生长激素促进结直肠癌细胞增殖的实验研究

 【摘要】　目的　研究生长激素受体（GHR）在结直肠癌细胞株表面的表达情况并探讨人类重组生长激素（rh-GH）对人类结直肠癌细胞增殖的影响。方法　采用流式细胞术及免疫荧光法检测9株人类结直肠癌细胞株表面GHR表达;四甲基偶氮唑蓝比色（MTT）法检测不同浓度rh-GH以及生长激素受体拮抗剂（GHRA）对结直肠癌细胞增殖的影响。结果　GHR在多株结直肠癌细胞株表面存在表达差异,其中GHR在HCT-8人类结直肠癌细胞高表达[（58.23±5.51）%],LoVo细胞几乎不表达[（0.20±0.04）%]。一定质量浓度的r-hGH（50、100 ng／ml）对GHR+的HCT-8细胞有促增殖作用（均P＜0.05）,但并不呈剂量依赖;应用GHRA封闭GHR后,r-hGH的促增殖作用消失;而rhGH对GHR-的人类结肠癌细胞株LoVo增殖无影响（均P＞0.05）。结论　外源性生长激素对人类结直肠癌细胞有促增殖作用,rh-GH在结直肠癌患者中的使用需要谨慎。     

重组生长激素体外干预人肝癌细胞膜GHR密度变化

目的体外环境下,针对人肝癌细胞生长激素受体（GHR）的不同表达状态,研究重组人生长激素（rhGH）对其胞膜表面GHR密度变化的影响。方法采用免疫细胞化学方法分别半定量测定人肝癌细胞株HepG2、SMMC7721、和QGY7701的GHR表达情况,采取50ng／mLrhGH,100ng／mLrhGH,200ng／mLrhGH干预和未处理4种干预方式体外培养上述3种细胞,然后利用放射性受体分析方法定量检测胞膜表面GHR密度变化。结果免疫细胞化学检测细胞株HepG2呈GHR高表达状态,50ng／mLrhGH、100ng／mLrhGH、200ng／mLrhGH干预后胞膜表面GHR位点数分别为8．4350±0．2396、9．3957±0．5143、8．3297±0．3133（10^3／cell）,较空白对照组7．5137±0．5352（10^3／cell）明显增加（P〈0．05）;细胞株SMMC7721呈GHR弱表达状态,50ng／mLrhGH、100ng／mLrhGH、200ng／mLrhGH干预后胞膜表面GHR位点数分别为3．8343±0．2590、3．8213±0．2276、3．6947±0．2722（10^3／cell）,与空白对照组3．7190±0．2824（10^3／cell）差异无统计学意义（P〉0．05）;细胞株QGY7701未表达GHR,各种rhGH干预后均未出现GHR表达的现象。结论rhGH明显促GHR高表达细胞株HepG2胞膜表面GHR密度增加,对GHR低表达细胞株SMMC772胞膜表面GHR密度无影响。rhGH不会改变细胞株QGY7701的GHR不表达状态。     

过表达IL-18 抑制人结直肠癌细胞HCT-116的增殖

目的：研究过表达IL-18 基因对人结直肠癌（colorectal cancer,CRC）HCT-116 细胞体内外增殖的影响及其可能的机制。方法：构建含人IL-18 基因片段的载体,采用慢病毒转染法获得稳定过表达人IL-18 的CRC HCT-116 细胞株HCT-116/IL-18,CCK-8 法检测HCT-116/IL-18 细胞与野生型HCT-116 细胞的增殖,Western blotting 检测两组细胞内IL-18、Cyclin D1、增殖细胞核抗原（PCNA）、DNA损伤修复酶（PARP）蛋白的表达。将HCT-116、HCT-116/IL-18 细胞分别接种于裸鼠左右两侧腋下,观察成瘤性及移植瘤的生长情况,免疫组化法检测移植瘤组织中IL-18 及PCNA的表达。结果：IL-18 基因在HCT-116 细胞内过表达,可延缓HCT-116 的增殖（P<0.05 或P<0.01）;与HCT-116 细胞相比,HCT-116/IL-18 细胞内PARP表达明显增强,PCNA、Cyclin D1 表达减弱（P<0.01）。HCT-116/IL-18 细胞系在裸鼠体内成瘤率明显降低,成瘤率为43%,与对照组比较其移植瘤成瘤时间晚、生长慢、肿块小,且HCT-116 / IL-18 异种移植瘤PCNA蛋白表达下调（P<0.01）。结论：过表达IL-18 基因对HCT-116 细胞生长增殖具有抑制作用,其机制可能与IL-18调控细胞周期和促进DNA损伤有关。     

FBXW7基因点突变对结直肠癌HCT-116细胞的增殖、迁移、侵袭和抗 凋亡能力的影响

目的： 探讨FBXW7基因点突变对结直肠癌细胞株HCT-116增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。 方法： 通过构建FBXW7 基因野生型及突变型过表达的重组载体,并将其转染HCT-116细胞,应用Western blotting检测转染后FBXW7蛋白表达情况。 CCK-8检测细胞增殖能力,平板细胞克隆形成实验(HTCA)检测肿瘤细胞克隆形成能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,划痕及 Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移和侵袭能力。 结果： 转染野生型FBXW7基因的HCT-116细胞中FBXW7蛋白表达水平高 于对照组（转染突变型FBXW7基因的HCT-116细胞）、阴性对照组（转染空质粒载体pEZ-M90的HCT-116细胞）及空白对照组（未 进行任何特殊处理的HCT-116细胞） （均P<0.05）。转染野生型FBXW7的HCT-116细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力相较 于其余各组均显著下降（均P<0.05）,且细胞凋亡率显著升高（P<0.05）。 结论： FBXW7基因点突变可使其蛋白表达水平降低,从 而促进结直肠癌HCT-116细胞的增殖、迁移和侵袭,并抑制其凋亡。     

重组人生长激素对不同生长激素受体的人肝癌细胞的体外干预

[目的]研究重组人生长激素(rhGH)在体外对不同生长激素受体(GHR)表达的人肝癌细胞系的影响.[方法]采用免疫组织化学方法检测人肝癌细胞系GHR的表达.每种肝癌细胞分4组处理:未处理组、50ng/ml rhGH干预组、100ng/ml rhGH干预组和200ng/ml rhGH干预组.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)荧光染色、ELISA法分析不同浓度rhGH对人肝癌细胞系的生长率和增殖等影响.[结果]在GHR高表达细胞rhGH干预组生长率明显增高(P<0.05),CFSE荧光强度明显减弱(P<0.05).下游蛋白IGF-1明显增加.而GHR未表达、低表达肝癌细胞则未见明显影响(P0.05).[结论]rhCH对GHR高表达肝癌细胞明显促进增殖,并且下游蛋白IGF-1表达明显增加,rhGH对GHR无表达、低表达肝癌细胞不受影响其细胞增殖和ICF-1的表达.     

华蟾毒精对人结直肠癌SW-480、HT-29、HCT-116细胞的放疗增敏作用

目的探讨华蟾毒精对人结直肠癌SW-480、HT-29、HCT-116细胞的放疗增敏作用。方法选用SW-480、HT-29、HCT-116这3种人结直肠癌细胞株,细胞经单纯放疗和联合药物处理24 h、48 h、72 h后CCK8法检测细胞增殖,并于处理后48 h流式细胞仪测定细胞周期和凋亡。结果与单独放疗作用相比,华蟾毒精和放疗联合应用能明显抑制人结直肠癌SW-480、HT-29、HCT-116细胞增殖,同时诱导和促进人结直肠癌细胞的凋亡发生,调整细胞周期的变化。结论华蟾毒精可以增加人结直肠癌SW-480、HT-29、HCT-116细胞的放疗敏感性,提高放疗对人结直肠细胞的放射治疗效果。     

Midkine表达水平对人乳腺癌MDA．MB一231细胞转移潜能影响研究

目的：观察中期因子（midkine,MK）基因对人乳腺癌MDA—MB-231细胞增殖、迁移、黏附和侵袭能力的影响。方法：实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测人乳腺癌细胞株MCF-7、Bcap-37和MDA-MB-231中MKmRNA及蛋白表达,筛选出MK表达丰度较高的细胞株。采用脂质体2000将MKshRNA干扰质粒pSilencer-3．1-H1一MK和空载体对照质粒pSilencer-3．1-H1-NC转染到该细胞株,并设未处理对照组。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测干扰后MK基因和蛋白表达;CCK一8检测细胞增殖能力,与胞外基质蛋白作用30min后检测其黏附能力,Transwell检测细胞侵袭能力和迁移能力。结果：实时荧光定量PCR和蛋白质印迹检测结果显示,MDA—MR231细胞株适合做敲减验证。pSilencer-3．1-H1-MK干扰MDA—MB231细胞MK表达后,MK基因相对表达量为0．384-0．02,低于对照组0．76±0．04和空载体转染组0．84±0．04,F=144．85,P〈0．001;MK蛋白相对表达量为0．39±0．07,低于对照组0．95±0．04和空载体转染组0．99±0．02,F=26．49,P=0．001。CCK-8结果显示,细胞培养24、48和72h,MK基因干扰组细胞增殖能力明显低于低于对照组和空载体转染组,差异有统计学意义,P〈0．05。细胞黏附实验结果显示,与胞外基质蛋白作用30rain后,MK基因干扰组黏附细胞数为（21．87±5．17）％,低于对照组（38．74±4．98）％和空载体转染组（42．37±5．74）％,F=27．60,P〈0．001。Transwell迁移实验中,MK基因干扰组穿越Transwell小室的细胞个数为26．6±6．67,低于对照组（47．0±4．32）和空载体转染组（52．0±6．98）,F：44．98,P〈0．001。侵袭实验中,MK基因干扰组穿越Tr—answell小室的细胞个数为13．2±3．46,低于对照组（19．4±4．43）和空载体转染组（19．9±3．90）,F=8．94,P=0．001。结论：干扰MK的表达可显著抑制人乳腺癌MDA—MB-231细胞体外增殖     

MicroRNA-375表达对大肠癌细胞生物学特性的影响

目的:研究构建miRNA-375慢病毒表达载体并转染结直肠癌细胞,探讨其对结直肠癌细胞生物学特性的影响.方法:采用qRT-PCR法检测结直肠癌细胞株中miRNA-375表达水平.构建FUA-ZMCS-EF1-EGFP-miR-375/inhibitor慢病毒表达载体,建立稳定过表达miRNA-375及其抑制剂的HCT-116亚细胞系,体外观察细胞生长速度并绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞凋亡率,划痕实验检测miRNA-375对HCT-116细胞迁移能力的影响,Western blot法检测miRNA-375对细胞内ERK磷酸化水平的影响.结果:结直肠癌细胞株中miRNA-375低表达不但能促进细胞生长、抑制细胞凋亡,而且能促进细胞内ERK磷酸化水平、增加细胞迁移力和侵袭力.结论:结直肠癌miRNA-375发挥抑癌基因的作用,为miRNA-375在结直肠癌基因诊断及治疗中的应用提供了实验依据.     

二甲双胍对直肠癌细胞放疗敏感性的影响

目的 探讨二甲双胍（DMBG）对直肠癌细胞放疗敏感性的影响及其可能的作用机制。方法 体外培养直肠癌SW1463细胞，设对照组、DMBG组、照射组及DMBG+照射组，同时建立裸鼠移植瘤模型。MTT实验检测不同浓度（5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、80 mmol/L）DMBG作用SW1463细胞的细胞活力，克隆集落形成实验检测细胞克隆形成能力，流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期，免疫印迹法检测DNA损伤蛋白γ-H2AX及DNA损伤修复蛋白DNA-PK的表达，同时观察各组裸鼠移植瘤重量及体积变化，计算抑瘤率，绘制肿瘤生长曲线。 结果 不同浓度（5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、80 mmol/L）DMBG作用可抑制SW1463 细胞活力（F=43.283，P=0.021）。DMBG+照射组在不同照射剂量（2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy）照射下的细胞存活率均低于DMBG组及照射组（P<0.05），细胞凋亡率明显高于DMBG组及照射组［（63.32±6.15）% vs （16.19±4.38）%，P<0.05；（63.32±6.15）% vs （17.24±5.17）%，P<0.05 ］；DMBG+照射组G2 /M期细胞比例增加到（61.50±5.25）%，G0 /G1期细胞比例减少为（17.36±3.17）%，上调了γ-H2AX蛋白表达，并下调了DNA-PK蛋白表达，与DMBG组及照射组比较差异有统计学意义（P<0.05）；裸鼠移植瘤体积和重量明显变小，抑瘤率亦明显高于DMBG胍组和照射组［（68.51±2.58）% vs （20.74±2.61）%，P<0.05；（68.51±2.58）% vs （31.52±3.43）%，P<0.05］。结论 二甲双胍对直肠癌SW1463细胞及其裸鼠移植瘤具有放疗增敏作用，可能与DMBG联合放疗后改变肿瘤细胞周期分布，抑制肿瘤细胞对DNA损伤的自我修复能力有关。     

原发性肝癌组织中生长激素受体的表达及其意义

背景与目的:重组人生长激素(recombinehumangrowthhormone,rhGH)在调节代谢、降低外科病人死亡率方面,疗效明显,然而rhGH能否用于治疗原发性肝癌患者,目前存在较大争议。由于生长激素必须通过与其受体(growthhormonereceptor,GHR)结合方能发挥作用,因此本研究旨在通过了解原发性肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)组织生长激素受体的表达情况,探讨rhGH在肝癌患者中是否适用。方法:应用放射性配体法对40例HCC组织进行GHR的检测,以6例正常肝组织作为对照,肝组织GHR的受体最大结合量(RT)和平衡解离常数(Kd)采用Scatchard法计算;并分析肝癌GHR的RT值与肝癌临床病理特点之间的关系。结果:在正常肝组织与35例HCC组织中检测到单一的生长激素(GH)特异性结合位点(即GHR),对照组肝组织GHR的RT值为(39.5467±3.4770)fmol/mgprotein,Kd为(0.6167±0.1007)nmol/L,肝癌组织GHR的RT为(18.5416±4.1686)fmol/mgprotein,肝癌组织GHR的Kd值为(0.6319±0.1978)nmol/L,与正常肝组织相比,肝癌GHR的RT显著性降低(P<0.05),而Kd无显著性改变(P>0.05);肝癌组织GHR的RT值与肿瘤大小、患者临床分期呈显著性负相关,而与肿瘤分化程度、患者年龄、是否合并肝硬变无显著性相关。在5例肝癌组织未检测到GHR。结论:本组结果显示,大多数原发     

EGFR和TGF-α在肺癌细胞放疗增敏中的作用

目的 研究表皮生长因子受体（EGFR）、转化生长因子-α（TGF-α）与肺癌细胞不同放疗分割剂量的关系及可能作用机制。方法 对A549细胞采用常规分割（2 Gy／天）和大分割（4、8 Gy／天）照射，DT=8 Gy，采用实时荧光定量 PCR （QPCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）法、Western blotting分别检测A549细胞中EGFR、TGF-α基因和蛋白表达，另采用免疫荧光法测定γ-H2AX表达。结果 4 Gy／天和 8 Gy／天分割组A549细胞中EGFR、TGF-α mRNA表达水平均显著低于2 Gy／天组（P＜0.05）；4 Gy／天和 8 Gy／天分割组A549细胞中EGFR、TGF-α 蛋白表达均显著低于2 Gy／天组（P＜0.05）。免疫荧光法结果显示，4 Gy／天和 8 Gy／天分割组A549细胞中γ-H2AX表达明显高于对照组和2 Gy／天分割组。结论  大剂量分割放疗后EGFR、TGF-α 表达明显下调，增加A549细胞对放射线的敏感性，其机制可能与DNA损伤修复组蛋白γ-H2AX表达上调有关。     

放化同期治疗对局部晚期非小细胞肺癌血浆MGMT的影响及意义

目的:比较放化同期治疗和放化序贯治疗对局部晚期非小细胞肺癌血浆中MGMT的影响。方法:2010年1月至2012年12月,64例经病理确诊的Ⅱb至Ⅲb期非小细胞肺癌患者,随机分成放化同期治疗（A组）和放化序贯治疗（B组）两组。A组采用三维适形放疗及同期每周TC方案化疗后序贯TC方案化疗2个周期。B组先接受三维适形放疗后序贯TC方案化疗4个周期。在放射治疗前、放疗开始一个月和治疗后（两组均完成四个周期化疗后）采用巢式甲基化特异性PCR方法检测MGMT基因的甲基化状态。比较两组MGMT基因甲基化阳性率的动态变化情况。结果:A、B两组缓解率分别为90.6%和68.8%;A组近期治疗有效率明显优于B组（P=0.0296）。A组和B组的中位疾病进展时间为8.8个月(3-22个月)和7.3个月(2.8-21个月）（P=0.4635)。A、B两组1年生存率分别为74.1%、72.4%;2年生存率为46.8%、45.2%(P>0.05)。在放射治疗前,A组和B组的MGMT基因甲基化阳性率分别为31.3%（10／32)和34.4%（11／32),无显著性差异(P=0.7901);放疗开始1个月甲基化阳性率分别为15.6%（5／32)和37.5%（12／32),有显著性差异(P=0.0476);治疗后甲基化阳性率分别为9.4%（3／32)和21.9%（7／32),无显著性差异(P=0.1685)。治疗前后,A组MGMT基因甲基化阳性率显著下降(P=0.0296);B组有下降趋势但无显著差异。结论:放化同期治疗较序贯治疗能够有效降低局部晚期肺癌血浆中MGMT基因异常甲基化,提示同期化疗能够抑制肿瘤放疗过程中放疗诱发的肿瘤再修复。     

曲古菌素A对人结肠癌HCT-116细胞的作用及分子机制

目的：观察曲古菌素A对人结肠癌HCT-116细胞的作用。方法：采用不同浓度曲古菌素A（75、150、300、600ng/ml）分别处理人结肠癌HCT-116细胞,CCK8法检测其对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化;蛋白免疫印迹法检测细胞周期相关基因CyclinD1和DMTF1的表达。结果：曲古菌素A（75、150、300、600ng/ml）组的细胞抑制率在24h、48h、72h分别为（11.88±1.7、24.17±1.40、37.32±1.85）%、（21.00±1.45、31.22±2.10、54.94±1.71）%、（37.69±2.67、43.86±3.20、71.93±5.79）%和（51.90±2.60、61.80±4.90、87.93±5.39）%,不同浓度的曲古菌素A组细胞抑制率均明显高于对照组（P〈0.05）,不同浓度的曲古菌素A组细胞抑制率比较也有统计学差异（P〈0.05）。不同浓度的曲古菌素A作用48h后细胞以G0期居多,细胞阻滞在G0/G1→S期。不同浓度的曲古菌素A作用细胞48h后,凋亡率分别为（4.6±0.55）%、（37.06±7.89）%、（65.53±5.55）%、（75.93±3.28）%,各曲古菌素A组细胞凋亡率均明显高于对照组（P〈0.05）。蛋白免疫印迹法显示曲古菌素A可下调CyclinD1表达、上调DMTF1表达。结论：曲古菌素A可明显抑制结肠癌HCT-116细胞增殖,其机制可能与调控细胞周期相关基因CyclinD1和DMTF1的表达、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡等有关。     

Bcl-w对膀胱肿瘤细胞5637增殖、顺铂敏感性的影响

[目的]探讨过表达的Bcl-w蛋白对膀胱肿瘤细胞5637的增殖能力、顺铂敏感性的影响。[方法]采用质粒pcDNA3.1（＋）构建Bcl-w过表达载体,转染5637细胞后用Western blot验证过表达效果,用CCK-8、平板克隆形成实验、流式细胞仪检测pcDNA3.1-Bcl-w细胞和对照组细胞的增殖和生存曲线、克隆形成能力、细胞周期。[结果]成功构建pcDNA3.1-Bclw重组质粒并转染5637细胞。pcDNA3.1-Bcl-w细胞增殖曲线在24、48、72h均高于对照组（0.814±0.022 vs 0.727±0.017,P=0.006;1.259±0.017 vs 1.078±0.027,P=0.001;1.787±0.024 vs1.520±0.021,P〈0.001）,差异具有统计学意义;克隆形成能力高于对照组（60.67±6.03 vs48.67±6.11,P〈0.001）,差异具有统计学意义;处于G0/G1期的比例低于对照组（50.76%vs57.02%,P〈0.001）,差异具有统计学意义;在30、50、70、90、110μmol/L各浓度顺铂处理下生存曲线高于对照组[（83.8%±1.7%）vs（93.9%±1.2%）,P〈0.001;（59.5%±0.7%）vs（72.5%±1.9%）,P=0.028;（50.5%±2.2%）vs（57.2%±1.2%）,P=0.007;（37.2%±0.7%）vs（45.7%±1.4%）,P〈0.001;（29.1%±0.5%）vs（33.2%±0.6%）,P〈0.001],差异具有统计学意义。[结论]高表达的Bcl-w增强了膀胱癌细胞5637的增殖能力,削弱了肿瘤细胞对化疗药物顺铂的敏感性。     

槲皮素对宫颈癌HeLa细胞增殖影响机制探讨

目的：研究植物化学药物槲皮素对宫颈癌细胞的生长抑制作用和凋亡诱导效应,并探讨槲皮素对抗宫颈癌的可能作用机制。方法：采用浓度为10、20、40、80和160μmol/L槲皮素处理HeLa细胞,四唑盐比色法（MTT法）检测不同浓度在作用24、48和72h对HeLa细胞增殖的影响;流式细胞仪分析槲皮素对HeLa细胞凋亡的影响;逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法检测细胞内的MK和Caspase-3基因mRNA和蛋白表达水平。结果：槲皮素能抑制HeLa细胞增殖,且在一定浓度范围内呈时间浓度依赖性,P〈0.05;使用浓度为10μmol/L的槲皮素处理HeLa细胞48h凋亡率为（2.18±0.04）%,20μmol/L为（3.75±0.11）%,40μmol/L为（6.04±0.07）%,80μmol/L为（9.65±0.04）%,160μmol/L为（21.41±1.81）%,与空白对组的（1.64±0.12）%比较差异有统计学意义,F=300.80,P〈0.01;随槲皮素浓度的增高HeLa细胞中MK mRNA和蛋白表达依次下降,其中80和160μmol/L组下降较明显,而Caspase-3的mRNA和蛋白表达随药物浓度增高表达增强,P〈0.01。MK与Caspase-3的蛋白表达呈负相关,r=-0.922,P〈0.01;MK与Caspase-3的mRNA表达呈负相关,r=-0.955,P〈0.01。结论：槲皮素可显著抑制HeLa细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能通过下调MK、上调Caspase-3的表达水平而发挥抗宫颈癌作用。