广州市2014-2019年H5亚型禽流感病毒流行与基因遗传特征分析

目的 分析广州市H5亚型禽流感病毒流行特点及基因进化和变异特征,为禽流感的防控提供依据。方法 对2014-2019年广州市禽类市场外环境标本进行禽流感病毒核酸检测并分析H5亚型流行情况,随机选取48份（46份来源于环境和2份来源于病例）H5阳性标本进行HA和NA基因测序,应用生物信息学软件分析分子遗传特征。结果 2014-2019年监测的52 284份环境标本中,检出H5亚型阳性标本1 094份,阳性率为2.09%。遗传进化分析显示,HA基因属于Clade 2.3.4.4.C分支,NA基因主要归属于欧亚谱系H6N6进化分支,HA和NA基因的进化以时间聚类为特点,相近年份流行株聚成一个进化分支。分子特征显示,48份毒株裂解位点呈现高致病性分子特点,受体结合位点仍为禽源受体,但普遍发生S123P、S133A和T156A倾向结合人源受体的位点突变。抗原位点变异主要出现在B、E区,并表现时间分布的特点,同一年份流行株常发生与上一年份流行株不同的抗原位点变异。2017年开始所有毒株出现由氨基酸缺失导致的糖基化位点的增加（140-NHT）。结论 广州市禽类市场外环境H5亚型禽流感病毒长期流行,且阳性率占比逐渐升高。测序分析提示,广州市H5亚型禽流感病毒为Clade 2.3.4.4.C分支H5N6高致病性病毒,并且持续进化和变异,特别是普遍出现与人源受体结合能力增强的突变,需加强监测。     

2016年盐城市1例人感染H7N9禽流感病毒HA、NA基因变异分析

目的 了解盐城市禽流感H7N9病毒株HA基因和NA基因分子进化特征,为更好预防和治疗人感染禽流感H7N9病例提供科学依据。方法 通过荧光定量PCR方法对标本进行流感病毒分型检测,对禽流感H7N9病毒荧光PCR阳性的标本,采用一步法RT-PCR方法对H7N9病毒HA基因和NA基因全长编码区进行扩增,扩增产物经纯化测序,采用相应的生物信息软件进行核苷酸及氨基酸序列比对及基因种系进化特征分析。结果 盐城市禽流感H7N9病毒株HA基因和NA基因有着独特的进化方式,A/JSYC/1/2016(H7N9)病毒株HA裂解位点附近氨基酸序列为PEIPKGR/GL,属于低致病性禽流感病毒。HA基因编码蛋白受体结合位点出现了G186V、Q226L氨基酸位点的变化,增强了病毒对人的感染能力,NA基因编码蛋白主要可能的神经氨酸酶抑制剂耐药位点未发生E120G、R153K、H276Y、R294K的变异。结论 2016年盐城市禽流感H7N9病毒株HA基因和NA基因处于基因点突变的抗原漂移变化中,某些变异位点具备了感染人的某些分子特征。     

2016年6月至2017年4月辽宁省人感染H7N9禽流感病毒HA和NA基因特征分析

目的 本文对2016-2017年辽宁省人感染H7N9禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因遗传进化特征分析。方法 使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对选取的4株H7N9禽流感病毒株HA和NA基因进行扩增并测序,用生物信息学软件分析其基因进化变异特征。结果 2016年6月至2017年4月辽宁省4株毒株的HA和NA基因与WHO最新推荐的A/Hunan/02650/2016疫苗株的同源性最高,其HA基因的核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性分别为99.3%~99.6%,99.8%~100%;NA基因的核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性分别为97.7%~99.7%;98.3%~99.6%。本省所有毒株均属长江三角洲谱系,但主要聚集在两个次分支。4株病毒HA蛋白裂解位点333-342氨基酸序列均为PEIPKGR↓GLF,在338-339位点无连续的多个氨基酸插入(KRTA),属于低致病性禽流感病毒分子特征。HA受体结合位点均出现S138A、G186V、Q226L、T221P氨基酸的突变,NA茎部区均出现“QISNT”缺失,且NA蛋白上相关耐药位点上的氨基酸并未发生突变,3株毒株NA蛋白上糖基化位点第42位发生氨基酸序列NCSH→NCTH突变。结论 2016-2017年辽宁省人感染H7N9禽流感病毒HA和NA基因关键位点氨基酸发生突变,使病毒具有双受体结合特性以及毒力增强。     

基于纳米孔测序技术对新型重组H3N2禽流感病毒的测序鉴定及其基因特征分析

目的 利用纳米孔测序技术对新型重组H3N2禽流感病毒进行测序鉴定并分析病毒的基因特征。方法 对2021年广州市某农贸市场外环境H3N2禽流感阳性样本进行鸡胚培养,联合病毒全基因组序列靶向扩增和纳米孔测序技术进行病毒高通量测序。通过生物信息学软件,分析病毒基因特点。结果 系统发育进化树显示,该毒株各基因片段均属于欧亚进化分支,宿主来源均为禽源。其HA基因与我国H3N6禽流感病毒亲缘关系较近。NA基因与2017-2020年我国H3N2禽流感病毒亲缘关系较近。PB1基因与2016-2022年我国广西壮族自治区、福建省H5N6禽流感病毒亲缘关系较近,与广州市H5N6禽流感流行株PB1基因亲缘关系较远。其余内部基因片段来源复杂,具有明显的遗传多样性。分子特征显示,该毒株具有典型的低致病性禽流感病毒分子特征,倾向结合禽源受体。生物特性相关重要蛋白位点上,该毒株发生PB2-L89V、PB1-L473V、NP-A184K、M1-N30D/T215A、NS1-P42S/N205S等致病性增强突变。结论 本研究通过纳米孔测序鉴定一株新型重组H3N2禽流感病毒,分析发现该病毒与H5N6禽流感病毒发生了基因重组。目前该病毒跨种传播能力较低,但有必要密切关注H3亚型禽流感病毒的流行和变异。     

浙江省2002-2006年禽流感H5N1病毒基因特性与进化重组分析

目的 对近年来浙江省禽流感病毒H5N1分离株的基因特性与进化重组特征进行分析.方法 通过对2002-2006年浙江省禽与人的H5N1病毒株进行全基因序列测定,采用Mega 3.0生物信息学软件分析病毒株基因特性并与相关基因型标准病毒株进行系统进化分析.结果 2002-2006年浙江省HSNl病毒株HA序列裂解位点序列含多个碱性氨基酸,符合高致病性禽流感病毒特征;与Gs/Guangdong/1/96相比,除Dk/Zhejiang/2/02和Ck/Zhejiang/8/03株外其他病毒株均在NA蛋白茎区缺失20个氨基酸.全基因系统进化分析表明,2002-2003年的分离株遗传基因基本属于当年流行的B、W、X、Y、z等基因型,但部分病毒株不同基因片段属于不同基因型.结论 浙江省禽类中也广泛存在H5N1的基因片段重组现象,2005年后的Ck/Zhejiang/24/05株及人H5N1 Zhejiang/16/06株各遗传基因基本上稳定于近年大陆流行的FJ-like基因型.     

活禽市场环境H9N2亚型禽流感病毒分子生物学研究

目的监测活禽市场环境中H9N2禽流感病毒红细胞凝集素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)糖蛋白基因的分子进化特征,为防控人H9N2禽流感病毒提供依据。方法 2016年8月至2017年8月,采集自长沙市开福区活禽市场的76份环境样本开展禽流感病毒核酸检测,然后对4份H9亚型禽流感病毒核酸阳性样本进行HA和NA基因RT-PCR扩增和核苷酸测序,测序结果经在线BLAST比对和Mega 6软件构建进化树分析。结果从76份环境样本中检出A型禽流感病毒核酸阳性样本45份,H9亚型阳性样本30份,占总样本的39.47%。鉴定出H9N2亚型禽流感病毒2株,HA和NA基因进化分析显示,2株H9N2亚型禽流感病毒与2014-2017年国内H9N2亚型禽流感病毒聚集形成一个主要分支,与A/duck/Hong Kong/Y439/1997、欧亚和北美谱系代表株进化分支距离较远。本研究中的2株H9N2亚型禽流感病毒在HA蛋白连接肽位点出现2个碱性氨基酸(amino acids,aa),对禽表现为低致病性的分子特征;受体结合位点区域(receptor binding site,RBS)aa为LMG,为人源受体。结论 2016-2017年,长沙市开福区活禽市场环境中H9亚型禽流感病毒污染较重,环境中的H9N2亚型禽流感病毒对禽表现为低致病性的分子特征,具有容易感染人的受体特征。     

芜湖市首例人感染H7N9禽流感病原检测分析

目的了解芜湖市首例人感染H7N9禽流感病例病原情况。方法采集病例呼吸道标本并提取RNA,进行流感病毒特异性基因的PCR扩增,毒株提交CNIC进行基因测序。结果患者呼吸道吸取物的样本Flu A和H7N9基因核酸扩增结果阳性。病毒HA和NA基因序列与其他已知H7N9禽流感分离株序列具有高度的一致性(HA:99.4%~99.8%;NA:99.2%~100.0%),HA基因核苷酸相似性最高毒株为KM054796-A/chicken/Jilin/2014,NA基因相似度最高的毒株为KP414837-A/chicken/Jiangxi/2014。HA和NA基因遗传进化关系最近的都为毒株KP414837-A/chicken/Jiangxi/2014。结论芜湖市首例人感染H7N9禽流感病例的病毒株HA和NA序列均与已知H7N9禽流感病毒高度同源。     

我国长三角地区首例人感染H5N6禽流感病毒的分离、鉴定与进化特征

目的 对我国长三角地区首例人感染H5N6禽流感进行病毒分离、鉴定和进化分析.方法 通过荧光定量RT-PCR法进行流感病毒分型检测,阳性标本用SPF鸡胚进行病毒分离,对病毒分离物进行全基因组扩增测序,利用Blastn、ClustalX和Mega 6.1等软件进行序列比对和系统进化分析.结果 2019年11月禽流感患者标本中分离到1株H5N6禽流感病毒毒株,该病毒属于clade 2.3.4.4h,其HA蛋白裂解位点含有多个碱性氨基酸,为高致病性禽流感病毒.病毒HA蛋白的Q222和G224位氨基酸未发生突变,保留了禽类受体α2-3半乳糖苷唾液酸结合特性;AA158位点丧失糖基化,但AA124出现1个新的潜在糖基化位点.结论 长三角地区首例人感染的H5N6禽流感病毒是1株新基因重配的高致病性禽流感病毒,与近年来家禽中流行的病毒高度同源,提示应该加强对禽流感病毒的监测和跨种传播的研究.     

北京市某区1例人感染H7N9禽流感病毒的HA和NA基因特征分析

目的 了解北京市某区1例人感染H7N9禽流感病毒基因特征,为禽流感病例的早期发现、疫情控制提供参考。方法 提取病例临床样本病毒核酸,反转录扩增后进行病毒血凝素基因(hemagglutinin, HA)、神经氨酸酶基因(neuraminidase, NA)序列测定。获得的病毒序列与全球流感共享数据库中H7N9禽流感病毒株进行序列分析,比较该病毒与北京市既往发现株和其他省市毒株同源性,构建系统发育树,并对部分耐药位点和糖基化位点进行分析。 结果 北京市某区1例H7N9禽流感病毒为低致病性禽流感。HA、NA与北京既往发现的29株毒株氨基酸同源性为97.2%~100%和96.8%~100%,基于系统进化分析与之最为相近的疫苗株为A/Hunan/02650/2016。HA蛋白受体结合位点发生了G186V、Q226L突变,HA和NA的糖基化位点均未发生变化。 结论 该区出现的H7N9病毒与北京地区既往发现H7N9毒株具有高度同源性,部分氨基酸位点存在变异,但未发生耐药突变。     

泛太平洋西岸地区部分H5N1亚型禽流感病毒毒株血凝素基因特性的研究

目的了解泛太平洋西岸各个国家H5N1亚型人禽流感病毒血凝素(HA)基因分子特征,寻求HA基因变异规律。方法从Genebank中下载泛太平洋西岸国家或地区(包括泰国、越南、香港、印度尼西亚、中国大陆、蒙古、俄罗斯)50株H5N1亚型高致病性流感病毒(HAPI)毒株血凝素基因序列,利用生物信息学软件DNASTAR5.0进行核酸同源性分析,用MEGA3.1进行核酸和氨基酸序列比对和进化树分析。结果50株高致病性H5N1亚型流感病毒毒株可以分成3个相对独立的进化簇。第1簇为泰国越南簇;第2簇为中国印尼北亚簇(包含中国、印度尼西亚、蒙古以及俄罗斯);第3簇主要为1996~2001年期间分离的毒株,该簇毒株HA基因与Gs/Gdlike毒株核酸同源性更为接近,其基因亚型更多表现为Gs/Gdlike或其他基因亚型。HA基因分子特征分析表明在HA蛋白抗原性上,泰国越南分离株表现基本一致,而其他地域分离株存在表现各异,但也存在地域的一致性。结论泛太平洋西岸地区分离的H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白在分子特征上表现出一定的地域特异性,在一定地域范围内保持一致性。     

人感染高致病性H5N6禽流感病毒表面糖蛋白分子进化特征

目的对19例人感染高致病性H5N6禽流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)蛋白进行分子进化分析。方法运用下一代测序平台对病毒分离物进行全基因组测序,从美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)和全球流感序列数据库(global initiative on sharing avian influenza data,GISAID)下载参考序列,利用Blasts、Mega 6.1及Clustal X 2.1等软件进行序列分析。结果2014-2018年中国共发生23例人感染H5N6禽流感病毒病例。对19个病例的H5N6病毒的HA和NA基因进行进化分析。HA进化分析显示病毒都属于Clade 2.3.4.4,其中涉及17个病例的病毒属于Group C;首例H5N6病例毒株(A/Sichuan/26221/2014)属于Group D;福建一个病例(A/Fujian-Sanyuan/21099/2017)属于Group B。所有19个病例的病毒HA蛋白的裂解位点含有多个碱性氨基酸。所有病毒的HA蛋白的受体结合位点226~228位氨基酸是QS(R)G(氨基酸排序以H3-HA为准),理论上对禽类受体α2-3半乳糖苷唾液酸(SAα2-3Gal)有嗜性。18病例病毒的HA蛋白发生了T160A的突变,导致在158N位点失去糖基化。除了A/Sichuan/26221/2014外,18个病例的病毒NA蛋白在58~68位缺失了10个氨基酸。9个病例的病毒PB2蛋白发生E627K突变。结论2014-2018年间中国人感染H5N6病毒进化活跃,具有明显的基因多样性,需要加强对病毒分子进化的监测。     

甲型H1N1流感病毒基因组序列分析及其特性研究

目的 分析甲型H1N1流感病毒的基因组序列特征,阐明该毒株的遗传变异及分子特性.方法 GenBank中获取流感病毒全序列,对各段基因与已知序列进行分析比较,绘制进化树,并分析和预测甲型毒株的致病性、药物敏感性和现有疫苗的预防保护作用.结果 甲型H1N1病毒的HA、PB2、PB1、PA、NP、NS基因与美国本土的猪流感病毒序列具有高度同源性,NA和M基因具有典型的欧亚株系猪流感病毒特征.该病毒具有人传人的分子基础,HA上HA1和HA2裂解位点序列为PSIQSR↓+GLFGAI,尚不具备高致病性流感病毒的特征.病毒对金刚烷胺类药物耐药,而对达菲和扎那米韦敏感.HA片段5个抗原决定区氨基酸序列与人用流感疫苗具有较大差异,推测现有疫苗对预防本次疫情基本无效.结论 甲型H1N1是一种北美和欧亚两种猪流感病毒的混合体,开发针对本病毒的流感疫苗有助于进一步控制疫情蔓延.     

Protective efficacy in farmed ducks of a duck enteritis virus-vectored vaccine against H5N1, H5N6, and H5N8 avian influenza viruses

Ducks play a key role in the maintenance and spread of avian influenza viruses (AIVs) in nature, and control of AIVs in ducks has important implications for AIV eradication from poultry. We previously constructed a recombinant duck enteritis virus (DEV), rDEVus78HA, that expresses the HA gene of an H5N1 AIV and showed that rDEVus78HA immunization provides complete protection against both DEV and H5N1 AIV challenge in specific-pathogen-free ducks. In this study, we performed a 60-week clinical trial and found that this rDEVus78HA vaccine can function as a bivalent vaccine in farmed ducks against lethal challenge with DEV and H5N1 virus. Moreover, we found that rDEVus78HA-vaccinated ducks were efficiently protected against challenges with recently isolated heterologous H5N6 and H5N8 viruses. Our results demonstrate that rDEVus78HA could be extremely valuable for the control of DEV and H5 AIVs in ducks.     

Generation of an attenuated H5N1 avian influenza virus vaccine with all eight genes from avian viruses

In the face of disease outbreaks in poultry and the potential pandemic threat to humans caused by the highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIVs) of H5N1 subtype, improvement in biosecurity and the use of inactivated vaccines are two main options for the control of this disease. Vaccine candidates of influenza A viruses of H5N1 subtype have been generated in several laboratories by plasmid-based reverse genetics with hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) genes from the epidemic strains of avian viruses in a background of internal genes from the vaccine donor strain of human strains, A/Puerto Rico/8/34 (PR8). These reassortant viruses containing genes from both avian and human viruses might impose biosafety concerns, also may be do if C4/F AIV would be a live attenuated vaccine or cold-adaptive strain vaccine. In order to generate better and safer vaccine candidate viruses, we genetically constructed attenuated reassortant H5N1 influenza A virus, designated as C4/F AIV, by plasmid-based reverse genetics with all eight genes from the avian strains. The C4/F AIV virus contained HA and NA genes from an epidemic strain A/Chicken/Huadong/04 (H5N1) (C4/H5N1) in a background of internal genes derived from a low pathogenic strain of A/Chicken/F/98(H9N2). The reassortant virus was attenuated by removal of the multibasic amino acid motif in the HA gene by mutation and deletion (from PQRERRRKKR (downward arrow) G to PQIETR (downward arrow) G). The intravenous pathogenicity index (IVPI) of C4/F AIV virus was 0, whereas that of the donor virus C4/H5N1 was 3.0. The virus HA titer of C4/H5N1 in the allantoic fluid from infected embryonated eggs was as high as 1:2048. The inactivated vaccine prepared from the reassortant virus C4/F AIV-induced high HI titer in vaccinated chickens and gave 100% protection when challenged with highly pathogenic avian influenza virus of H5N1 subtype.     

Bioengineering a highly productive vaccine strain in embryonated chicken eggs and mammals from a non-pathogenic clade 2·3·4·4 H5N8 strain

The clade 2·3·4·4 H5Nx is a highly pathogenic avian influenza (HPAI) virus, which first appeared in China and has spread worldwide since then, including Korea. It is divided into subclades a - d, but the PR8-derived recombinant clade 2·3·4·4 a viruses replicate inefficiently in embryonated chicken eggs (ECEs). High virus titer in ECEs and no mammalian pathogenicity are the most important prerequisites of efficacious and safer vaccine strains against HPAI. In this study, we have synthesized hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) genes based on the consensus amino acid sequences of the clade 2·3·4·4a and b H5N8 HPAIVs, using the GISAID database. We generated PR8-derived H5N8 recombinant viruses with single point mutations in HA and NA, which are related to efficient replication in ECEs. The H103Y mutation in HA increased mammalian pathogenicity as well as virus titer in ECEs, by 10-fold. We also successfully eradicated mammalian pathogenicity in H103Y-bearing H5N8 recombinant virus by exchanging PB2 genes of PR8 and 01310 (Korean H9N2 vaccine strain). The final optimized H5N8 vaccine strain completely protected against a heterologous clade 2·3·4·4c H5N6 HPAIV in chickens, and induced hemagglutination inhibition (HI) antibody in ducks. However, the antibody titer of ducks showed age-dependent results. Thus, H103Y and 01310PB2 gene have been successfully applied to generate a highly productive, safe, and efficacious clade 2·3·4·4 H5N8 vaccine strain in ECEs.     

安徽省2株人感染H9N2流感病毒基因特征

目的 分析2015年安徽省2株人感染H9N2禽流感病毒分离株全基因组特征。方法 对安徽省2015年4月和9月流感监测网络实验室先后发现并确诊的2例H9N2禽流感病毒感染病例及其病毒分离株全基因组序列进行分析,使用Mega 6.0等软件解析2株H9N2毒株全基因组特征。结果 安徽省首次报道人感染H9N2禽流感病毒病例,对病毒分离株分析显示,其HA和NA基因与中国2013年禽间流行的H9N2病毒高度同源,属于A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)支系;而PB2和MP基因属于A/quail/Hong Kong/G1/97支系,与H7N9、H10N8和H6N2具有较高的相似度。氨基酸序列比对发现该2株病毒出现多个人易感倾向位点分子特征:HA蛋白发生Q226L、H183N和E190T突变,且HA裂解位点为PSRSSR\GL排列,NA蛋白茎部发生63~65位氨基酸缺失,M2蛋白S31N突变,以及PA-100A、PA-356R和PA-409N。结论 安徽省首次报道的人感染禽源H9N2流感病毒为H9N2系间重配病毒,存在多个人易感位点。     

Emergence of novel clade 2.3.4 influenza A (H5N1) virus subgroups in Yunnan Province,China

From December 2013 to March 2014, a major wave of highly pathogenic avian influenza outbreak occurred in poultry in Yunnan Province, China. We isolated and characterized eight highly pathogenic avian influenza A (H5N1) viruses from poultry. Full genome influenza sequences and analyses have been performed.Sequence analyses revealed that they belonged to clade 2.3.4 but did not fit within the three defined subclades. The isolated viruses were provisional subclade 2.3.4.4e. The provisional subclade 2.3.4.4e viruses with six internal genes from avian influenza A (H5N2) viruses in 2013 were the novel reassortant influenza A (H5N1) viruses which were associated with the outbreak of H5N1 occurred in egg chicken farms in Yunnan Province. The HA genes were similar to subtype H5 viruses isolated from January to March of 2014 in Asia including H5N6 and H5N8. The NA genes were most closely related to A/chicken/Vietnam/NCVD-KA423/2013 (H5N1) from the subclade 2.3.2. The HI assay demonstrated a lack of antigenic relatedness between clades 2.3.4.4e and 2.3.4.1 (RE-5 vaccine strain) or 2.3.2.2 (RE-6 vaccine strain).     

Avian influenza in the Greater Mekong Subregion, 2003–2018

The persistent circulation of avian influenza viruses (AIVs) is an ongoing problem for many countries in South East Asia, causing large economic losses to both the agricultural and health sectors. This review analyses AIV diversity, evolution and the risk of AIV emergence in humans in countries of the Greater Mekong Subregion (GMS): Cambodia, Laos, Myanmar, Thailand and Vietnam (excluding China). The analysis was based on AIV sequencing data, serological studies, published journal articles and AIV outbreak reports available from January 2003 to December 2018. All countries of the GMS have suffered losses due repeated outbreaks of highly pathogenic (HP) H5N1 that has also caused human cases in all GMS countries. In Laos, Myanmar and Vietnam AIV outbreaks in domestic poultry have also been caused by clade 2.3.4.4 H5N6. A diverse range of low pathogenic AIVs (H1-H12) have been detected in poultry and wild bird species, though surveillance for and characterization of these subtypes is limited. Subtype H3, H4, H6 and H11 viruses have been detected over prolonged periods; whilst H1, H2, H7, H8, H10 and H12 viruses have only been detected transiently. H9 AIVs circulate endemically in Cambodia and Vietnam with seroprevalence data indicating human exposure to H9 AIVs in Cambodia, Thailand and Vietnam. As surveillance studies focus heavily on the detection of H5 AIVs in domestic poultry further research is needed to understand the true level of AIV diversity and the risk AIVs pose to humans in the GMS.