2014年厦门地区市售牡蛎诺如病毒污染状况调查分析

目的调查2014年厦门地区市售牡蛎中GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的污染状况,为食用诺如病毒污染的牡蛎引起的胃肠炎提供预警信息和防控建议。方法 2014年1月-2014年11月对厦门地区市售牡蛎进行连续采样,利用实时荧光定量RT-PCR法对样品中诺如病毒进行检测,确定牡蛎中诺如病毒污染状况及基因型分布状况。结果 198份牡蛎样品中诺如病毒总检出率为22.7%,GⅠ型No Vs检出率为6.1%,GⅡ型No Vs检出率为9.1%,GⅠ型和GⅡ型No Vs同时检出率为7.1%;消化腺中诺如病毒RNA载量水平为400 copy/g~485 000 copy/g,均值为9 500 copy/g。结论 2014年厦门地区市售牡蛎的诺如病毒污染情况较严重,GⅠ型和GⅡ型No Vs均有污染,建议相关部门采取措施,降低人群感染诺如病毒的风险。     

贝类中诺如病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立实时荧光定量PCR法检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒的方法。对东海区域市场内零售贝类海产品中诺如病毒携带情况进行监测,为海产品食品安全和风险预警提供科学依据。方法采集浙江沿海地区市场上常见贝类,利用实时荧光定量PCR检测技术对贝类进行检测。结果 2 955份样品中有63份样品携带诺如病毒,其中杂色蛤、太平洋牡蛎、僧帽牡蛎、毛蚶中均检出GⅡ型诺如病毒。贝类样品中太平洋牡蛎的检出率最高,为15.64%。贝类中诺如病毒在冬季(11月-次年2月)的检出率明显高于夏季(6月-9月),其季节分布差异有统计学意义(χ~2=31.3,P0.05)。结论东海区域贝类中,特别是生食或半熟食贝类中诺如病毒的携带水平较高、分布较广,应持续做好贝类中诺如病毒携带监测,同时做好风险预警。     

广东省市售牡蛎中诺如病毒污染调查

目的 调查广东省地区市售牡蛎中诺如病毒污染状况并对阳性株进行鉴定、分型,为控制和预防因食用牡蛎而引起诺如病毒胃肠炎提供基础数据。方法 应用实时荧光定量RT-PCR,对2016年1月 - 2017年12月期间在广东省8个城市收集的290份牡蛎样品进行诺如病毒定性和定量检测,并对不同季节、城市及采样点诺如病毒的污染情况及基因分型情况进行比较。结果 290份牡蛎样品的诺如病毒总检出率为为17.20%(50/290),不同季节的诺如病毒污染率分别为春12.50%、夏6.90%、秋18.30%和冬30.70%;从病毒污染的不同基因型分析,GⅠ诺如病毒检出率为6.20%,GⅡ型诺如病毒检出率为11.00%。结论 广东省市售牡蛎存在诺如病毒污染,且污染具有季节特点,以冬季污染较严重,具有较高引起食源性胃肠炎疾病感染的风险,其基因型以GⅡ型为主。     

大连市首次在急性胃肠炎暴发疫情标本中检出GⅠ型诺如病毒

目的为确定引起大连市某幼儿园急性胃肠炎暴发疫情的病原体,对患儿粪便和呕吐物标本进行诺如病毒核酸检测。方法应用实时荧光RT-PCR法对12份标本进行GⅠ型和GⅡ型诺如病毒RNA检测。结果 12份患儿标本中,9份GⅠ型诺如病毒核酸阳性。结论首次在大连地区发现由GⅠ型诺如病毒引起的暴发疫情。     

应用实时荧光定量RT-PCR技术快速检测基因Ⅱ型诺如病毒

目的建立基因Ⅱ型诺如病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并应用于临床标本的检测。方法二氧化硅法提取粪便中的病毒RNA,使用针对基因Ⅱ型诺如病毒N/S结构域的引物和探针建立荧光定量PCR方法,对罗城县急性胃肠炎疫情的34份标本进行检测,并与常规RT-PCR和ELISA检测结果比较;还用该法对2006年2月至2007年1月广西急性胃肠炎暴发及散发病例粪便样本305份做了临床检测。结果用实时荧光定量RT-PCR法成功地从罗城疫情样本中检测出基因Ⅱ型诺如病毒,实时荧光定量RT-PCR、常规RT-PCR和ELISA的检出率分别为为85.3%、76.5%和26.5%。而实时荧光定量RT-PCR对114份对急性胃肠炎暴发疫情及191份散发病例样本的基因Ⅱ型诺如病毒检出率分别为56.1%和23.6%。结论诺如病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法具有快速、灵敏和特异的优点,不但能对标本中病毒浓度进行定量检测,还能鉴别诺如病毒基因型别。同时也发现基因Ⅱ型诺如病毒感染在广西急性胃肠炎暴发疫情和散发病例中较常见。     

实时逆转录环介导等温扩增检测GⅡ.4型诺如病毒的研究

目的建立快速检测诺如病毒GⅡ.4型的实时逆转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)。方法选取GⅡ.4型诺如病毒的ORF1与ORF2接头处较为保守的基因序列设计RT-LAMP引物并进行筛选,优化反应条件,分析方法的灵敏度、分析特异性和稳定性,采用优化的方法检测40例临床病毒性腹泻样本,结果与实时荧光逆转录PCR(RT-PCR)比较。结果该研究建立的诺如病毒GⅡ.4型RT-LAMP的最佳反应温度为65℃;该方法检测GⅠ型和GⅡ非诺如病毒4型、轮状病毒、札如病毒、星状病毒、腺病毒、CA16、EV71、CA6和CA10等常见10种其他腹泻病毒的结果为阴性;该方法对诺如病毒GⅡ.4型的检测能力与实时荧光RT-PCR相当;与实时荧光RT-PCR相比,该研究建立的RT-LAMP法检测诺如病毒GⅡ.4型阳性样本和诺如病毒阴性样本的符合率为100%。结论该研究建立的诺如病毒GⅡ.4型RT-LAMP快速检测方法灵敏度高,特异性好,为建立诺如病毒其他基因型的RT-LAMP检测方法奠定了基础。     

诺如病毒快速检测方法的建立及其在国境卫生检疫中的应用

目的:建立快速、特异的诺如病毒实时荧光RT-PCR与常规RT-PCR相结合检测方法,对人感染诺如病毒进行快速检测。方法:根据国外最新流行的诺如病毒核酸序列,设计并合成诺如病毒基因扩增引物及荧光标记探针,摸索最佳反应条件,制定出快速、灵敏检测诺如病毒核酸的实时荧光RT-PCR检测方法及常规RT-PCR检测方法。结果:实验证明,本方法将实时荧光RT-PCR与常规RT-PCR检测方法相结合,能在5 h内快速确认诺如病毒,检测灵敏度达到102拷贝/反应,具有快速、灵敏的特点,且具有较高的特异性和重复性。结论:本实验室利用本方法,首次在广州某国境口岸从外籍发热船员样本中检出5例输入性GGⅡ群诺如病毒。该方法对防止诺如病毒传入我国,保障我国国境卫生安全具有重要意义。     

牡蛎中GⅡ型诺如病毒快速检测方法研究

目的建立牡蛎中GⅡ型诺如病毒快速有效的检测方法,为食源性疾患疫情暴发的溯源提供可靠的实验室依据。方法梯度稀释含有GⅡ型诺如病毒的便悬液分别加入牡蛎消化道组织匀浆中,用蛋白酶K消化-PEG6000沉淀方法富集后,实时荧光RT-PCR进行终端检测,评估灵敏度及回收率。结果该方法的灵敏度为3.91×103copies/g,病毒平均回收率为6.64%。结论蛋白酶K消化-PEG沉淀法操作简单、快速,有望进一步优化后应用于不同贝类中病毒的检测。     

广州市1起诺如病毒急性胃肠炎暴发的实验室检测

目的确定1起学校急性胃肠炎暴发原因。方法采集病例粪便标本,直饮水标本,采用实时荧光定量(Real-time)PCR和RT-PCR方法检测病毒核酸,阳性标本测序分析。结果 5份粪便标本中3份呈诺如病毒阳性,2份直饮水标本均呈诺如病毒阳性。3份病例粪便标本病毒株核苷酸序列一致,均为GⅡ-4型,提示病毒同源。结论对诺如病毒进行核酸检测,证实该疫情为一起诺如病毒GⅡ-4型引起的急性胃肠炎暴发。     

GⅠ和GⅡ型诺如病毒双重荧光RT-PCR法检测

目的 建立应用Allglo探针同时检测GⅠ和GⅡ型诺如病毒的双重荧光反转录\聚合酶链反应(RT-PCR)方法.方法 设计针对GⅠ和GⅡ型诺如病毒开放阅读框架ORF1及ORF2为目的基因的引物和Allglo探针,优化最佳反应条件,建立一步法荧光RT-PCR快速检测反应体系;对该方法的特异性、抗干扰性、灵敏度进行评估,对96份临床粪便标本进行检测、测序分析.结果 该方法特异性强,与轮状病毒、扎如病毒、星状病毒、腺病毒同时检测无交叉反应;同一体系下GⅠ或GⅢ型诺如病毒相互之间没有干扰;最低检测限均为10 copies/μL;对96份临床粪便标本进行检测,结果与单重荧光RT-PCR方法符合率100％,且测序结果显示目标序列正确.结论 本研究建立的Allglo探针法检测GⅠ和G Ⅱ型诺如病毒技术特异性好,灵敏度高,可用于感染性腹泻暴发中诺如病毒的快速筛查.     

b-DNA技术在诺如病毒检测中的应用

目的 评价b-DNA技术在诺如病毒检测中的应用价值.方法 收集医院2009年6-10月肠道门诊就诊腹泻患者204例,分别采用RT-PCR和b-DNA法进行检测,比较两种方法的检出率.结果 在所检测的204例腹泻患者标本中,RT-PCR法检出26例,阳性率为12.7％,b-DNA法检出33例,阳性率为16.2％,两种方法的检出率差异无统计学意义.结论 由于b-DNA技术无需抽提纯化RNA、反转录和PCR扩增,操作步骤简单,所需实验设备条件少,具有广阔地临床应用前景.     

荧光定量RT-PCR定量检测诺如病毒方法的建立及其评价

目的:建立荧光定量RT-PCR快速检测诺如病毒GⅠ、GⅡ的方法,以用于患者标本的检测、分型及绝对定量。方法:经过优化筛选出最佳反应体系及反应条件,建立荧光定量RT-PCR快速检测诺如病毒的方法;制作两种不同型号的荧光定量PCR仪的绝对定量标准曲线,并从灵敏度、特异性、重复性、对患者标本检测能力等方面对建立的方法进行综合评价。结果:该方法在两种不同型号的仪器上对108~101copy/μl范围内的病毒,具有良好的线性关系,最低灵敏度为101copy/μl。与容易引起腹泻症状的轮状病毒、腺病毒、星状病毒、肠道病毒均无交叉反应;诺如病毒GⅠ、GⅡ两种常见感染人类的亚型之间无交叉反应。批内及批间重复性实验的标准差在0.10~0.59、变异系数在0.43%~2.84%之间,显示该方法重复性较好。用该方法共检测腹泻患者粪便标本181份,其中33份诺如病毒阳性,随机抽取10份阳性标本测序分析,结果证实均为诺如病毒。结论:本研究建立的诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法,灵敏度、特异性、重复性、对患者标本的检测能力等均显示较好的结果,且能快速区分GⅠ、GⅡ两种感染人类的重要亚型,在诺如病毒的快速检测中有着实际推广意义。     

1起诺如病毒引起的急性胃肠炎暴发调查及实验室检测分析

目的调查了解1起诺如病毒引起的急性胃肠炎暴发疫情的流行病学特点、传播途径及病原体,为制定预防控制对策提供依据。方法设立病例定义,在深圳市发生疫情的村子进行病例搜索,使用感染性腹泻个案调查表对所有搜索到的病例进行回顾性调查,并分别调查58例病例及74例对照的生活习惯;采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和实时荧光PCR方法分别对病人粪便、肛拭子标本及村民饮用的水样进行诺如病毒核糖核酸（RNA）检测,分析其流行特征及可能传播途径。结果该起疫情首例病例发病时间为2009年10月23日,疫情历时11d,共搜索到97例病例,全村罹患率为9．41％（97／1031）,以2岁以下的儿童为多,占53．1％。病例临床症状以腹泻、腹痛、腹胀、恶心、呕吐为主。病例组饮用生的山泉水及就餐前用生的山泉水冲洗碗筷的比例均高于对照组（P〈0．05或P〈0．01）;13份病例粪便和肛拭子标本中,检测出12例诺如病毒阳性,阳性率为92．3％;检测7份水样（包括1份水源水、1份水池水、3份病例家中水龙头水和2份洗碗水）,其中2份水龙头水和1份洗碗水检出诺如病毒,其余均为阴性。结论此起群体性胃肠炎暴发疫情是由诺如病毒感染引起;传播途径可能主要因水源污染和生活接触传播所致。     

天津市婴幼儿病毒性腹泻诺如病毒检测

目的研究天津市秋冬季婴幼儿腹泻患儿中诺如病毒感染的流行情况及其基因型别。方法 2008年10-12月收集天津市儿童医院住院部310例疑似病毒性腹泻的婴幼儿粪便标本,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测粪便中诺如病毒核酸,并将部分阳性株的PCR产物进行测序,采用序列分析软件分析测序结果 ,推断其毒株型别。结果 310份腹泻标本中,诺如病毒RT-PCR阳性37份(GII型37份,GI型0例),检出率为11.94%;23份PCR产物送往测序,经Genebank Blast及系统进化树分析,所有诺如病毒均为诺如病毒基因组Ⅱ型,其中GII-4/2006b占95.65%(22/23),GII-3占4.35%(1/23);感染诺如病毒的患儿多为1岁以下,且11月份检出率最高。结论诺如病毒是天津市秋冬季婴幼儿病毒性腹泻的重要病原体,2008年诺如病毒以GII-4/2006b型毒株流行为主。     

2006-2007年杭州市余杭区诺如病毒性腹泻分子流行病学研究

目的研究杭州市余杭区群发性腹泻中诺如病毒的分子流行病学特点。方法采集2006-2007年6起余杭区群发性腹泻疫情患者的粪便和肛拭子标本,采用荧光定量PCR技术进行诺如病毒检测,然后对病毒的N/S区域进行序列测定。结果6起群发性腹泻疫情都是由诺如病毒引起的,基因分析显示这些病毒都属基因Ⅱ型4组。结论诺如病毒是余杭区群发性非细菌性胃肠炎的重要病原体之一,在现阶段存在优势毒株是GII.4型,正在发生变异。     

一起老人护理院诺如病毒急性胃肠炎暴发的调查

目的调查分析1起某老人护理院诺如病毒急性胃肠炎暴发的原因,为今后老年人此类疾病的防控提供参考依据。方法采用个案调查收集病例资料,采集部分病例和工作人员肛拭子标本,运用实时荧光定量RT-PCR进行诺如病毒核酸检测。结果 21份肛拭子样本中,19份诺如病毒GⅡ犁核酸阳性,其中11份阳性为发病老人肛拭子样本,8份为工作人员肛拭子样本。结论该疫情是一起由GⅡ型诺如病毒引起感染性腹泻暴发疫情,密切生活接触及未能及时消毒是疫情暴发的主要原因。     

诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR的检测研究

目的建立特异、灵敏的诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速检测方法。方法根据GenBank诺如病毒遗传组Ⅱ型代表株保守序列设计特异引物对和TaqMan～MGB探针，调整引物、探针浓度，优化最佳反应条件，建立一步法实时荧光PCR快速检测反应体系，进行灵敏度、特异性、稳定性试验，以评价反应体系，并与引物P289／P290常规RT—PCR进行灵敏度比较。结果诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR检测时限短，仅1h就出结果；最低检出下限为100拷贝/mL，比引物P289／P290常规RT—PCR灵敏度高100倍；与轮状病毒、腺病毒、星状病毒、甲肝病毒无交叉反应；4份核酸含量不同的标本重复检测5次，平均G值变异系数范围0．96％-2．27％。结论诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速、特异、灵敏、稳定性好。可应用于突发公共卫生应急检测，提高快速检测能力。     

诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR的检测研究

目的建立特异、灵敏的诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测方法。方法根据GenBank诺如病毒遗传组Ⅱ型代表株保守序列设计特异引物对和TaqMan-MGB探针,调整引物、探针浓度,优化最佳反应条件,建立一步法实时荧光PCR快速检测反应体系,进行灵敏度、特异性、稳定性试验,以评价反应体系,并与引物P289/P290常规RT-PCR进行灵敏度比较。结果诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测时限短,仅1h就出结果;最低检出下限为100拷贝/mL,比引物P289/P290常规RT-PCR灵敏度高100倍;与轮状病毒、腺病毒、星状病毒、甲肝病毒无交叉反应;4份核酸含量不同的标本重复检测5次,平均Ct值变异系数范围0.96%～2.27%。结论诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速、特异、灵敏、稳定性好,可应用于突发公共卫生应急检测,提高快速检测能力。     

长沙地区诺如病毒基因型分析

目的确定长沙地区引起急性胃肠炎诺如病毒的类型。方法从128例腹泻患者粪便中,提取RNA。将RNA进行逆转录、扩增、测序,并通过构建基因进化树进行分析导致长沙地区患者感染的诺如病毒的主要种类。结果63个样品中含有诺如病毒,分别为GII-3、GII-4、GII-12三种类型,其中GII-4为主要病原体。结论在长沙地区,诺如病毒GII-4是引起病毒性胃肠炎的的主要致病株。GII-4基因进化快速,已成为全球范围内导致急性胃肠炎的最常见病毒株。