起的食源性疾病和疫情的发生.方法 mini VIDAS快速筛选、显色平板分离、API Listeria鉴定结合国标法进行单增李斯特菌检测.结果 2012年共检测冷冻猪肉制品171批,检出单增李斯特菌14株,阳性率为8.19％（14/171）.结论 单增李斯特菌污染较为严重,应加强对冷藏生畜、肉类食品的卫生管理.     

2010-2013年达州市市售食品单增李斯特菌 污染监测结果分析

摘要:目的　了解达州市市售食品单增李斯特菌污染状况,为科学监管提供参考。方法　依照食品国家安全标准“单核细胞增生李斯特氏菌检验”GB 4789.30-2010方法对达州市81类市售食品进行检测。结果　共检测达州市8类市售食品571件,检出单增李斯特菌20株,其中,水产品中单增李斯特菌检出率最高,为20.0%;3类采样地点中,农贸市场销售的食品中单增李斯特菌检出率高,为5.1%;达州市周边县市单增李斯特菌检出率为8.3%,高于达州市主城区食品的检出率。结论　达州市市售食品存在单增李斯特菌污染,但污染严重程度低于我省部分市州,需要对高风险的食品类别和销售地点进行重点监管。