抗MUC1单克隆抗体C595对人卵巢癌0VCAR-3细胞增殖和凋亡的研究

  目的  探讨抗MUCI单克隆抗体C595在体外抑制高表达MUC1的人卵巢癌OVCAR-3细胞增殖并诱导其凋亡的作用。  方法  免疫荧光标记法和流式细胞术检测单克隆抗体C595标记的MUC1在OVCAR-3细胞表面的表达; MTT法、克隆形成试验检测处理后细胞生长抑制情况, TUNEL法检测细胞凋亡, EIISA检测细胞内细胞色素C和Caspase-3活性的变化。  结果  单克隆抗体C595对人卵巢癌OVCAR-3细胞具有明显的增殖抑制作用, 且呈剂量-时间依赖性, TUNEL结果表明C595(IC₅₀)可以诱导细胞凋亡。ELLSA检测显示治疗后的细胞凋亡与释放细胞色素C和Caspase-3浓度的上升相关。  结论  单克隆抗体C595可以在体外抑制人卵巢癌OvCAR-3细胞增殖并诱导其凋亡, 其机制可能与上调Caspase-3蛋白活性有关。      

卵巢癌腹腔微环境中肿瘤相关巨噬细胞表型特点及其TLR表达谱的研究

  目的  探讨卵巢癌腹水微环境中肿瘤相关巨噬细胞(TAM)浸润情况及其表型特征和TAM的Tol样受体表达情况。  方法  应用免疫组织化学方法及流式细胞术检测卵巢癌及妇科良性病变腹水中CD68+TAM及其亚型的比例情况。应用Real-timePCR检测不同亚型TAM的Tol样受体的表达情况。  结果  23例卵巢癌腹水细胞CD68+TAM平均值为73.6个/HP, 20例良性病变平均计数为50.2个/HP。两组间CD68+TAM浸润差异无统计学意义(P > 0.05)。CD68+TAM在卵巢癌及对照组腹水中所占比例无差异, 分别为31.7%和18.8%(P > 0.05)。卵巢癌腹水中M2型TAM占全部巨噬细胞54.3%, 明显高于对照组10.0%(P < 0.05);对照组M1型TAM占优势, 为53.3%, 明显高于卵巢癌组的30.5%(P < 0.01)。不同亚型巨噬细胞Toll样受体表达差异无统计学意义。  结论  卵巢癌腹腔微环境中同时存在M1和M2型TAM, 但M2型TAM在卵巢癌中占优势, 而M1型TAM在良性病变中占优势。Toll样受体不能区分M1-TAM与M2-TAM。      

抗CD47单克隆抗体制备及其促巨噬细胞吞噬作用鉴定

目的:制备可识别肿瘤细胞表达CD47蛋白的抗CD47单克隆抗体，并鉴定其抗肿瘤作用。方法:利用BL21(DE3)原核表达系统表达CD47胞外段蛋白，利用Ni-NTA层析纯化表达蛋白。免疫BALB/c小鼠，制备并筛选分泌抗CD47单克隆抗体的杂交瘤细胞株。利用正辛酸-硫酸铵沉淀方法纯化抗CD47单抗。利用流式细胞术检测纯化抗体的活性。利用巨噬细胞与肿瘤细胞共培养试验，检测抗CD47单抗的抗肿瘤作用。结果:表达并纯化了CD47胞外段蛋白，筛选到了分泌抗CD47单克隆抗体的杂交瘤细胞株—7D4，流式细胞术检测结果显示，抗体具有结合肿瘤细胞的活性，但是对不同肿瘤类型细胞的结合效率存在差异。巨噬细胞与肿瘤细胞共培养试验发现，利用抗体封闭肿瘤细胞CD47信号后，可以增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。结论:抗CD47单抗—7D4可以促进巨噬细胞的吞噬作用，具有潜在应用价值。     

LBH589对人上皮性卵巢癌OVCAR-3细胞增殖的抑制作用及机制探讨

  目的  探讨新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对人上皮性卵巢癌OVCAR-3细胞增殖抑制和促进凋亡作用及其机制。  方法  不同浓度LBH589处理细胞后, 采用噻唑蓝(MTT)比色法检测对细胞增殖的影响; AO/EB(台盼蓝、吖啶橙溴化乙啶双染色法)检测细胞凋亡; Western blot检测聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白水平。  结果  LBH589明显抑制OVCAR-3细胞增殖, 48 h半数抑制浓度(IC50)为0.12μM。Western blot检测发现Caspsae-3、PARP-85kD剪切蛋白增加, Bax表达增加, Bcl-2表达减少。  结论  LBH589在体外条件下能明显抑制卵巢癌细胞OVCAR-3细胞增殖, 诱导细胞凋亡。      

激动性CD40抗体通过调节Th1/Th2平衡增强抗肿瘤作用的机制研究

  目的  探讨激动性CD40抗体中单链抗体（CD40ScFv）和单克隆抗体（CD40mAb）抑制小鼠乳腺癌细胞生长情况及对癌组织中Th1和Th2平衡的改变，分析通过调节Th1/Th2平衡达到抗肿瘤作用的机制。  方法  将含CD40ScFv基因片段的重组质粒转化至Rosetta大肠杆菌中，诱导表达并经纯化后获得有功能的CD40ScFv蛋白，行SDS-PAGE和Western blot检测。体外培养小鼠乳腺癌4T1细胞，在Balb/C小鼠皮下成瘤建立模型，分为CD40ScFv组、CD40mAb组和生理盐水组（NS组），分别给予CD40ScFv、CD40mAb和生理盐水，观察各组小鼠肿瘤体积的变化。取出瘤体组织，ELISA法检测肿瘤组织上清中IL-12的浓度。提取肿瘤组织浸润淋巴细胞（TILs），应用流式细胞技术检测TILs中Th1与Th2的比例。  结果  诱导表达的CD40ScFv鉴定表达成功，分子大小约为27 KDa，蛋白纯化后经BCA测定浓度为1.12 mg/mL。CD40ScFv组与CD40mAb组肿瘤大小分别为（3.044±0.239）cm3与（2.749±0.261）cm 3，均小于NS组的（3.933±0.326）cm3，差异具有统计学意义（P <0.05）。CD40ScFv组、CD40mAb组肿瘤组织中IL-12浓度分别为（396.27±48.13）pg/mL、（457.63±58.37）pg/mL，均显著高于NS组的（79.51±14.97）pg/mL，差异具有统计学意义（P <0.05）。CD40ScFv组与CD40mAb组的Th1/Th2细胞比值分别为6.32±0.87与5.54±0.71，均显著高于NS组的1.79±0.38，差异具有统计学意义（P < 0.05）。  结论  激动性CD40抗体在体内通过调节Th1与Th2的比例，发挥抑制肿瘤生长的作用，其中通过促进DC活化后分泌IL-12是影响肿瘤微环境中Th1/Th2平衡的重要机制之一。      

卵巢癌腹水CD4+ CD25+调节性T细胞免疫抑制功能及机制的研究

  目的  研究卵巢癌患者腹水内CD4+ CD25+调节性T细胞（Treg）免疫抑制功能与患者临床病理特点的关系及其与患者初治及复发状态是否相关,并进一步探讨卵巢癌腹水内CD4+ CD25+调节性T细胞（Treg）发挥免疫调节性作用的具体机制。  方法  应用免疫磁珠分选法分选28例卵巢癌患者腹水内CD4+ CD25+调节性T细胞及CD4+ CD25- T细胞,采用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein succinimidylester,CFSE）标记CD4+ CD25- T细胞,CD4+ CD25+ Treg与自体CFSE标记CD4+ CD25- T细胞以1:1比例共培养,经流式检测CFSE表达及Modfit软件分析CD4+ CD25- T增殖指数（PI）,计算各标本内Treg对自体CD4+ CD25- T细胞增殖抑制率。应用中合性抗IL-10抗体及中合性抗TGF-β1抗体探究腹水内CD4+ CD25+ Treg介导免疫逃逸作用是否通过抑制性细胞因子IL-10或TGF-β1发挥作用。  结果  Ⅲ~Ⅳ期卵巢癌腹水内CD4+ CD25+ Treg对自体CD4+ CD25- T细胞增殖抑制率为（75.72±17.04）%,较Ⅰ~Ⅱ期Treg抑制率（59.61±16.97）%显著增强（P < 0.05）。复发卵巢癌患者腹水内Treg对自体CD4+ CD25- T细胞增殖抑制率为（85.89±7.07）%,较初治卵巢癌患者腹水Treg抑制率（52.82±8.18）%显著增强（P=0.000 1）。共培养体系内加入中合性抗IL-10抗体或/及中和性抗TGF-β1抗体,Treg对自体CD4+ CD25- T细胞增殖抑制率较对照组均显著降低（P < 0.05）。  结论  卵巢癌腹水内CD4+ CD25+ Treg介导免疫逃逸能力与肿瘤分期及复发、初治状态相关,且发挥免疫逃逸作用可能是与分泌抑制性细胞因子IL-10及TGF-β1有关。      

消癌平注射液下调MMP-9基因表达抑制卵巢癌细胞Caov-3迁移机制的研究

  目的  研究中药消癌平注射液下调MMP-9基因表达, 抑制卵巢癌细胞Caov-3迁移的机制。  方法  利用消癌平注射液干预体外培养的卵巢癌Caov-3细胞, 分别应用: 细胞划痕实验观察细胞的迁移水平; 肿瘤细胞侵袭实验(Transwell 小室法)观察细胞侵袭能力; RT-PCR实验检测卵巢癌细胞中金属蛋白酶MMP-9基因表达水平。以金属蛋白酶MMPs特异性抑制剂-Doxycyclin作为阳性对照, 同时应用PBS作空白对照。  结果  消癌平可有效抑制Caov-3细胞迁移, 与空白对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05), 但与Doxycyclin组差异无统计学意义(P > 0.05);消癌平还可部分抑制血清诱导的Caov-3细胞穿过Transwell小室, 其抑制效果与Doxycyclin相似; 此外, 消癌平还能够下调MMP-9基因表达水平。  结论  消癌平下调MMP-9基因表达, 抑制卵巢癌Caov-3细胞迁移。      

CD3AK细胞对人卵巢癌细胞系体外杀伤作用的实验研究

为研究卵巢癌盆腔引流淋巴结的淋巴细胞,经CD3单克隆抗体激活后的杀伤细胞CD3AK在体外的抗瘤作用.作者采用人卵巢癌病人盆腔引流淋巴结的淋巴细胞,在体外与CD3单抗和少量rIL-2诱导并激活后,在我所自建的两株人卵巢癌HO-891O、HO-89lOPM细胞系上进行了研究.两株细胞各随机分成6组:1)阴性对照组(A组):只加新鲜的全培养液 ; 2)低浓度CD3AK组(B组):5×10~5/ml CD3AK培养液;3)中浓度CD3AK组(C组):1×10~6/mlCD3AK培养液;4)高浓度CD3AK组(D组):2.5×10~6/mlCD3AK培养液;5)顺铂阳性对照组(E组):含10μg/ml顺铂的培养液;6)顺铂 CD3AK联合用药组(F组):含10μg/ml顺铂 1×10~6/mlCD3AK培养液,分别用LDH活性测定、自然杀伤率及台盼兰活细胞计数法观察结果.结果表明:CD3AK细胞对卵巢癌细胞有明显的杀伤作用,两株细胞均以中浓度CD3AK细胞     

卵巢癌细胞PI3K/AKT通路与肾上腺髓质素促迁移作用的相关性研究

  目的  检测PI3K/AKT信号通路在肾上腺髓质素(AM)促卵巢癌细胞HO8910迁移中的作用。  方法  利用划痕实验检测外源性AM对卵巢癌细胞HO8910迁移功能的影响, 并且检测PI3K抑制剂Wortmannin对AM促进卵巢癌细胞迁移功能的干扰。为进一步研究AM对AKT磷酸化的影响, 应用蛋白印迹法检测细胞AKT蛋白磷酸化的表达, 应用整合素α5β1抑制性抗体(mAb)拮抗AM对卵巢癌细胞AKT磷酸化作用。  结果  外源性AM处理的卵巢癌细胞12 h迁移率(62.83±4.46)%明显高于正常卵巢癌细胞的迁移率(30.26±1.55)%(P < 0.001), PI3K抑制剂Wortmannin干扰1 h后再用Am处理12 h, 细胞迁移率为(40.44±0.88)%, 明显低于单纯应用AM刺激的细胞(P=0.001)。AM可以促进卵巢癌细胞迁移(P < 0.001), PI3K抑制剂Wortmannin可以拮抗AM的促迁移作用(P=0.001)。AM可以促进细胞AKT蛋白磷酸化, Wortmannin、整合素α5β1抑制性抗体均可以干扰AM对AKT蛋白磷酸化作用。  结论  在卵巢癌HO8910细胞中, PI3K/AKT的活化是AM促进卵巢癌细胞迁移重要机制, 而整合素α5β1可能作为感受器参与AM促进细胞PI3K/AKT通路的活化。      

卵巢癌中PGRMC1基因表达与微血管密度的关系

  目的  检测人卵巢癌组织中PGRMC1（progesterone receptor membrane component-1）基因表达情况,探讨PGRMC1基因在卵巢癌发生发展过程中的作用。  方法  利用免疫组织化学方法检测78例不同病变卵巢组织蜡块中PGRMC1基因及蛋白表达情况;以TBP（TATA box binding protein）为内源性对照基因,利用实时定量PCR方法检测了10例正常新鲜卵巢组织和30例新鲜卵巢癌组织中PGRMC1基因的mRNA表达水平。  结果  采用免疫染色强度加着色面积的积分标准判断免疫组织化学结果,与正常卵巢（0.20±0.71）及卵巢良性肿瘤组（0.75±1.12）相比,卵巢交界性肿瘤中PGRMC1蛋白表达（3.60±1.14）和卵巢癌（7.30±2.12）显著增高（P < 0.01）。实时定量PCR方法证实卵巢癌组PGRMC1 mRNA表达（3.526±1.386）显著高于良性卵巢病变组（0.936±0.725）（P < 0.01）,是良性卵巢病变组织表达的3.51倍。PGRMC1蛋白阳性表达的卵巢组织中,正常卵巢组MVD为（18.6±6.7）条;良性卵巢病变组MVD为（20.9±7.9）条;交界性卵巢肿瘤组MVD为（22.4±4.7）条;卵巢癌组MVD为（28.4±8.1）条,卵巢癌组与正常卵巢组、良性卵巢肿瘤组间差异有统计学意义（P < 0.01）。  结论  PGRMC1高表达可能与卵巢癌的发生、发展有关,并可能促进血管生成。      

长链非编码RNA FOXD2-AS1对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响

  目的  观察长链非编码RNA（lncRNA）FOXD2-AS1对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响。  方法  收集2017年2月至2017年9月华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院（武汉市妇幼保健院）手术切除的16例卵巢癌患者的组织标本,采用荧光实时定量聚合酶链式反应（quantitative PCR,qPCR）检测组织标本、人卵巢癌细胞系及人正常卵巢上皮细胞系中的FOXD2-AS1表达水平。将HO-8910细胞分为实验组和对照组,分别转染siRNA-FOXD2-AS1和阴性对照RNA。细胞计数CCK-8法、Transwell迁移实验分别检测沉默FOXD2-AS1表达对卵巢癌HO-8910细胞增殖活性和迁移能力的影响。生物信息学方法预测FOXD2-AS1的下游靶基因,qPCR检测下游靶基因表达,Western blot法检测葡萄糖调节蛋白94（glucose regulated protein94,GRP94）和信号通路Wnt/β-catenin的蛋白表达。  结果  卵巢癌组织中的FOXD2-AS1相对表达量8.56±0.51明显高于正常癌旁组织的2.38±0.21（P < 0.01）,FOXD2-AS1在卵巢癌细胞系OC3、HO-8910、A2780、SKOV-3中表达明显增加（P < 0.05）。下调FOXD2-AS1表达明显抑制卵巢癌HO-8910细胞的增殖活性和迁移能力（均P < 0.01）。生物信息学方法显示,FOXD2-AS1靶向结合miR-150-5p后,可靶向结合GRP94基因。实验组和对照组miR-150-5p相对表达量分别为5.45±0.91和1.01±0.08（P < 0.01）,GRP94 mRNA相对表达量分别为0.32±0.05和1.02±0.11（P < 0.01）。GRP94和Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达减少。  结论  FOXD2-AS1在卵巢癌组织和细胞系呈高表达,下调FOXD2-AS1可调控miR-150-5p表达,抑制卵巢癌HO-8910细胞的增殖和迁移,可发挥抑癌基因的功能。      

融合基因CDglyES重组腺病毒对卵巢癌细胞抑制作用的体外研究

  目的  构建含CDglyES融合基因的重组腺病毒,体外观察其对人卵巢癌细胞的直接抑制作用及其对血管内皮细胞生长的抑制作用。  方法  用细菌内同源重组方法构建腺病毒穿梭质粒prAdCDglyES。采用脂质体介导转染293包装细胞,扩增获取重组腺病毒rAdCDglyES。采用MTT法观察rAdCDglyES对卵巢癌细胞SKOV-3生长抑制的影响,同时观察其表达产物抑制脐静脉血管内皮细胞ECV-304增殖的作用。  结果  纯化的rAdCDglyES滴度是1×1013.3 TCID50/L,其对SKOV-3细胞生长抑制率是（83.1±6.3）%,与对照组rAd-LacZ（24.1±13.2）%相比有显著性差异（P < 0.01）。浓缩的转染rAdCDglyES的细胞培养上清液抑制ECV-304细胞增殖,抑制率是（78.7±1.6）%,而同样浓缩的转染rAd-CD的细胞培养上清液抑制率是（23.9±9.7）%,二者有显著性差异（P < 0.01）。  结论  研究结果表明重组腺病毒rAdCDglyES具有体外直接和间接抑制人卵巢癌细胞效能。      

IGF-ⅠTGF-β1在卵巢上皮性肿瘤中的表达及与微血管密度的关系

  目的  检测卵巢上皮性肿瘤中胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)、转化生长因子(TGF-β1)的表达及肿瘤微血管密度(MVD), 分析其与卵巢癌临床病理特征的关系。  方法  收集天津市中心妇产科医院2005年12月至2010年5月间诊治的卵巢癌35例, 交界性肿瘤31例, 良性肿瘤30例, 正常卵巢组织20例。通过免疫组织化学法检测IGF-Ⅰ及TGF-β1的表达与MVD。  结果  上皮性卵巢癌中IGF-Ⅰ及TGF-β1的表达显著高于交界性肿瘤、良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织(P < 0.05);1GF-Ⅰ与卵巢癌组织学分级及腹水形成相关(P < 0.05), TGF-β1与腹水形成相关(P < 0.05);MVD与临床分期、组织分级、腹水形成相关(P < 0.05)。IGF-Ⅰ和TGF-β1在各组中的表达存在正相关(r=0.68, P < 0.05);IGF-Ⅰ、TGF-β1的表达与MVD均值存在显著正相关(r=0.45, P=0.01;r=0.39, P=0.02);IGF-Ⅰ、TGF-β1阳性组无瘤生存率及总生存率均有下降的趋势, 但差异无统计学意义(P>0.05)。  结论  上皮性卵巢癌中, IGF-Ⅰ、TGF-β1的表达与MVD呈正相关。IGF-Ⅰ、TGF-β1和MVD形成在上皮性卵巢癌的发病机理中起着重要作用。      

Solid-phase Anti-CD3 Antibody Activation and Cryopreservation of Human Tumor-infiltrating Lymphocytes Derived from Epithelial Ovarian Cancer

The effect of solid-phase anti-CD3 antibody activation and cryopreservation was evaluated on thirteen samples of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) derived from epithelial ovarian cancer. Seven preparations of TILs were cultured with or without solid-phase anti-CD3 antibody in addition to 100 units/ml of recombinant interleukin-2 (rIL-2). The proliferation rate of all of the seven TIL preparations stimulated by anti-CD3 antibody on the fourth or fifth day of culture was 3.4 to 9.8 times greater than that of lymphocytes cultured with rIL-2 alone. Furthermore, in an experiment with five TIL samples activated with anti-CD3 antibody, three of them showed augmented cytotoxic activity against autologous fresh tumor cells. The population of CD3⁺/CD8⁺ TILs was increased after 4–5 weeks of cultivation and CD8⁺ lymphocytes amounted to over 70% in all of seven preparations tested, whereas two of seven preparations not activated by anti-CD3 antibody were CD3⁺/CD4⁺-dominant. In addition, nine preparations of TILs cultured with rIL-2 were cryopreserved for several weeks; after recovery from cryopreservation, no major change was observed in cell surface markers, in growth rate or in cytotoxic activity. These results suggest that cryopreserved and/or anti-CD3 antibody-activated lymphocytes could conveniently be employed in a clinical trial of adoptive immunotherapy employing TIL.     

人淋巴管内皮细胞对卵巢癌淋巴结定向转移细胞分泌蛋白表达的分析

  目的  初步探讨人淋巴管内皮细胞(HLEC)对卵巢癌淋巴结定向转移细胞(SKOV3-PM4)分泌蛋白的影响。  方法  将细胞体系分为4组(A组:SKOV3;B组:SKOV3 + HLEC;C组:SKOV3-PM4;D组:SKOV3-PM4 + HLEC),采用抗体芯片和iTRAQ-2D-LC-MALDI-TOF/TOF/MS方法检测各组细胞培养基中的蛋白,筛选出差异明显的分泌蛋白,对其行生物信息学分析,并采用ELISA方法在人血清标本和细胞培养基中进行验证。  结果  抗体芯片与质谱分析结果提示,C组与A组相比、D组与C组相比Progranulin(GRN)、VEGFA表达上调,SPARC、IGFBP7表达下调。经过综合生物信息学分析,IGFBP7和VEGFA联系紧密,相互影响。与正常组血清相比,VEGFA在卵巢癌中的表达最高,IGFBP7表达最低,差异有统计学意义(P < 0.05)。  结论  淋巴结定向转移与淋巴管内皮细胞微环境关系密切,共培养后的差异蛋白涉及到基质细胞蛋白、细胞黏附作用因子等方面。其中VEGFA、GRN的表达上调及SPARC、IGFBP7的表达下调与卵巢癌淋巴结定向高转移密切相关。      

Efficacy of anti-CD47 antibody-mediated phagocytosis with macrophages against primary effusion lymphoma

BackgroundRecently, the critical role of CD47 on the surface of resistant cancer cells has been proposed in their evasion of immunosurveillance. Primary effusion lymphoma (PEL) is a subtype of aggressive non-Hodgkin lymphoma that shows serous lymphomatous effusion in body cavities, especially in advanced acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). PEL is resistant to conventional chemotherapy and has a poor prognosis. In this study, we evaluated the effect of anti-CD47 antibody (Ab) on PEL in vitro and in vivo.MethodsSurface CD47 of PEL cell lines was examined by flow cytometry. Efficacy of knocking down CD47 or anti-CD47 Ab-mediated phagocytosis against PEL was evaluated using mouse peritoneal macrophages and human macrophages in vitro. Primary PEL cells were injected intraperitoneally into NOD/Rag-2/Jak3 double-deficient (NRJ) mice to establish a direct xenograft mouse model.ResultsSurface CD47 of PEL cell lines was highly expressed. Knocking down CD47 and anti-CD47 Ab promoted phagocytic activities of macrophages in a CD47 expression-dependent manner in vitro. Treatment with anti-CD47 Ab inhibited ascite formation and organ invasion completely in vivo compared with control IgG-treated mice.ConclusionCD47 plays the pivotal role in the immune evasion of PEL cells in body cavities. Therapeutic antibody targeting of CD47 could be an effective therapy for PEL.