MSP法检测胃癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化改变

目的:探讨抑癌基因RASSF1A启动子区CpG岛甲基化与胃癌及临床病理特征的关系.方法:采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)法检测60例胃癌组织及相应癌旁组织和30例对照组织中RASSF1A基因启动子区甲基化状态.结果:胃癌组织中RASSF1A基因启动子区CpG岛甲基化率为65.0%(39/60),显著高于癌旁组织6.7%(4/60),及对照组0%(0/30)(P＜0.01).胃癌组织中不同年龄、性别、分化程度及淋巴结转移与否的RASSF1A基因甲基化率的差异均无统计学意义.结论:胃癌中RASSF1A基因启动子区的高甲基化提示其与胃癌的发生密切相关,MSP法对RASSF1A基因启动子区甲基化的检测有望成为胃癌早期监测的重要方法.     

PTEN基因甲基化及其表达异常与胃癌的关系

目的：探讨PTEN基因表达、启动子区甲基化与胃癌及其临床病理特征的关系。方法：采用甲基化特异性PCR法（MSP）和逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法，分析胃癌组织及相应癌旁正常组织中PTEN基因启动子区甲基化及其mRNA表达情况。结果：48．2％（27／56）的胃癌组织和3．6％（2／56）的癌旁胃组织PTEN基因启动子区发生甲基化．癌组织PTEN基因启动子区甲基化率显著增高（P〈0．05）：其中，2例甲基化癌旁胃组织均为胃癌组织中有甲基化的病例．发生淋巴结转移的29例胃癌组织中．19例PTEN基因启动子甲基化；发生淋巴结转移的PTEN基因启动子甲基化显著高于无淋巴结转移组（P〈0．05）。RT—PCR结果显示，所有甲基化的胃癌组织中PTEN mRNA均无表达，结论：胃癌中PTEN基因mRNA失表达与其启动子区甲基化有关，这可能是胃癌发生、发展以及转移的原因之一。     

胃癌组织hMLH1启动子甲基化是造成其蛋白表达降低的主要原因

目的：通过研究胃癌中错配修复基因hMLH1启动子区5CpG岛甲基化及蛋白表达情况，探讨hMLH1启动子Ⅸ甲基化对蛋白表达的影响及在胃癌发病中的作用。方法：收集诊断明确且未经放化疗的胃癌手术切除标本41例及同病例癌旁黏膜。应用免疫组化SP法检测标本hMLH1蛋白表达情况。应用甲基化特异性PCR（MSP）榆测标本hMLH1启动子区甲基化情况。结果：胃癌组与癌旁组，hMLH1蛋白阳性表达率分别为58．54％（24／41）和80．49％（33／41）（P〈0．05）；启动子甲基化率分别为80．49％（33／41）和24．39％（10／41）（P〈0．05）；完全甲基化率分别为41．46％（17／41）和19．51％（8／41）（P〈0．05）；部分甲基化率分别为39．02％（16／41）和4．88％（2／41）（P〈0．05）。无论胃癌组织还是癌旁组织，完全甲基化病例均出现hMLH1蛋白表达缺失，部分甲基化病例和启动子未甲基化病例均有hMLH1蛋白表达。hMLHI基因启动子甲基化率与胃癌患者性别、年龄、癌组织分化程度、浸润深度和淋巴结转移均无明显相关性（P〉0．05）。结论：hM—LH1基因启动子甲基化是导致hMLH1蛋白表达降低的主要原因；胃黏膜hMLH1蛋白表达降低有助于胃癌的预警。     

HHIP基因CpG岛高甲基化水平参与胃癌的发生

目的：观察人胃癌、癌旁组织与胃癌AGS细胞中人音猬因子相互作用蛋白（human hedgehog interacting protein,HHIP）基因启动子区域CpG岛的甲基化水平,探索其与胃癌发生的关系。方法：RT-PCR检测30例人胃癌组织、癌旁组织及AGS细胞中HHIP mRNA的表达,免疫组织化学方法和甲基化特异性PCR（methylation specific PCR,MSP）分别检测胃癌组织和癌旁组织的HHIP表达和HHIP基因启动子区域甲基化状态。AGS细胞予甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-2′-deoxycitydine,5-Aza-dc）处理前后,RT-PCR、MSP和硫化测序PCR（bisulfite sequencing PCR,BSP）分别检测AGS细胞中HHIP mRNA表达、启动子区域甲基化水平变化、CpG岛甲基化位点数量的变化;分析HHIP基因启动子区CpG岛甲基化水平变化与HHIP mRNA表达水平变化之间的相关性。结果：胃癌组织中的HHIP mRNA（0.82± 0.38 vs 1.60±0.26,P=0.000）和蛋白（0.51±0.03 vs 0.83±0.27,P<0.05）的表达均低于癌旁组织,并且与年龄、性别、TNM分期、分化程度、淋巴结转移均无显著相关性（均P>0.05）。癌旁组织中HHIP基因启动子区甲基化水平显著低于胃癌和AGS细胞\[（17.7±3.59）% vs （62.9±614）%、（99.7±0.67）%,均P<0.05\]。AGS细胞在5-Aza-dc干预后HHIP mRNA表达明显增高（4.68±022 vs 0.21±012,P<0.01）,HHIP基因启动子区甲基化水平明显下降\[（10.1±0.21）% vs （90.2±0.67）%,P<0.01\], CpG岛甲基化位点明显减少,并且HHIP基因启动子区甲基化水平与mRNA表达呈负相关（r=-0.693,P=0.00）。结论：HHIP基因启动子区CpG岛的高甲基化水平可能通过抑制HHIP基因表达参与胃癌的发生。     

非小细胞肺癌组织中3p区抑癌基因启动子的甲基化

目的：探讨3p位点上3个抑癌基因RASSF1α、RAR-β和FHIT启动子甲基化在非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer．NSCLC）组织中的作用。方法：应用甲基化特异的PCR（methyl-specific PCR，MSP）和RTPCR方法分别测定53例NSCLC组织中RASSF1α、RAR-β和FHIT的甲基化率与转录水平。结果：NSCLC癌组织和癌旁组织中的甲基化率分别是FHIT为53％和8％，RAR-β为42％和6％，RASSF1α为57％和9％；FHIT、RASSF1α的甲基化率在吸烟指数〉400年支组高于≤400年支组（P值分别为0．004与0．008）；FHIT、RASSF1α的甲基化率Ⅱ期高于Ⅰ期（P值分别为0．016与0．008），Ⅲ期高于Ⅱ期（P值分别为0．033与0．029）。结论：3P位点RASSF1α、RAR-β和FHIT基因甲基化的发生与NSCLC的病理生理密切相关，而启动子CpG岛甲基化是导致转录沉默的重要机制。     

上皮性卵巢肿瘤RASSF1A基因甲基化与蛋白表达的关系及意义

目的：检测上皮性卵巢肿瘤中RASSF1A基因启动子CpG岛的甲基化状态,并探讨基因异常甲基化与蛋白表达的关系及其意义。方法：运用甲基化特异性PCR（MSP）方法对62例上皮性卵巢癌、21例交界性囊腺瘤及30例良性囊腺瘤的RASSF1A基因启动子甲基化状态进行检测,免疫组化S-P法检测上述标本中RASSF1A蛋白表达,并结合肿瘤生物学行为进行分析。结果：上皮性卵巢癌组织、卵巢交界性囊腺瘤组织中RASSF1A基因启动子区甲基化率（58.06%、42.85%）显著高于卵巢良性囊腺瘤组织（13.33%）,差异有统计学意义（P〈0.05）。RASSF1A基因启动子区甲基化与上皮性卵巢癌的细胞分化程度和临床分期密切相关（P〈0.05）而与组织类型和患者年龄及绝经与否无相关性（P〉0.05）;RASSF1A基因甲基化与其蛋白表达下降一致。结论：卵巢癌组织中存在RASSF1A基因启动子CpG岛的异常甲基化,可能和该蛋白表达缺失的主要原因,是导致该基因失活的重要机制之一。     

卵巢上皮性恶性肿瘤组织RASSF1A基因启动子区甲基化的研究

目的 探讨RASSF1A基因启动子区异常甲基化与卵巢上皮性恶性肿瘤发生、发展的关系。方法 应用甲基化特异性PCR方法,检测80例卵巢上皮性恶性肿瘤组织RASSF1A基因启动子区异常甲基化。结果 80例卵巢上皮性恶性肿瘤组织中,RASSF1A基因启动子区甲基化的发生率为52．5％,而相应痛旁正常组织中,RASSF1A基因启动子区均未发生甲基化（P〈0．05）。浆液性癌、黏液性癌和内膜样癌中,RASSF1A基因启动子区甲基化的发生率分别为54．2％、52．4％和45．5％,差异尤统计学意义。临床Ⅰ期、Ⅱ期卵巢上皮性恶性肿瘤RASSF1A基因启动子区甲基化的发生率分别为21．4％和16．7％,明显低于临床Ⅲ期（66．7％）和Ⅳ期（77．8％）。高分化组和中分化组RASSFlA基因启动子区甲基化的发牛率分别为34．5％和35．0％,均低于低分化组（80．6％）。结论 卵巢上皮性恶性肿瘤组织中存在RASSF1A基因启动子区的异常甲基化,甲基化与卵巢上皮性恶性肿瘤的临床分期和组织学分级有关。     

胃癌BRCA1基因甲基化与BRCA1 mRNA表达的关系研究

目的：探讨乳腺癌易感基因1（BRCA1）启动子CpG岛甲基化与BRCA1 mRNA表达的相关性及其意义。方法采用甲基化特异性PCR技术检测37例胃癌组织和对应癌旁组织及6例正常胃组织中BRCA1基因启动子CpG岛甲基化状态;采用逆转录PCR技术检测37例胃癌组织和对应癌旁组织及6例正常胃组织中BRCA1 mRNA 表达水平。结果胃癌组织中 BRCA1基因启动子 CpG 岛总甲基化率为48.6%（18/37）,显著高于癌旁组织[5.4%（2/37）]和正常胃组织[0.0%（0/6）],差异有统计学意义（χ2=17.541、5.021,P均〈0.05）。胃癌组织中BRCA1 mRNA阳性表达率为48.6%（18/37）,显著低于癌旁组织[94.6%（35/37）]和正常胃组织[100.0%（6/6）],差异有统计学意义（χ2=19.215、5.520,P均〈0.05）。BRCA1基因启动子CpG岛甲基化与BRCA1 mRNA表达成负相关（ r=-0.515,P〈0.05）。结论 BRCA1基因启动子CpG岛甲基化可能是导致BRCA1 mRNA失表达的主要原因之一。     

胃癌环氧化酶-2 、hMLH1 及hMSH2 微卫星不稳定与基因调控的关系

 目的 检测临床手术切除43例胃癌及相应正常组织COX-2、hMLH1和hMSH2微卫星不稳定状态MSI及三种基因启动子甲基化情况，并进一步探讨它们与胃癌发生的关系。方法 采用聚合酶链反应（PCR）技术检测5个位点的MSI状态；甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR，MSP）方法检测胃癌及正常组织COX-2、hMLH1及hMSH2三种基因启动子CpG岛甲基化状态。结果 43例胃癌中MSI总检出率为48．84％（21／43），五个位点的MSI检出率无显著差别。COX-2和hMLH1基因启动子CpG岛甲基化在43例胃癌中分别有8例和13例，正常组织中未检测到。hMSH2基因启动子CpG岛在胃癌及正常组织中均未检测到甲基化。在MSI-H组hMLH1基因启动子CpG岛甲基化率显著高于MSS组（P〈0．01）；而在MSI-H和MSI-L组间以及MSI-L和MSS无差别。MSI-H组中COX-2基因启动子CpG岛甲基化8例，且有7例胃癌同时出现hMLH1和COX-2基因启动子CpG岛甲基化。结论 在MSI胃癌（尤其是MSI-H型胃癌）的发生、发展过程中可能同时出现了hMLH1和COX-2基因启动子CpG岛的甲基化（即表型遗传修饰）。MSI胃癌hMLH1基因启动子CpG岛甲基化率高于MSS胃癌，提示检测hMLH1基因启动子CpG岛甲基化对于判断肿瘤类型有一定意义。     

RASSF1A在胃癌中的甲基化检测及表达

目的:探讨RASSF1A基因在胃癌及癌前病变组织中的表达及与启动子区甲基化的关系.方法: RT-PCR方法检测40例胃癌、20例中-重度慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生和不典型增生组织及20例癌旁正常组织RASSF1A mRNA表达,甲基化特异性PCR方法检测RASSF1A启动子区CpG岛甲基化状态;Western blot方法检测RASSF1A蛋白表达.结果: RASSF1AmRNA和蛋白表达水平在胃腺癌组织中明显低于中-重度慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生和不典型增生组及癌旁正常组织;RASSF1A在胃癌组织、中-重度慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生和不典型增生组织和正常组织中的甲基化频率分别为80%、25%和5%, 差异有显著性 (P<0.01);在胃癌组织中,RASSF1A mRNA阳性表达组甲基化明显低于表达缺失组.结论: 胃癌组织RASSF1A mRNA和蛋白表达缺失或低下与其启动子甲基化程度增高有关,启动子甲基化参与了胃癌的发生发展.     

抑癌基因RASSF1A mRNA在胃癌中的表达及临床意义

目的：检测抑癌基因RASSF1A mRNA在胃癌中的表达情况,探讨RASSF1A在胃癌发生发展中的作用及临床意义。方法：采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分别检测40例胃癌及40例配对的癌旁组织（距癌2 cm）和40例配对远离胃癌的手术切缘正常组织（距癌5cm以上）RASSF1A mRNA的表达水平。结果：RASSF1A mRNA在胃癌中表达的阳性率（35%）显著低于癌旁组织（87.5%）和正常组织（100%）（P均〈0.05）,癌旁组织明显低于正常组织（P〈0.05）,且早期胃癌RASSF1A mRNA表达明显高于进展期胃癌（P〈0.05）。结论：在原发性胃癌组织中,RASSF1A mRNA表达明显缺失或低下,且与胃癌临床分期显著相关。     

RAS相关家族1A基因在胃癌中的表达和启动子甲基化

目的分析散发性胃癌中RAS相关家族1A基因(RASSF1A基因)的表达、突变和启动子甲基化状况,探讨RASSF1A基因在胃癌发生、发展中的意义.方法采用定量PCR、RT-PCR和SSCP的检测90例胃癌组织和30例相应癌旁正常组织中RASSF1A基因表达水平以及基因突变的情况;采用甲基化特异性PCR (MSP)方法检测RASSF1A基因启动子甲基化情况.结果 90例胃癌中有52例(57.8%)RASSF1A无表达或表达低下.RASSF1A无表达或表达低下和肿瘤细胞的分化(P<0.05)以及分期(P<0.001)相关,但是和肿瘤的浸润深度以及淋巴结转移不相关(P>0.05).90例胃癌中52例启动子发生甲基化(57.8%),其中90.3%(47/52)的RASSF1A无表达或表达低下组织中检测到RASSF1A基因启动子的甲基化,然而癌旁正常组织未发现有RASSF1A基因启动子的甲基化,SSCP没有发现任何突变.结论胃癌中存在较多的启动子异常甲基化造成RASSF1A基因失活,这可能是胃癌发生发展的因素之一.     

Methylation of ras association domain protein 10 (RASSF10) promoter negative association with the survival of gastric cancer

Objective: The present study was conducted to elucidate the prognostic prediction value of the methylation of the RASSF10 promoter in gastric cancer (GC). Methods: A total of 300 patients with GC revealed the methylation degrees of the DNA of the RASSF10 promoter. Methylation-specific PCR (MSP) analysis was performed to qualitatively detect the methylated degrees of the DNA of the RASSF10 promoter of 300 patients with GC. Associations between molecular, clinicopathological and survival data were analyzed. Results: The protein and mRNA expressions of RASSF10 in GC tissues were lower than those in normal gastric mucosal tissues. In the MSP analysis cohort, patients with methylated RASSF10 promoter exhibited significantly shorter median OS than those with unmethylated RASSF10 promoter (P < 0.001). Multivariate survival analysis results showed that methylated RASSF10 promoter was an independent predictor of the survival of patients with GC. Conclusions: The methylation of the RASSF10 promoter could be applied for the clinical prediction of the prognosis of GC.     

乳腺癌患者外周血及癌组织RASSF1A基因甲基化水平检测临床意义分析

目的：观察乳腺癌、乳腺良性肿瘤患者组织及血浆中RASSFlA基因启动子区异常甲基化状态,并探讨其临床意义。方法：应用甲基化特异性PCR检测2011—06—01—2012—12-31潍坊市人民医院116例乳腺癌和85例乳腺良性肿瘤患者组织及血浆中RASSFlA基因甲基化状态,分析其与患者临床病理因素的关系。结果：116例乳腺癌组织RASSFlA基因启动子甲基化率为71．55％（83／116）,血浆中RASSFlA甲基化率为53．45％（62／116）。85例良性肿瘤组织RASSFlA基因启动子甲基化率为12．94％（11／85）,血浆中未检测出甲基化的RASSFIA。癌组织中RASSFIA甲基化与患者年龄（．）x^2=0．008,P=0．930）、病理类型（x^2=0．010,P=0．995）、临床分期（x2=0．216,P=0．642）和淋巴结转移（x2=0．007,P=0．933）不相关,差异无统计学意义;而血浆RASSFlA甲基化与患者临床分期（x^2=4．796,P=0．029）、淋巴结转移（x^2=5．163,P=0．023）相关,差异有统计学意义。血浆RASSFlA启动子甲基化鉴别诊断乳腺癌与乳腺良性肿瘤的灵敏度为53．45％,特异度为100．00％,准确度为73．13％。结论：乳腺癌患者RASSFlA基因甲基化水平明显升高,检测血浆中RASSFIA基因启动子区甲基化水平有助于乳腺癌与乳腺良性肿瘤的鉴别诊断。     

组蛋白修饰对喉癌细胞系中RASSF1A基因表达的影响

目的：探讨喉癌细胞中RASSF1A基因表达水平与基因组蛋白修饰的关系。方法：应用染色质免疫沉淀技术（ChIP）和实时定量逆转录聚合酶链反应（Realtime-PCR）分析喉癌Hep-2细胞系在以下药物：5-氮杂-2＇-脱氧胞苷（5-Aza-2＇-deoxyeytidine,5-Aza-dC,DNA甲基转移酶抑制剂,5-AZa-dC）;曲古抑菌素A（TriChostatinA,TSA,组蛋白去乙酰化酶抑制剂）作用前后RASSF1A基因启动子区域组蛋白H3-K9甲基化、H3-K4甲基化、H3-K9乙酰化和RASSF1A基因表达情况。结果：TSA能轻度降低RASSF1A基因启动子区域组蛋白H3-K9甲基化水平、轻度提高H3-K4甲基化水平、明显提高H3-K9乙酰化水平。5-Aza-dC明显降低启动子区域H3-K9甲基化程度、明显提高H3-K4甲基化水平、提高H3-K9乙酰化水平,联合给予5-Aza-dC和TSA起协同增效作用。H3-K9甲基化水平降低、H3-K4甲基化和H3-K9乙酰化水平提高可使RASSF1A基因表达上调。结论：喉癌细胞中RASSF1A肿瘤抑制基因表达下调与其启动子区H3-K9甲基化、H3-K4甲基化和H3-K9乙酰化相关。甲基化抑制剂及乙酰化制剂均可使表达下调的基因表达上调。     

新疆哈萨克族食管鳞癌组织Smad4基因启动子甲基化的检测

目的：检测新疆哈萨克族食管鳞癌组织中抑癌基因Smad4启动子区的甲基化状态,并描述其在哈萨克族食管鳞癌发生和发展中的作用。方法：应用MassARRAY技术平台检测2009—01-01—2011—10-31新源县人民医院收集的新疆食管癌高发区-伊犁哈萨克自治州哈萨克族食管鳞癌组织37例和当地正常人食管组织33例中Smad4基因启动子的甲基化状态。结果：哈萨克族食管癌组与对照组中Smad4基因启动子的12个CpG单位,6-甲基化率的平均值分别为40．07％和30．15％,差异有统计学意义,Z=-2．611,P=0．01】。哈萨克族食管鳞癌组织和正常人食管组织中Smad4基因启动子区CpG-1的平均甲基化水平分别为1．7％和O．7％,z=-2．2,P=0．028;CpG-16—19的平均甲基化水平分别为4．5％和2．2％,z=-3．3,P=0．001;CpG-27—28的平均甲基化水平分别为4．9％和3．0％,z=-2．6,P=0．007;CpG-31—33的平均甲基化水平分别为6．8％和5．5％,z=-2．5,P=0．012。结论：Smad4基因启动子甲基化参与了哈萨克族食管癌的发生和发展,Smad4基因启动子区CpG-1、CpG-16—17—18—19、CpG-27—28和CpG-31—32—33甲基化状态的改变可能与新疆哈萨克族食管癌发生和发展有关。     

EEN-B1及其启动子甲基化在外阴鳞状细胞癌中的表达及意义

目的：检测EEN—B1在外阴鳞癌组织及外阴鳞癌细胞株中的启动子甲基化及蛋白表达情况,探讨其启动子异常甲基化在外阴鳞癌发病过程中的作用。方法：采用重亚硫酸盐测序PCR（bisulfite genomic se—quencing PCR,BSP）联合TA克隆测序法,以正常外阴组织作对照,检测外阴鳞癌组织中EEN—B1启动子区CpG岛的甲基化状态,以甲基化酶抑制剂5-aza-2-deoxycitydine（5-aza—dC）作用于外阴鳞癌细胞A-431,检测作用前后甲基化率变化情况;Westernblot方法检测外阴鳞癌及对照组织中EEN—B1蛋白表达情况,检测5-aza—dC处理前后A-431中该蛋白表达情况。结果：在癌组织中EEN—B1启动子的甲基化率为54．66％,与对照组织的12．16％相比,差异具有统计学意义;而在外阴鳞癌组织中EEN—B1蛋白明显下调;经1×10 -7mol／L5-aza—dC处理72小时后,A-431细胞系中EEN—B1启动子的甲基化率由67．05％下降至26．82％（P〈0．05）,而该蛋白表达明显上调。结论：外阴鳞癌细胞株A-431及癌组织中EEN—B1基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化可能导致了外阴鳞癌组织及细胞系中EEN—B1基因的表达沉默。     

T-cadherin启动子甲基化与胃癌恶性生物学行为及预后关系的研究

目的：探讨T—cadherin基因表达及启动子甲基化与胃癌恶性生物学行为及预后的相关性。方法：采用免疫组织化学法（IHC）和甲基化特异性PCR法（MSP）检测80例临床手术切除的胃癌标本及40例相应癌旁组织标本中T—cadherin表达及启动子甲基化情况,并与临床病理资料进行对照分析,每例患者随访24个月。结果：80例胃癌标本中,T—cadherin阳性表达率仅为45．0％（36／80）,与相应癌旁组织相、比明显减低。T—cadherin表达与组织分型（P=0．032）、肿瘤分化程度（P=0．037）、是否存在淋巴结转移（P=0．010）及TNM分期有关（P=0．000）,与患者年龄、性别及肿瘤大小无关（P〉0．05）。80例胃癌标本中有38例存在T—cadherin启动子甲基化现象（47．5％）,癌旁组织标本则全部呈非甲基化状态（100．0％）。T—cadherin启动子甲基化与组织分型（P=0．012）、肿瘤分化程度（P=0．020）、是否存在淋巴结转移（P=0．020）及TNM分期有关（P=0．007）,与患者年龄、性别及肿瘤大小无关（P〉0．050）。24个月的随访结果显示：T—cadherin启动子甲基化组的平均生存时间和中位生存时间均较非甲基化组缩短,两组差异有统计学意义（P=0．029）。通过Cox比例风险模型评估,胃癌的分化程度（P=0．030）、是否存在淋巴结转移（P=0．010）及TNM分期（P=0．010）均可影响患者的生存时间,分化程度低、发生淋巴结转移、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期的胃癌患者死亡风险增加。结论：T—cadherin启动子甲基化是导致该蛋白表达下调的原因之一,与胃癌恶性生物学行为及预后密切相关,可作为胃癌恶性程度判断及预后评估的参考指标,对指导临床诊治有重要意义。