小剂量阿司匹林协同干扰素-α诱导肝癌BEL-7402细胞凋亡的实验研究

目的 探讨小剂量阿司匹林协同干扰素-α(IFN-α)诱导肝癌BEL-7402细胞凋亡的作用及机制.方法 体外培养的人肝癌BEL-7402细胞经IFN-α单独或联合小剂量阿司匹林处理后,采用MTT法测定细胞的增殖情况;流式细胞术分析不同组药物对BEL-7402细胞凋亡的影响,Western blot检测BEL-7402细胞凋亡相关蛋白表达的变化.结果 MTT法检测显示,与对照组相比,作用48 h时IFN-α组和阿司匹林组的肝癌细胞增殖率分别为82.45％±1.71％和83.22％±2.26％,联合用药组为69.84％±1.18％,联合用药组细胞增殖抑制率明显低于单独用药组(P＜0.05);流式细胞术检测结果显示,IFN-α组和阿司匹林组细胞凋亡率分别为14.78％±1.93％和14.00％±0.61％,联合用药组为21.68％±1.28％,明显高于单独用药组(P＜0.05).Western blot检测发现IFN-α及小剂量阿司匹林可促进caspase-3及caspase-9的表达,而二者联合应用时caspase-3及caspase-9亦被明显激活.进一步检测显示,IFN-α单独或联合阿司匹林可促进肝癌细胞促凋亡蛋白Bax的表达(P＜0.05),而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl表达未见明显变化(P＞0.05).结论 小剂量阿司匹林可协同IFN-α抑制BEL-7402细胞的增殖,通过激活caspase-3及caspase-9诱导肿瘤细胞凋亡,该作用可能与促凋亡蛋白Bax表达的增高有关.     

组织蛋白酶S表达降低致肝癌细胞凋亡的机制研究

目的:探讨组织蛋白酶S(Cathepsin S,Cat S)表达降低后对肝癌细胞凋亡的影响及其机制。方法:选择2种肝癌细胞系MHCC97-H、Bel-7402,将肝癌细胞分为对照组、Con sh RNA组、Cat S sh RNA组。慢病毒介导的Cat S sh RNA转染肝癌细胞48 h后,Western blot检测Cat S表达变化;Annexin V/PI双染流式测细胞凋亡;Western blot检测内源性凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达变化;Western blot检测外源性凋亡相关蛋白Fas、Fas-L表达变化。结果:在肝癌细胞MHCC97-H、Bel-7402中,Cat S sh RNA可显著降低肝癌细胞中Cat S表达(P0.01);Cat S表达降低后,凋亡细胞显著增多(P0.01);内源性促凋亡蛋白Bax表达升高(P0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低(P0.01);外源性促凋亡蛋白Fas-L表达明显增强(P0.01),Fas表达无明显变化(P0.05)。结论:Cat S可同时通过内源性及外源性凋亡途径对肝癌细胞的凋亡进行调控。     

西罗莫司诱导人肝癌细胞株BEL-7402凋亡及其机制

目的探讨西罗莫司（SRL）在体外诱导人肝癌细胞株BEL-7402的凋亡作用及其机制。方法以不同浓度的SRL（5、10、20、30、40和50nmol／L）作用于体外培养的人肝癌细胞株BEL-7402，应用流式细胞仪检测培养24、48和72h时的细胞凋亡情况；Hoechst 33258荧光染色法观察细胞凋亡时的形态学变化；Western Blot法观察BEL-7402细胞中Caspase-3、Bcl-2、Bcl-xl和Bax基因的表达变化；采用Caspase-3试剂盒检测Caspase-3酶的活性；JCl染色法检测细胞线粒体膜电位（△ψbm）。结果SRL可诱导BEL-7402细胞凋亡，并与药物浓度和作用时间呈正相关。SRL作用BEL-7402细胞后48h，在Hoechst33258荧光染色图片上可见核浓缩及核碎裂等典型的细胞凋亡特征，凋亡过程中线粒体膜电位下降及Caspase-3酶原蛋白激活，伴有Bcl-2、Bcl-xl蛋白表达的降低和Bax蛋白上调。结论SRL能使抗凋亡蛋白Bcl-2、gcl-xl表达降低，促凋亡蛋白Bax表达上调，线粒体膜电位下降，激活Caspase-3酶原蛋白，从而诱导细胞凋亡。     

MAPKs信号转导通路在DHA诱导胃癌细胞凋亡中的作用

目的：探讨二十二碳六烯酸（DHA）对人胃癌细胞系SGC-7901的作用及对MAPKs信号转导通路中ERK1/2通路蛋白及凋亡蛋白caspase-3表达的影响。方法：采用MTT法及流式细胞仪技术对细胞增殖和凋亡进行观察和分析;应用Westernblot技术检测不同浓度的DHA诱导胃癌细胞的丝裂原活化蛋白激酶ERK1/2及其磷酸化水平的表达以及其下游通路中凋亡蛋白caspase-3的表达。结果：DHA对于SGC-7901胃癌细胞的增殖有明显抑制作用,呈现时间和浓度依赖性（P〈0.01）。DHA可诱导SGC-7901细胞凋亡,凋亡率随DHA的作用浓度增加而增加（P〈0.01）。ERK1/2在对照组和不同DHA浓度组稳定表达,且表达无差异;P-ERK1/2活性随DHA作用浓度的增高而降低,差异有统计学意义（P〈0.05）;caspase-3随着DHA浓度的增高表达不断增强,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：DHA可能通过下调ERK1/2的磷酸化过程,激活凋亡蛋白caspase-3的表达,诱导胃癌细胞的凋亡。     

脑源性神经营养因子对肝癌细胞氟尿嘧啶化疗敏感性的影响

目的：探讨外源性脑源性神经营养因子（BDNF）对人肝癌Bel-7402细胞氟尿嘧啶（5-FU）化疗敏感性的影响。 方法：分别用5-FU（5-FU组）和5-FU+BDNF（5-FU+BDNF组）处理Bel-7402细胞,以无干预的 Bel-7402细胞作为对照组。用MTT法、克隆形成试验和流式细胞仪检测细胞生长与凋亡情况,RT-PCR法检测细胞bcl-2 mRNA的表达。 结果：5-FU组细胞OD值、克隆形成数明显降低,细胞凋亡率明显升高,bcl-2 mRNA表达明显下调（均P<0.05）,与对照组比较差异均有统计学意义（均P<0.05）;而5-FU+BDNF组以上指标的改变均不明显,与对照组的差异均无统计学意义（均P>0.05）。 结论：BDNF能降低肝癌Bel-7402细胞5-FU化疗敏感性,该作用可能与BDNF上调bcl-2的表达,从而抑制细胞凋亡有关。     

淫羊藿苷对肝癌细胞株SMMC-7721增殖与凋亡的影响

目的:探讨淫羊藿苷对肝癌细胞株SMMC-7721的抑增殖和促凋亡作用及其机制。方法:以不同浓度(0,6.25,12.5,25,50,100,200,400,800μg/mL)的淫羊藿苷作用于SMMC-7721细胞株不同时间(24,48,72 h)后,用MTT法检测药物对SMMC-7721细胞增殖状态;以不同浓度淫羊藿苷作用SMMC-7721细胞48 h后,用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况,用Western blot检测细胞PCNA,Bcl-2,Bax蛋白的表达。结果:与对照组(0μg/mL)比较,各浓度的淫羊藿苷均明显抑制SMMC-7721细胞的增殖,并呈明显的时间与浓度依赖性(均P<0.05);淫羊藿苷呈浓度依赖性诱导SMMC-7721细胞发生G0/G1期阻滞和凋亡,下调SMMC-7721细胞PCNA蛋白和Bcl-2蛋白,上调Bax蛋白的表达(均P<0.05)。结论:淫羊藿苷可抑制SMMC-7721细胞增殖并诱导其凋亡。     

冬凌草甲素诱导胃癌细胞MKN45凋亡的实验研究

目的探讨冬凌草甲素对胃癌细胞MKN45生长及调亡的影响及其机制。方法MTT法检测冬凌草甲素对MKN45细胞生长抑制作用：AO／EB和Hoechest33258荧光染色法及倒置显微镜观察细胞形态学变化：单细胞分析系统PI单染检测细胞周期变化：采用单细胞分析系统Annexinv—PE和7-AAD双染色法检测细胞凋亡率：Western blot检测凋亡相关蛋白Bel-2、Bax和caspase-3的表达改变。结果冬凌草甲素对胃癌细胞MKN45具有明显的生长抑制作用,普通形态学、AO／EB及Hoechest33258荧光染色均可见典型的细胞凋亡改变。冬凌草甲素作用MKN45细胞12h后的细胞凋亡率为8．7％～17．9％,24h后的细胞凋亡率为13．9％．29．3％,与未加药对照组（12h：3．3％;24h：4．8％）比较,差异具有统计学意义（P〈0．01）。细胞周期分析显示冬凌草甲素使MKN45细胞增殖阻滞于G2-M期。Western blot检测显示．冬凌草甲素作用MKN45细胞后,Bax和caspase-3蛋白的表达随着药物作用浓度增高而增加．而Bcl-2蛋白表达无明显变化．Bcl-2／Bax比值减低。结论冬凌草甲素对胃癌细胞MKN45具有明显的增殖抑制作用：冬凌草甲素可能通过增加Bax蛋白表达．改变Bcl-2／Bax比率．继而启动caspase途径诱导胃癌细胞MKN45凋亡。     

苦参碱对雄激素依赖性前列腺癌细胞的影响

目的：探讨苦参碱（Matrine）对雄激素依赖性前列腺癌细胞株（LNCaP）凋亡及前列腺特异抗原（prostate specific antigen,PSA）表达的影响。方法：分别用0.5g／L、1.0g／L、1.5g／L、2.0g／L浓度的苦参碱作用于LNCaP细胞12h、24h、36h后MTT法检测细胞生长活性;24h后流式细胞仪测定细胞凋亡的变化;24h后Western印迹法检测细胞内Bel-2和Bax的表达;12h、24h、36h后化学发光法检测LNCaP细胞培养液中PSA的变化。结果：苦参碱能抑制LNCaP细胞的生长,呈剂量与时间依赖性,不同浓度苦参碱组之间与不同作用时间组之间的差异均有统计学意义（P〈0.05）。苦参碱诱导LNCaP细胞凋亡,各浓度组凋亡细胞比例均显著高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）;LNCaP细胞内Bcl-2含量呈浓度依赖性下降,Bax含量呈浓度依赖性升高（P〈0.01）;LNCaP细胞培养液中PSA的表达显著下降（P均〈0.05）。结论：苦参碱能显著抑制LNCaP细胞的体外生长,诱导其凋亡,并抑制PSA的表达。     

金荞麦提取物调控DDIT4对肾癌细胞凋亡的影响

目的:探讨金荞麦提取物Fr4对肾癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法:采用不同浓度Fr4处理肾癌细胞786-O,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测786-O细胞中Cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax、DDIT4表达。建立过表达DDIT4细胞。在786-O细胞中转染si-DDIT4,并用400μg/ml Fr4处理,研究786-O细胞增殖、凋亡变化。结果:Fr4明显抑制786-O细胞活性(P0.05),并呈剂量和时间依赖性;不同浓度Fr4显著减少Cyclin D1蛋白表达量,提高P21蛋白水平(P0.05),并呈剂量依赖性。400μg/ml的Fr4明显增加细胞凋亡率和Bax、DDIT4蛋白表达量(P0.05),降低Bcl-2蛋白水平。过表达DDIT4显著抑制24 h、48 h、72 h的细胞活性及Cyclin D1、Bcl-2蛋白水平,增加细胞凋亡率、P21和Bax蛋白表达量(P0.05)。抑制DDIT4逆转了Fr4对786-O细胞增殖、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达的抑制作用,和对细胞凋亡、DDIT4、P21和Bax蛋白表达的促进作用。结论:金荞麦提取物Fr4通过调控DDIT4表达抑制肾癌细胞增殖,并诱导其凋亡。     

过度训练可通过破坏Bax/Bcl-2平衡激活caspase依赖的凋亡通路诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡

目的 观察过度训练大鼠肾组织Bax、Bcl-2及 caspase-3的表达及其与肾小管上皮细胞凋亡的关系,探讨caspase依赖的凋亡信号途径在其中的作用及其机制。 方法 将48只雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为对照组（CN）、力竭运动组（ES）、旋覆花素干预组（IB）。CN组为安静对照;ES组又根据力竭后恢复时间分为力竭后即刻（ESI）、力竭后6 h（ES 6 h）和力竭后24 h（ES 24 h）组;IB组于力竭运动前24 h 给予旋覆花素25 ml/kg分3次灌胃后进行力竭运动,分为IB 6 h和IB 24 h组。采用大鼠游泳至力竭建立过度训练模型。TUNEL法检测肾小管上皮细胞凋亡。免疫组织化学法检测肾组织Bax、Bcl-2及 caspase-3的表达。Western印迹法测定肾组织caspase-3蛋白的表达。用图像分析系统测定肾小管凋亡细胞、Bax、Bcl-2及 caspase-3表达的平均吸光度并计算Bax和Bcl-2的比值。用Pearson法分析Bax和Bcl-2的比值与caspase-3之间的相关性。用非参Spearman法分析Bax/Bcl-2的比值和caspase-3与细胞凋亡之间的相关性。 结果 TUNEL法显示,过度训练大鼠肾组织凋亡细胞主要分布在肾小管上皮细胞,力竭后即刻、6 h及24 h肾小管上皮细胞凋亡数呈进行性增多（P < 0.01）;免疫组化显示,过度训练大鼠肾组织caspase-3的表达及分布与Bax/Bcl-2比值变化及凋亡细胞的分布一致。图像分析显示,大鼠肾小管上皮细胞Bax/Bcl-2比值与caspase-3的表达于力竭后即刻、力竭后6 h、力竭后24 h逐渐增高（均P < 0.05）,均显著高于对照组（均P < 0.05）。Western 印迹测定结果也显示caspase-3蛋白表达的变化趋势。过度训练大鼠肾小管上皮细胞Bax/Bcl-2比值与caspase-3的表达呈正相关（r = 0.865,P < 0.05）;Bax/Bcl-2比值和caspase-3的表达与肾小管上皮细胞凋亡之间均呈正相关（r = 0.674,r = 0.837,均P < 0.05）。用旋覆花素干预后,过度训练引起的肾小管上皮细胞Bax/Bcl-2比值增高和caspase-3的过度表达及肾小管上皮细胞的过度凋亡均被显著抑制（均P < 0.05）。 结论 过度训练可通过破坏肾小管上皮细胞Bax/Bcl-2的平衡,激活caspase依赖的凋亡信号通路,进而诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡。这可能是过度训练引起肾小管上皮细胞凋亡的分子机制之一。     

垂体中叶素对肾脏缺血再灌注大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨垂体中叶素（IMD）对肾脏缺血再灌注（I/R）大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响及相关机制。 方法 健康雄性Wistar大鼠24只随机分为假手术组、I/R组、空质粒组、IMD质粒组。动物右肾切除后,采用超声微泡法,将空质粒或IMD质粒转染入左肾,1周后制作肾脏I/R模型。TUNEL法测定细胞凋亡;半定量RT-PCR检测Bax、Bcl-2、Fas的mRNA表达水平;比色法检测caspase-8、-9的活性;Western印迹法检测caspase-3蛋白的表达水平。 结果 与假手术组相比,I/R组细胞凋亡率增高,Bax、Fas mRNA表达增加,bcl-2 mRNA表达下降,caspase-8、-9活性增强,caspase-3蛋白表达增加（均P < 0.05）。与I/R组相比,IMD转染组细胞凋亡率明显降低,Bax、Fas的mRNA表达下降,bcl-2的mRNA表达增加,caspase-8、-9活性减弱,caspase-3蛋白表达减少（均P < 0.05）。转空质粒组与I/R组比较,各指标差异均无统计学意义。 结论 IMD能上调bcl-2表达,降低bax、Fas的表达,降低caspase-8、-9活性,从而抑制肾脏I/R损伤所诱导的凋亡。     

MG-132对肝癌细胞BEL7402凋亡及超微结构影响的实验研究

目的:探讨泛素-蛋白酶体通路阻断剂MG-132对肝癌细胞BEL7402细胞凋亡和超微结构的影响。方法:以5和10μmol／L MG-132分别处理人肝癌BEL7402细胞24和48h,用流式细胞术检测细胞凋亡;DNA片段分析进一步证实凋亡存在,Western印迹检测Bax蛋白表达,比色法测Caspase-3活性变化,用透射电镜观察细胞超微结构的变化。结果:随着MG-132浓度的增加和处理时间延长,细胞凋亡率增加;细胞DNA抽提电泳发现特征性凋亡梯状条带;Bax蛋白表达增加;Caspase-3活化;电镜观察到典型凋亡细胞,线粒体等细胞器的形态变化与MG-132浓度和作用时间有关。结论:蛋白酶体抑制剂MG-132可诱导肝癌细胞BEL7402凋亡;线粒体损伤、Bax蛋白上调、Caspase-3激活可能在MG-132 诱导BEL7402细胞凋亡起重要作用。     

重组人生长激素对体外培养的Bel-7402肝癌细胞生长激素受体的调控作用

目的 了解重组人生长激素(rhGH)对体外培养的Bel-7402肝癌细胞生长激素受体(GHR)的调控作用.方法 采用放射配体法了解7402肝癌细胞生长激素受体(GHR)的表达情况,检测不同浓度(0,1,10,100,1000,10 000 ng/ml)rhGH对肝癌细胞GHR表达的影响,用辣根过氧化酶法了解7402肝癌细胞培养上清液的胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)的变化,采用肿瘤细胞计数、噻唑蓝比色法了解肝癌细胞在不同浓度rhGH作用下药物敏感性,计算细胞生长率;用流式细胞计了解肝癌细胞在上述浓度rhGH作用下细胞周期各时相细胞比率、细胞增殖指数(PI)以及凋亡率变化.结果 放射配体法发现7402肝癌细胞表达GHR,在rhGH作用后24 h,7402肝癌细胞GHR的位点数量在10与100 ng/ml实验组较对照组增加(P<0.05),在10 000 ng/ml组较对照组降低(P<0.05);rhGH作用后的24 h与48 h,7402肝癌细胞上清液IGF-Ⅰ浓度在100 ng/ml组较对照组显著增高(P<0.05);与此同时,rhGH对体外培养的7402肝癌细胞增殖具有一定程度刺激作用,表现为rhGH在100 ng/ml浓度时促进肝癌细胞增殖较显著,而rhGH在其它浓度(1,10,1000,10 000 ng/ml)对肝癌细胞的增殖虽能表现出一定程度促进作用,但总体效果较rhGH在100 ng/ml浓度为弱.rhGH作用48 h流式细胞检测发现各实验组S期所占比率、PI均较对照组升高(P<0.05);G2-M细胞所占比率,10 ng/ml组与100 ng/ml组较对照组显著增高(P<0.05);各实验组凋亡率与对照组比较无显著差异.结论 rhGH可促进7402肝癌细胞DNA的合成,提高肿瘤细胞分裂增殖能力,原因可能与7402肝癌细胞表达GHR,rhGH可在一定浓度范围内上调7402肝癌细胞GHR的表达,促进肿瘤细胞合成IGF-Ⅰ有关,其确切途径仍有待进一步验证.     

姜黄素对HepG-2细胞增殖与凋亡的影响

目的：检测姜黄素对肝癌HepG-2细胞增殖及细胞凋亡的作用,以及对核转录因子κB（NF-κB）表达的影响。方法：不同浓度（10,25,50,100 μmol/L）姜黄素处理肝癌HepG-2细胞不同时间后（16,24,48 h）,采用CCK-8法检测细胞增殖抑制率;50 μmol/L的姜黄素处理HepG-2细胞24 h后,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;不同浓度（10,25,50,100 μmol/L）姜黄素处理肝癌HepG-2细胞24 h后,用Western blot方法检测NF-κB p65蛋白的表达。结果：姜黄素能明显抑制HepG-2细胞的增殖,并呈时间和浓度依赖性（均P<0.05）;姜黄素作用后,HepG-2细胞凋亡率较对照组明显增高（P<0.05）;姜黄素能浓度依赖性抑制地HepG-2细胞 NF-κB p65蛋白的表达。结论：姜黄素能抑制HepG-2细胞增殖并促进其凋亡,其机制可能系通过阻断NF-κB信号通路有关。

     

上调miR-449a表达对肝癌细胞生长和侵袭能力的影响

目的:探讨miR-449a在肝癌(HCC)细胞中的表达及其对HCC细胞生物学行为的影响。方法:用qRT-PCR检测miR-449a在正常肝细胞L02和4种HCC细胞株(HepG2、Hep3B、SMMC-7721和Bel-7402)的表达。用脂质体法将miR-449a模拟物或阴性对照序列转染HCC细胞后,分别用CCK-8法、流式细胞术、Transwell小室实验检测细胞增殖、细胞周期、侵袭能力的变化,并观察以上两种不同转染的HCC细胞在裸鼠体内的成瘤情况。结果:miR-449a在4种HCC细胞株的表达水平均明显低于L02细胞(均P0.05),其中在Bel-7402细胞表达的水平最低。与转染阴性对照序列的Bel-7402细胞比较,转染miR-449a模拟物的Bel-7402细胞增殖活性明显降低、G_1/S期阻滞明显增加、穿室细胞数明显减少(均P0.05);与转染阴性对照序列的Bel-7402细胞比较,转染miR-449a模拟物的Bel-7402细胞在裸鼠体内成瘤后的移植瘤质量与体积均明显减小(0.748 g vs.1.234 g;33.667 mm~3 vs.1 400.500 mm~3,均P0.05)。结论:HCC细胞中miR-449a表达降低,上调miR-449a表达可以抑制HCC细胞在体内外的生长。     

Negative feedback loop in the Bim-caspase-3 axis regulating apoptosis and activity of osteoclasts.

Proapoptotic Bcl-2 family member Bim plays an essential role in the osteoclast apoptosis and is degraded through ubiquitin/proteasome pathways in a caspase-3-dependent manner. This negative feedback loop in the Bim-caspase-3 axis is important for regulating the survival and activity of osteoclasts. INTRODUCTION: Bim is a member of the proapoptotic Bcl-2 family and regulates the mitochondrial apoptosis pathway. Bim expression is post-translationally regulated in osteoclasts (OCs) through ubiquitin/proteasome pathways, and Bim is critical for their survival and activity. MATERIALS AND METHODS: Time-course of change in the expression of Bim in the course of OC apoptosis was examined, and the effect of various proteinase inhibitors on the degradation of Bim was analyzed. The role of caspase-3 and caspase-7 on Bim degradation was studied using RNA interference technique and caspase-3(-/-) mice. RESULTS: Bim was degraded after caspase-3 activation, which was suppressed by a caspase inhibitor and a proteasome inhibitor. Bim degradation was suppressed by gene knockdown of caspase-3 or in caspase-3(-/-) OCs but not by caspase-7 knockdown. OCs generated from caspase-3(-/-) bone marrow cells exhibited a shorter life span and higher bone-resorbing activity than normal OCs. Association of Bim with E3 ubiquitin ligase c-Cbl was suppressed by gene knockdown of caspase-3 or in caspase-3(-/-) OCs. Actin ring formation and cathepsin K expression were promoted in caspase-3(-/-) OCs. CONCLUSIONS: Caspase-3 negatively regulates Bim expression by stimulating its degradation through ubiquitin/proteasome pathways, thus creating a negative feedback loop in the Bim-caspase axis.