H22-pEGFP-C1-FL肝癌细胞瘤苗构建及其生物活性的研究

目的:构建H22-pEGFP-C1-FL肝癌细胞瘤苗,研究其活体内应用的生物学活性.方法:通过G418筛选能高表达hFL蛋白H22-pEGFP-C1-FL的肝癌细胞株;小鼠尾静脉注射经放射线灭活的H22-pEGFP-C1-FL的肝癌细胞,检测注射后hFL蛋白表达情况及对骨髓抑制小鼠的升白作用.结果:获得高表达hFL蛋白的H22肝癌细胞.该细胞经辐射灭活后,输注给辐射后骨髓抑制的小鼠,与对照组相比,可快速升高白细胞(P<0.01),显著提高辐射小鼠的存活率(P<0.01).结论:成功构建了H22-pEGFP-C1-FL肿瘤细胞瘤苗,为其临床应用奠定基础.     

H22-pEGFP-C1-FL肝癌细胞瘤苗构建及其生物活性的研究

目的：构建H22-pEGFP—C1-FL肝癌细胞瘤苗,研究其活体内应用的生物学活性。方法：通过G418筛选能高表达hFL蛋白H22-pEGFP—C1-FL的肝癌细胞株;小鼠尾静脉注射经放射线灭活的H22-pEGFP—C1-FL的肝癌细胞,检测注射后hFL蛋白表达情况及对骨髓抑制小鼠的升白作用。结果：获得高表达hFL蛋白的H22肝癌细胞。该细胞经辐射灭活后,输注给辐射后骨髓抑制的小鼠,与对照组相比,可快速升高白细胞（P〈0．01）,显著提高辐射小鼠的存活率（P〈0．01）。结论：成功构建了H22-pEGFP—C1-FL肿瘤细胞瘤苗,为其临床应用奠定基础。     

人Flt3配体基因的克隆及在Hela细胞中的表达

目的：克隆人Flt3配体（FL）基因．检测其在Hela细胞中转录及表达蛋白的活性。方法：Trizol法提取K562细胞总RNA，经RT-巢式PCR得到FL的cDNA，PCR产物亚克隆入pGEM-T栽体测序，构建pcDNA3／hFL。经Lipofectamine2000介导转入Hela细胞．RT-PCR法检测转染细胞中hFL基因的转录．ELISA法检测培养上清中hFL的含量．增殖和促生存实验鏊定hFL的活性。结果：所得FL基因序列正确。转染后的Hela细胞能转录FL基因．上清中hFL蛋白含量为56．8ng／ml／l．hFL能促Raji细胞生存及抑制凋亡（P〈0.01），促进HL-60细胞增殖（P〈0.05）。结论：构建的pcDNA3／hFL质粒在Hela细胞表达系统中能够有效转录．表达的hFL蛋白具有生物学活性。     

TβR-Ⅱ-RANTES融合基因重组腺病毒的抗肿瘤作用

目的构建表达融合基因TGF-βⅡ型受体(TβR-Ⅱ)胞外区及活化T细胞表达和分泌的调节因子(RANTES)重组腺病毒载体,并观察其抗肿瘤作用。方法RT-PCR扩增小鼠TβR-Ⅱ胞外区和RANTES基因,重叠PCR扩增融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES。采用adMax adenovjrus vector creation试剂盒构建表达融合基因重组腺病毒。体外感染小鼠肺腺痛LA795细胞系,绘制细胞生长曲线。采用Western blot法检测感染后细胞融合基因的表达;酶联免疫吸附试验(FLISA)法检测其培养上清的蛋白含量;Annexin V-FITC法检测感染后细胞的凋亡;并观察感染后细胞培养上清对小鼠脾细胞的趋化作用。将感染后的细胞(1×105个)接种于T739小鼠,观察成瘤时间和生存时间;1×1010pfu的重组腺病毒局部注射荷瘤小鼠,观察肿瘤的大小变化,并统计肿瘤的重量和计算抑瘤率。结果经测序证实,RT-PCR正确扩增小鼠TβR-Ⅱ胞外区和RANTFS基因,重叠PCR正确扩增融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES。重组质粒pDC316-融合基因经酶切鉴定正确,与pJM17双质粒共转染获得表达融合基因重组腺病毒,病毒滴度为8×1010pfu/ml。Western blot结果表明,感染后的LA795细胞有融合蛋白的特异性条带出现;培养上清中,游离TGF-β1的水平显菩减低,而RANTES的水平显著升高。感染融合基因重组腺病毒的细胞生长速度明显减低,凋亡率为16.9%;培养上清可趋化小鼠脾细胞,与对照组之间差异均有统计学意义。感染融合基因重组腺病毒组与对照组相比,体内成瘤时间和生存时间明显延长;局部注射融合基因重组腺病毒可显著抑制肿瘤的生长,抑瘤率为37.6%。结论成功构建表达融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES重组腺病毒可有效结合TGF-β1,显著逆转TGF-β介导的免疫抑制状态,高水平表达RANTES强化肿瘤局部的免疫功能,具有显著的抗肿瘤作用。     

VEGFR-3胞外区基因真核表达载体的构建-与鉴定

目的构建VEGFR-3胞外区基因真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,并在体外进行表达和鉴定。方法采用 RT-PCR技术,扩增C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pcDNA3.1-VR-3。经限制性酶切鉴定和DNA 序列测定结果证实后,将重组质粒经脂质体法转染COS-7细胞, Western blotting检测其蛋白表达。结果克隆了C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,并构建了真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,Western blot 证实目的基因可在COS-7细胞中表达。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,可在真核细胞内正确表达,这为进一步的动物实验奠定了基础。     

Twist基因真核表达载体的构建和表达检测

[目的]构建Twist基因读码框架至真核表达载体pCDNA3．1，为进一步研究Twist蛋白的功能做材料准备。[方法]采用RT-PCR方法，以正常人子宫体组织cDNA为模板，扩增Twist基因全长读码框架，并构建到真核表达载体pCDNA3．1中。[结果]经过克隆测序结果证实，成功将Twist基因读码框架插入真核表达载体pCDNA3．1的相应位置：将pCDNA-Twist载体转染细胞系后，发现Twist蛋白在细胞中得到高水平的表达。[结论]Twist真核表达载体的成功构建，为深入研究Twist蛋白对肿瘤转移的作用提供了理想的材料。     

MAGE-1与人HSP70融合基因真核表达载体的构建

目的构建MAGE-1(melanomaantigen1)与人HSP70(heatshockprotein70)融合基因的真核表达载体pCDNA3.1-MAGE-1-HSP70,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法利用PCR方法扩增人HSP70基因,经测序后连入真核表达载体pCDNA3.1,再通过PCR方法扩增MAGE-1基因,测序后插入HSP70基因的5'端,构建了MAGE-1与人HSP70融合基因表达载体pCDNA3.1-MAGE-1-HSP70。结果成功地扩增了人HSP70基因与MAGE-1基因,测序结果表明与GenBank公布的序列一致,成功地构建了pCDNA3.1-MAGE-1-HSP70真核表达载体。结论成功地构建MAGE-1与人HSP70融合基因的真核表达载体pCDNA3.1-MAGE-1-HSP70,为进一步DNA肿瘤疫苗研究提供了实验基础。     

肝癌细胞特异性IL-1a反义RNA对小鼠移植肝癌的抑制

目的:构建肝癌细胞特异性小鼠IL-1a反义RNA表达载体,观察其对H22肝癌细胞小鼠移植瘤生长的影响及其相关机制.方法:构建由AFP最小启动子和CMV增强子嵌合序列调控的携IL-1a反义RNA表达载体pafpIRES2-antiIL-1a1和pafpIRES2-antiIL-1a2,经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定进行鉴定.反义RNA表达载体转染小鼠H22肝癌细胞,分H22/mock组、H22/antiIL-1a1组、H22/antiIL-1a2三组,RT-PCR检测IL-1a的表达水平.以转染后的H22细胞皮下接种建立荷肝癌小鼠模型,观察移植瘤体积和重量,MTT法检测荷瘤小鼠脾脏中分离的NK细胞对H22细胞的杀伤活性.结果:经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定证实成功构建能够在肝癌细胞中特异性表达IL-1a反义RNA的表达载体pafpIRES2-antiIL-1a1和pafpIRES2-antiIL-1a2,转染H22细胞后细胞中IL-1a表达水平明显下降,以pafpIRES2-antiIL-1a2更为显著.成功建立荷肝癌小鼠模型,与H22/mock组小鼠相比, H22/antiIL-1a2组小鼠移植瘤体积较小,生长显著减慢(P<0.05). H22/antiIL-1a1、H22/antiIL-1a2组荷瘤小鼠的NK细胞对H22细胞的杀伤活性明显增强(P<0.05或P<0.01).结论:成功构建的肝癌细胞特异性IL-1a反义RNA表达载体可有效抑制小鼠移植肝癌的生长,其机制与靶向阻断IL-1a表达、上调NK细胞的杀伤活性有关.     

Smad4过表达对人胃癌细胞增殖和NF-κB通路的影响

目的: 构建肝癌细胞特异性小鼠IL1β反义RNA表达载体,观察其对H22肝癌细胞小鼠移植瘤生长的影响及其相关机制。方法:构建由AFP最小启动子和CMV增强子嵌合序列调控的携IL1β反义RNA表达载体pafpIRES2antiIL1β1和pafpIRES2antiIL1β2,经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定进行鉴定。反义RNA表达载体转染小鼠H22肝癌细胞,分H22/mock组、H22/antiIL1β1组、H22/antiIL1β2三组,RTPCR检测IL1β的表达水平。以转染后的H22细胞皮下接种建立荷肝癌小鼠模型,观察移植瘤体积和重量,MTT法检测荷瘤小鼠脾脏中分离的NK细胞对H22细胞的杀伤活性。〖HT5W〗结果: 〖HT5"SS〗 经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定证实成功构建能够在肝癌细胞中特异性表达IL1β反义RNA的表达载体pafpIRES2antiIL1β1和pafpIRES2antiIL1β2,转染H22细胞后细胞中IL1β表达水平明显下降,以pafpIRES2antiIL1β2更为显著。成功建立荷肝癌小鼠模型,与H22/mock组小鼠相比, H22/antiIL1β2组小鼠移植瘤体积较小,生长显著减慢（P<0.05)。 H22/antiIL1β1、H22/antiIL1β2组荷瘤小鼠的NK细胞对H22细胞的杀伤活性明显增强(P<0.05或P<0.01)。结论: 成功构建的肝癌细胞特异性IL1β反义RNA表达载体可有效抑制小鼠移植肝癌的生长,其机制与靶向阻断IL1β表达、上调NK细胞的杀伤活性有关     

PEA-15真核表达载体的构建及表达

目的构建PEA-15真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15,并在人类食管癌细胞（EC-109）中表达。探讨PEA-15对EC．109细胞的影响。方法采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测EC-109细胞中的PEA-15基因表达。构建重组真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15。酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至EC-109细胞中。采用RT—PCR、Westernblot法检测基因及蛋白表达。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞生长抑制率。结果RT—PCR显示PEA-15在EC-109细胞中表达。PCR扩增片段与预期片段大小相符,测序结果表明真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15构建成功。转染后的细胞中PEA-15表达均增加（t值分别为4．078、5．269,均P〈0．05）。转染质粒72h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组降低[（7．12±0．86）％、（12．55±1．78）％,t=6．163,P〈0．05]。结论成功构建重组真核表达载体pcDNA3．I-PEA-15,并在EC-109细胞中进行了表达;转染后对食管癌细胞生长有促进作用,其表达可能促进食管癌的发生。     

抑制CDC25A表达的siRNA真核表达载体的构建

目的 在哺乳动物细胞中构建并鉴定抑制CDC25A表达的siRNA真核表达载体.方法 根据CDC25A的基因序列,设计特异性的siRNA,将合成的siRNA 核酸片段退火形成双链后连接到经Bam HI和HindⅢ双酶切后的psilencer4.1真核表达载体,命名为psilencer4.1-CDC25A以及psilencer4.1-Control,并进行酶切及测序鉴定.结果 通过酶切鉴定和序列测定,成功地构建出抑制CDC25A表达的siRNA载体及其阴性对照载体.结论 成功构建和验证了siRNA真核表达载体,为下一步研究奠定了良好的基础.     

MRI of transgene expression: correlation to therapeutic gene expression

Magnetic resonance imaging (MRI) can provide high-resolution 3D maps of structural and functional information, yet its use of mapping in vivo gene expression has only recently been explored. A potential application for this technology is to noninvasively image transgene expression. The current study explores the latter using a nonregulatable internalizing engineered transferrin receptor (ETR) whose expression can be probed for with a superparamagnetic Tf-CLIO probe. Using an HSV-based amplicon vector system for transgene delivery, we demonstrate that: 1) ETR is a sensitive MR marker gene; 2) several transgenes can be efficiently expressed from a single amplicon; 3) expression of each transgene results in functional gene product; and 4) ETR gene expression correlates with expression of therapeutic genes when the latter are contained within the same amplicon. These data, taken together, suggest that MRI of ETR expression can serve as a surrogate for measuring therapeutic transgene expression.     

血液肿瘤基因表达和基因表达模式研究进展

基因表达失调与血液肿瘤的生物学特性、治疗反应和预后密切相关。近年迅速发展的转录组测序、单细胞转录组测序等技术为发现疾病诊疗相关的标志性基因和研究基因表达模式提供了强有力的工具。文章结合第62届美国血液学会(ASH)年会中的报道介绍相关研究进展。     

哺乳动物细胞CDK2系列表达载体的构建与表达

目的：构建一系列细胞周期蛋白依赖激酶2（cyclin-dependent kinase 2,CDK2）在哺乳动物细胞的表达载体,为研究CDK2的功能和修饰提供实验材料。方法：从食管癌细胞中提取总RNA,逆转录PCR扩增CDK2编码区,然后将PCR产物克隆到T载体;扩增后的CDK2片段分别亚克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP等4种哺乳动物表达载体;最后,将获得的表达载体PEGFP/CDK2转染小鼠成纤维细胞NIH3T3进行初步的CDK2表达分析。结果：RT-PCR扩增获得约900 bp的目的片段,经T载体克隆和DNA序列分析,显示重组片段是人CDK2基因序列;CDK2片段分别亚克隆入上述4种载体后获得相应表达载体;运用构建的PEGFP/CDK2表达载体,在NIH3T3细胞中表达出CDK2蛋白。结论：成功构建了CDK2的哺乳动物细胞系列表达载体,并在NIH3T3细胞中成功表达目的蛋白。     

Prokaryotic expression of antibodies

Summary Maximizing the expression yields of recombinant whole antibodies and antibody fragments such as Fabs, single-chain Fvs and single-domain antibodies is highly desirable since it leads to lower production costs. Various eukaryotic and prokaryotic expression systems have been exploited to accommodate antibody expression but Escherichia coli systems have enjoyed popularity, in particular with respect to antibody fragments, because of their low cost and convenience. In many instances, product yields have been less than adequate and intrinsic and extrinsic variables have been investigated in an effort to improve yields. This review deals with various aspects of antibody expression in E. coli with a particular focus on single-domain antibodies. Both authors contributed equally to this work.     

小鼠白介素-12真核表达质粒的构建及其表达

目的:构建能在真核细胞内稳定表达小鼠白介素-12(mIL-12)的质粒,为进一步研究mIL-12的免疫调节机制及其抗肿瘤作用奠定基础。方法:通过聚合酶链反应(PCR)扩增质粒pORF-mIL-12(Elas-ti),双酶切后将目的片段mIL-12连接到真核表达载体pcDNA3.1( )质粒上,mIL-12受pcDNA3.1( )中mCMV启动子驱动,将mIL-12全长转录至同一mRNA上,对重组质粒进行鉴定后将其转染小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)测其表达。结果:PCR成功扩增出mIL-12片段,PCR鉴定、酶切鉴定及测序均证实pcDNA3.1( )-mIL-12质粒构建成功,RT-PCR及ELISA证实重组质粒在mRNA及蛋白质水平均高表达mIL-12。结论:pcDNA3.1( )-mIL-12真核表达质粒构建成功并能在LLC细胞中稳定表达。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的：克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法：采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-N1）上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果：测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

Nucleostemin基因荧光真核表达载体构建及表达特性

目的:构建Nucleostemin(NS)基因真核表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法: 设计引物在肺癌细胞株(LTEP-a-2)中扩增NS全长cDNA片段,插入pMD-18T 质粒中得pMD-18T-NS载体,并测序;再将pMD-18T-NS质粒经酶切后导入真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP质粒中,构建pcDNA3.1(+)-GFP-NS载体,并检测其真核表达情况.结果: 经RT-PCR扩增得到1 650 bp的全长NS cDNA片段,酶切及测序后鉴定证明pMD-18T-NS构建成功.pcDNA3.1(+)-G-FP-NS载体转染COS-7细胞经蛋白印迹及激光共聚焦显微镜检测显示,该GFP-N-S融合基因在COS-7细胞中获得较好表达.转染后见该基因定位于核仁,细胞逐渐失去黏附贴壁的特性,细胞的增殖受阻;稳定表达(4～20周)后,细胞形态发生改变,体积增大,核增多,细胞成瘤细胞样改变.结论: 成功构建pcDNA3.1(+)-GF-P-NS真核表达载体,并在COS-7细胞中有效表达;NS基因在COS-7发生瘤样改变过程中发挥着重要作用,可能与肿瘤发生密切相关.