Trastuzmab F(ab′)2修饰紫杉醇免疫脂质体对人大肠癌HT-29细胞的杀伤作用

 目的 构建Trastuzmab F(ab′)2修饰的紫杉醇免疫脂质体并测定其对体外生长的人大肠癌HT-29细胞的杀伤作用。方法 采用逆相蒸发法合成紫杉醇脂质体,使用胃蛋白酶在Tastuzumab抗体J链Fc段侧切断抗体以获得抗体F(ab′)2段,抗体交联法制备Trastuzmab F(ab′)2段修饰的紫杉醇免疫脂质体;透射电子显微镜观察免疫脂质体的形态及粒径分布;采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）及荧光标记法测定免疫脂质体包封率和活性;MTT检测细胞的杀伤率。结果 成功构建了Trastuzmab F(ab′)2修饰的紫杉醇免疫脂质体;所得免疫脂质体平均粒径为210nm,粒径小于200nm者占91.37%;且其具有较高的包封率和稳定性;相同时间内,HT-29细胞对紫杉醇免疫脂质体的摄取要明显高于对照组;Trastuzmab F(ab′)2修饰的紫杉醇免疫脂质体对HT-29细胞的杀伤作用强于对照组(P<0.01),且该作用具有时间依赖性(P<0.01)。结论 成功构建Trastuzmab F(ab′)2修饰的紫杉醇免疫脂质体,其对体外生长的大肠癌细胞具有较强的杀伤作用。     

靛玉红甲肟对HT-29细胞增殖和凋亡的影响及机制

背景与目的:近年来有报道称靛玉红甲肟(indirubin-3'-monoxime)在体内外实验中对部分实体肿瘤细胞具有明显的抑制作用,但尚未见其对人结肠癌HT-29细胞影响的研究报道,因而本文旨在研究其对HT-29细胞增殖和凋亡的影响及其机制.方法:MTT法检测不同浓度靛玉红甲肟处理HT-29细胞后细胞的增殖活性,制作生长抑制曲线.流式细胞仪检测凋亡率,RT-PCR检测细胞凋亡抑制基因survivin和bcl-2及凋亡促进基因Bax mRNA的变化.结果:靛玉红甲肟明显的抑制HT-29的增殖,其作用表现为剂量依赖性和时间依赖性(F=11.25,P<0.01).流式细胞仪检测发现:以10 μ mol/L的靛玉红甲肟处理HT-29细胞后,其凋亡率呈时间依赖性上升(F=195.25,P<0.01).RT-PCR检测发现HT-29细胞survivin(F=78.75,P<0.01)和Box(F=87.61,P<0.01)转录上升,而bcl-2转录显著下降(F=95.82,P<0.01).结论:靛玉红甲肟对人结肠癌HT-29细胞具有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用,其作用机制与下调bcl-2/Bax比例有关.     

MRK-16修饰阿霉素免疫脂质体逆转肺癌细胞多药耐药研究

目的：研究MRK-16修饰阿霉素免疫脂质体与阿霉素脂质体对非小细胞肺癌多药耐药的逆转作用。方法：25％的戊二醛偶联MRK-16于阿霉素脂质体，制备MRK-16修饰阿霉素免疫脂质体；以MTS测定细胞存活率，检测SPC—A1／TAX的耐阿霉素指数；以阿霉素脂质体与MRK-16修饰阿霉素免疫脂质体作用于SPC—A1／TAX，设阿霉素组对照；研究两者对SPC—A1／TAX的体外细胞毒与多药耐药逆转作用；流式细胞仪检测用药后2．4、6小时后细胞内药物浓度。结果：免疫脂质体细胞杀伤率（48h）达67．7％，其多药耐药逆转指数达7．45；脂质体对细胞的杀伤率49．2％，逆转指数4．28；流式细胞仪检测细胞内药物浓度，6小时后阿霉素免疫脂质体组细胞内药物浓度是阿霉素组的18．34倍，脂质体组是阿霉素的10．1倍。结论：MRK-16修饰阿霉素免疫脂质体、阿霉素脂质体在体外对非小细胞肺癌多药耐药具有-定的逆转作用。     

转染融合基因的DC抗肿瘤免疫效应

 目的 研究转染融合基因（GM-CSF-survivin GM-ΔSur）的树突状细胞（DC）在体外诱导高效而特异的抗肿瘤免疫效应 。方法 用jetPEI^TM-Macrophage转染体系,将构建的GM-ΔSur融合基因转染入DC,用流式细胞仪检测DC的表面分子 HLA-DR、CD83、CD80、CD86表达的高低;用LDH法测定转染融合基因的DC诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）杀伤肿瘤细胞（HT-29和OVCAR-3）的能力。结果 转染融合基因的DC细胞中可检测到GM-ΔSur融合蛋白的表达;DC表面高表达HLA-DR、CD83、CD80、CD86;PHA/rhIL-2长期培养（21d）的T细胞CD8^＋比例明显增加;转染融合基因的DC 对HT-29肿瘤细胞的杀伤率显著高于未修饰的DC的杀伤率。结论 GM-ΔSur基因转染修饰的DC能选择性诱导MHC-I类分子限制的CTL的特异性,显著提高DC的抗原提呈功能和诱导高效而特异的抗肿瘤免疫效应。     

99mTc标记的抗CEA小分子嵌合抗体的体内分布与肿瘤显像

[目的]采用99mTc标记抗人CEA小分子嵌合抗体Rch24 F(ab')2,研究其在荷人结肠癌裸鼠体内的生物学分布及放射免疫显像的特征与应用价值.[方法]采用SnC12直接还原法标记抗体,快速薄层层析法(ITLC)测定抗体的标记效率、放化纯度和体外稳定性,ELISA检测标记抗体的免疫比活性.荷人结肠癌裸鼠尾静脉注射99mTc-Rch24 F(ab')2后,研究标记抗体在裸鼠体内的生物学分布,并进行肿瘤显像.[结果] 99mTc-Rch24 F(ab')2的标记率为90％,放化纯度＞95％.99mTc-Rch24 F(ab')2的放射比活为840MBq/mg,免疫比活性为65.7％.标记抗体24h时放射性脱落小于5％.荷瘤裸鼠注射99mTc-Rch24 F(ab')2 3h后即可观察到肿瘤影像,5～24h均可获得清晰的肿瘤影像,标记抗体在体内呈肿瘤靶向性分布,12h时肿瘤的摄取和多数脏器T/NT比值均达到最高水平.[结论]99mTc-Rch24 F(ab')2在体内靶向分布于结肠癌肿瘤组织,具有较高的T/NT比值并可在肿瘤局部滞留,注射99mTc-Rch24 F(ab')25h后肿瘤成像满意.99mTc-Rch24 F(ab')2在临床肿瘤的放射免疫分子显像诊断中具有良好的应用前景.     

整合素受体和细胞穿膜肽共修饰紫杉醇脂质体抑制食管癌Ec9706细胞的研究

目的：制备整合素受体RGD和细胞穿膜肽R8共修饰载紫杉醇( PTX)脂质体( RGD/R8-LP-PTX),对其理化性质进行表征,并观察脂质体与食管癌Ec9706细胞的亲和力和增殖抑制作用。方法：采用薄膜分散法制备RGD/R8-LP-PTX,观察脂质体的粒径,电位以及包封率;通过定量细胞摄取实验观察食管癌Ec9706细胞对RGD/R8-LP的摄取效率以及对脂质体摄取的影响因素。定性共聚焦实验观察肿瘤细胞对脂质体的摄取。 MTT实验观察RGD/R8-LP-PTX对食管癌Ec9706细胞的细胞毒性;构建食管癌Ec9706细胞肿瘤球模型,观察脂质体对肿瘤球的生长抑制能力。结果： RGD/R8-LP-PTX的粒径在124．8±9．4 nm,电位为21．35±3．55 mV。食管癌Ec9706细胞对RGD/R8-LP的摄取以及 RGD/R8-LP-PTX 对食管癌 Ec9706细胞的增殖抑制率具有时间依赖性;食管癌Ec9706细胞对RGD/R8-LP的摄取效率显著高于R8-LP、RGD-LP和LP,差异有统计学意义(P<0．01);在给药48 h后,R8-LP-PTX、RGD-LP-PTX和LP-PTX的细胞存活率分别是RGD/R8-LP-PTX组的1．6倍、1．7倍和2．2倍,差异有统计学意义(P<0．01)。给药7天后,生理盐水组肿瘤球持续生长,体积增大1．48倍,LP-PTX组肿瘤球体积增大到原体积的1．12倍, RGD/R8-LP-PTX组、R8-LP-PTX组和 RGD-LP-PTX组肿瘤球体积减小到原体积的36%、59%和64%,差异具有统计学意义(P<0．01)。结论：整合素受体RGD和细胞穿膜肽R8共修饰载紫杉醇(PTX)脂质体能够有效穿透肿瘤细胞膜进入肿瘤细胞,是一种有效的食管癌化疗靶向给药系统。     

体外构建靶向脂质体靶向杀伤肿瘤血管内皮模型

目的 :于体外构建靶向脂质体标杀肿瘤血管内皮的小鼠模型并进行验证。方法 :利用肿瘤细胞分泌的IFN γ刺激内皮细胞表达MHCⅡ ,以连有抗MHCⅡ抗体的免疫载药脂质体靶向杀伤内皮细胞。内皮细胞的MHCⅡ阳性率由细胞流式仪监测。免疫脂质体识别靶细胞的能力由结合实验验证。细胞毒实验采用的是MTT检测法。结果 :肿瘤细胞分泌的IFN γ可刺激内皮细胞表达MHCⅡ。内皮细胞SVEC与转染IFN γ基因的神经母细胞瘤C130 0 (Muγ)的上清培养 2d后 ,约有 2 3%的上皮细胞表达MHCⅡ。连有抗MHCⅡ抗体的脂质体可与表达MHCⅡ抗原的内皮细胞特异结合。结合率可达非特异性脂质体的 3倍。载药的抗MHCⅡ脂质体可特异杀伤MHCⅡ阳性内皮细胞。结论 :免疫靶向脂质体可于体外特异杀伤因肿瘤分泌的细胞因子的作用而呈递抗原的内皮细胞。     

Survivin反义寡核苷酸树形分子载体的构建及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的:研究聚酰胺(polyamidoamine,PAMAM)树形分子高聚合物作为survivin反义寡核苷酸(survivin antisense oligodeoxynucleotide,survivin-asODN)载体传递系统的可行性以及对肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响。方法:将200μg/Lsurvivin-asODN和3.66μg/L PAMAM混合制备PAMAM反义基因复合物,同时制备阳离子脂质体反义基因复合物作为对照。透射电镜观察复合物的形态、粒径,Zeta电位分析仪测定复合物的zeta电位,离心法和紫外分光光度仪测定复合物的包封率、载药率和体外DNA释放速度。将上述两种基因载体复合物转染肝癌SMMC-7721细胞,测定其转染效率;Western blotting检测转染后肿瘤细胞中survivin蛋白的表达;流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡率。结果:成功制备PAMAM反义基因载体系统PAMAM-survivin-asODN。该复合物的粒径小于脂质体-survivin-asODN复合物的粒径[(64.9±9.60)vs(193.9±32.20)nm,P<0.01],但zeta电位高于后者[(37.7±3.80)vs(22.6±2.20)mV,P<0.05];两者基因载药率、包封率无显著差异;PAMAM反义基因复合物对DNA持续释放达14 d,但脂质体复合物只持续5 d。PAMAM-survivin-asODN转染肝癌细胞的效果强于脂质体-survivin-asODN(P<0.05)。转染后肝癌细胞siurvivin蛋白的表达显著低于脂质体复合物[(26.80±5.65)vs(36.96±5.89),P<0.05],该细胞的凋亡率显著高于脂质体复合物转染细胞[(60.3±8.25)%vs(48.7±9.39)%,P<0.05]。结论:PAMAM作为载体系统能将survivin-asODN高效递送到肝癌SMMC-7221细胞,诱导人肝癌细胞的凋亡。     

ZS-1多肽修饰载紫杉醇靶向脂质体抑制NCI-H1299肺癌细胞的研究

目的 以人源性肺癌细胞NCI-H 1299为模型,研究ZS-1多肽修饰的载紫杉醇脂质体(ZS-1 modified paclitaxel liposome,ZSLP-PTX)的体外抗肿瘤作用.方法 采用薄膜分散法制备ZSLP-PTX,并对其理化性质进行表征.MTT实验研究ZSLP-PTX对NCI-H1299肿瘤细胞的增殖抑制能力,用定性和定量的细胞摄取实验研究ZS-1修饰脂质体与肺癌细胞的亲和力.构建NCI-H1299细胞肿瘤球模型,研究不同脂质体对肿瘤球的穿透能力.结果 ZSLP-PTX的粒径为(125.7±18.5)nm,24小时内,在50％的血清中能保持稳定.NCI-H1299细胞和NCI-H1299体外肿瘤球对ZSLP的摄取能力大于LP-PTX(P ＜0.05);ZSLP-PTX对NCI-H1299细胞的增殖抑制作用显著强于LP-PTX(P ＜0.05).结论 与LP-PTX比较,ZSLP-PTX能够更有效地被NCI-H1299肿瘤细胞所摄取,抑制肿瘤细胞的增殖,具有更强的抗肿瘤作用.     

大肠埃希菌脂多糖脂质体的制备及对肿瘤的抑制作用

目的:制备临床分离的多重耐药大肠埃希菌TH1、TH2、TH6、TH7和TH10的脂多糖(LPS)脂质体并观察其对肿瘤的抑制作用.方法:采用逆向蒸发法制备大肠埃希菌LPS脂质体,通过电镜、粒径测定仪,鲎试验法(LAL)测定LPS脂质体的包封率.LPS脂质体免疫小鼠后将单肿瘤细胞悬液分别接种于小鼠腹腔和腓肠肌内,观察LPS脂质体对腹水瘤和实体肿瘤的作用.结果:大肠埃希菌LPS脂质体均为乳白色悬液,镜下可见LPS脂质体均呈规则的球形,粒径分布均匀.LAL结果推算包封率为99.0%～99.9%.TH1、TH2、TH6、TH7和TH10 LPS脂质体免疫小鼠与对照组相比,腹水量和细胞总数明显减少且体质量增加,P<0.05,小鼠腓肠肌瘤体的体积均小于对照组,P<0.05.结论:所制备的大肠埃希茵LPS脂质体对肿瘤具有抑制作用.