LncRNA DANCR靶向调控对绝经后骨质疏松BMSCs成骨分化的作用

目的 研究长链非编码RNA（lncRNA）分化非蛋白编码 RNA（DANCR）靶向微小RNA（miR）-19a-3p对绝经后骨质疏松（PMOP）骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化的调控作用。方法 选择健康女性志愿者4例和PMOP患者4例，分离培养BMSCs；PMOP患者BMSCs进行分组，转染阴性对照（NC）siRNA、lncRNA DANCR siRNA、miR-NC抑制物、miR-19a-3p抑制物。检测lncRNA DANCR、miR-19a-3p、PTEN的表达水平，成骨诱导分化后检测茜素红染色的OD405水平、碱性磷酸酶（ALP）活力、骨钙素（OCN）及骨桥蛋白（OPN）的mRNA表达水平。结果 PMOP患者BMSCs中lncRNA DANCR、PTEN的表达水平高于健康女性，miR-19a-3p的表达水平及成骨诱导后的OD405水平、ALP活力、OCN及OPN的表达水平均低于健康女性。在PMOP患者BMSCs中，si-DANCR组的lncRNA DANCR、PTEN的表达水平低于si-NC组，成骨诱导后的OD405水平、ALP活力及miR-19a-3p、OCN、OPN的表达水平高于si-NC组；si-DANCR+miR-19a-3p抑制物组成骨诱导后的OD405水平、ALP活力及miR-19a-3p、OCN、OPN的表达水平低于si-DANCR+miR-NC抑制物组，PTEN的表达水平高于si-DANCR+miR-NC抑制物组。结论 LncRNA DANCR靶向miR-19a-3p调控PMOP患者BMSCs的成骨分化。     

新型活性修饰聚乳酸组织工程骨的体外成骨研究

[目的]探讨氨等离子体改性、酰胺键接枝甘氨酸-精氰酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(GRGDS)短肽的活性修饰方法对消旋聚乳酸(PDLLA)组织工程骨体外成骨能力的影响.[方法]制备圆片状直径8 mm、厚1 mm的PDLLA三维多孔支架,分为三组:表面氨基化PDLLA(aminated PDLLA,A/PDLLA,A组),接枝肽A/PDLLA(peptides conjugated A/PDLLA,PA/PDLLA,PA组),以未经处理的PDLLA(P组)作为对照组.实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测符组材料上骨髓间允质干细胞(BMSCs)、骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、碱性磷酸酶(ALP)、骨形态发生蛋白-2(Bmp-2)和骨桥蚩白(OPN)mRNA的表达变化并进行ALP活性测定和钙黄绿素矿化荧光染色.[结果]qPCR结果示:第3 d,PA组各基因表达倍数均较P组高;除OCN外的各基因表达也均较A组高.第7 d,A组OCN(13.13±1.28)、Col-Ⅰ(23.71±6.51)和OPN(27.4±7.17)mRNA表达倍数为最高,PA组次之.第14 d,多数基因表达上调,A组和PA组表达倍数较对照组明显增高.PA组OCN(49.21±7.03)、ALP(24.26±3.41)和BMP-2(11.82±2.38)mRNA的表达较A组高,差异有统计学意义(P＜0.05).ALP活性检测结果示:A组和PA组ALP活性持续升高,P组活性第21 d较第14 d时略有下降.第7 d,A组和PA组之间ALP活性比较无统计学意义(P＞0.05),但均高于P组(P＜0.01);第14 d和第21 d,三组间ALP活性两两比较均有统计学意义,ALP活性PA组＞A组＞P组.钙黄绿素矿化荧光染色观察示,骨支架上钙盐沉积与ALP的活性变化趋势相平行.[结论]氨等离子体改性能够促进聚乳酸组织工程骨支架上BMSCs早期向成骨细胞分化,改性后接枝GRGDS肽的新型活性修饰PDLLA具有更好的促BMSCs体外成骨能力.     

白茅苷对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞功能和骨量的影响

目的观察白茅苷治疗去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞功能和骨量的影响并初步探索可能机制。方法通过双侧去卵巢建立骨质疏松大鼠模型;随后随机分为假手术组(Sham)、去卵巢组(OVX)以及白茅苷组(BMG),每组10只;其中BMG组去卵巢大鼠每天给予白茅苷(20 mg/kg)灌胃治疗;待12周治疗结束后分离培养各组大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),使用碱性磷酸酶(ALP)和茜素红(ARS)染色并使用蛋白质印迹检测BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1蛋白表达;进一步使用Micro-CT和骨生物力学检测观察治疗效果。结果 OVX组大鼠BMSCs向成骨细胞分化后ALP和ARS染色阳性面积以及BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1表达较Sham组明显降低(P0.05);而经过BMG治疗,BMG组大鼠BMSCs向成骨细胞分化后ALP和ARS染色阳性面积以及BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1表达较OVX组明显增加(P0.05)。OVX组股骨最大载荷和弹性模量、BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th较Sham组明显降低,而Tb.Sp则明显升高(P0.05)。BMG组左侧股骨最大载荷和弹性模量、BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明显高于OVX组(P0.05),而Tb.Sp明显低于OVX组(P0.05)。结论白茅苷通过促进BMSCs诱导成骨分化来减少去卵巢大鼠骨骨密度、骨量和骨强度下降。     

插头框旋转录因子C2转染BMSCs后成骨作用的研究

[目的]观察过表达Foxc2基因对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及成骨分化的影响。[方法]构建携带Foxc2和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组慢病毒表达载体,分离、培养兔BMSCs,分别以Lenti-GFP(GFP组)、Lenti-Foxc2(Foxc2组)转染BMSCs,另设未转染BMSCs对照组。MTT法检测过表达Foxc2对细胞增殖能力;Western blot、Real time PCR检测转染后7d各组细胞Foxc2蛋白、m RNA表达;以及转染后1、2、4周各组细胞骨钙蛋白(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、一型胶原(COLⅠ)蛋白及m RNA表达;转染后2周,各组行碱性磷酸酶(ALP)染色和ALP活性检测。[结果]Foxc2组Foxc2 m RNA和蛋白高效表达;对照组、GFP组无Foxc2 m RNA及蛋白表达;MTT法检测示过表达Foxc2对BMSCs的增殖未产生显著影响;Foxc2组OCN、OPN、COLⅠm RNA和蛋白表达显著高于其他组(P<0.01),余组比较差异无统计学意义(P>0.05);Foxc2组ALP染色阳性区域大于其余两组;ALP活性显著高于其他各组(P<0.01)。[结论]过表达Foxc2不影响细胞增殖,可持续表达基因产物,并可促进BMSCs向成骨细胞分化。     

人骨膜细胞体外成骨分化的基因表达和功能检测

目的 探讨并鉴定骨膜细胞经骨形成蛋白7(BMP7)诱导分化为成骨细胞的基因表达和细胞功能.方法 成人胫骨骨膜常规体外细胞培养法,分实验组和对照组,分别加入BMP7加成骨辅助剂和单纯成骨辅助剂进行体外培养.CCK-8法检测细胞增殖活性,第5、10、15和20天分别采用Real Time-PCR检测骨钙素基因表达,ELISA法检测上清液碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的水平,甲苯胺蓝染色检测糖胺聚糖(GAG),Real Time-PCR检测Ⅱ型胶原基因,比色法检测细胞ALP活性,ALP染色法检测ALP,Yon Kossa染色法检测钙结节.结果 两组骨钙素基因表达及上清液ALP、骨钙素、骨桥蛋白的含量均增高,实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).两组细胞的ALP和钙结节染色阳性率增高,实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).甲苯胺蓝染色阳性率及Ⅱ型胶原基因表达表现为先高后低,实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 骨膜细胞在BMP7诱导下体外大量增殖和分化成骨,表达出明显的成骨特异基因,并具有合成分泌成骨特异蛋白的功能;成骨化过程中,除直接分化成骨外,还存在部分细胞先经软骨形成再钙化成骨的现象;经骨膜细胞-BMP7途径在体外获取大量成骨细胞可用于组织工程的体外构骨及临床应用.     

miR-187-5p 对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的调控作用

目的利用小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨分化模型,探讨miR-187-5p在成骨分化中的表达趋势及调控作用。方法通过切除雌性小鼠双侧卵巢构建小鼠骨质疏松模型;应用qRT-PCR技术检测组织和细胞中miR-187-5p的表达;应用基因转染技术观察过表达或敲减miR-187-5p对BMSCs向成骨分化的影响;应用茜素红和碱性磷酸酶染色检测BMSCs中矿化结节的数量和矿化区域的染色面积。结果 qRT-PCR结果显示miR-187-5p在骨质疏松模型小鼠的骨组织及BMSCs中均表达下降。过表达miR-187-5p可提高ALP、Collagen-1、Runx2、BMP4、OCN和OPN等成骨分化相关基因mRNA的表达,促进BMSCs向成骨分化;而敲减miR-187-5p降低ALP等成骨分化相关基因mRNA的表达,抑制BMSCs向成骨分化。在体实验同样证实,过表达miR-187-5p可以显著促进骨质疏松小鼠BMSCs向成骨分化,改善小鼠的骨质疏松表型。结论过表达miR-187-5p促进BMSCs向成骨分化,敲减miR-187-5p抑制BMSCs向成骨分化。     

不同血清对成人骨髓基质干细胞成骨诱导分化的影响

[目的]探讨三种不同来源血清对体外培养成人骨髓基质干细胞(hBMSCs)向成骨诱导分化的作用.[方法]将体外第3代hBMSCs向成骨诱导分化培养,分为胎牛血清组(对照组)、AB 血清组和自体血清组.对比观察细胞碱性磷酸酶(ALP)染色、钙结节染色.诱导培养后4、7、14 d 和 21 d,各血清组分别进行钙黄绿素法荧光显微镜动态观察矿盐沉积,检测 ALP 活性,实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)法检测成骨基因(ALP)、骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)的表达.[结果]ALP 染色和钙结节染色结果显示,与自体血清(AS)组、胎牛血清(FBS)组相比,AB 血清(ABS)组明显提高了 hBMSCs 的染色阳性率.荧光显微镜下观察诱导 21 d 的 hBMSCs,ABS 组较 FBS 组、AS 组呈现更多的钙盐沉积.ALP 活性结果显示,同一时间点 ABS 组的 ALP 活性均明显高于 FBS 组和 AS 组,差异有统计意义(P<0.05).RT-qPCR 结果显示,在7、14 d 和 21 d,ABS 组 ALP、OPN 和 OCN 成骨基因表达均明显高于 FBS 组、AS 组,其中,ALP 基因表达在 7 d 出现峰值,OPN 基因表达在 14 d 出现峰值,OCN 基因表达在 21 d 出现峰值,差异均有统计学意义(P<0.05).[结论]ABS 对 hBMSCs 成骨分化作用较 FBS、AS 明显增强.ABS 有望替代 FBS 建立符合骨组织工程临床应用要求的体外 hBMSCs 培养体系.     

左归丸含药血清调节Runx2激活ALP、OPN蛋白促进BMSCs增殖和分化的研究

目的 探讨左归丸（Zuoguiwan,ZGW）的补肾填精、益髓壮骨的作用,促进骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的增殖和向成骨细胞方向分化。方法 制备ZGW含药血清,设置10% FBS DMEM组、成骨诱导液组、2.5%空白大鼠血清-成骨诱导液组、2.5% ZGW含药血清-成骨诱导液组。采用MTT法观察各组对BMSCs的增殖,使用碱性磷酸酶钙钴染色法检测BMSCs向成骨细胞方向的分化能力,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）法检测细胞培养液中AKP的含量,Western blot检测BMSCs中Runt相关转录因子2（Runx2）、骨钙蛋白（osteocalcin,OPN）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）蛋白的表达。结果 2.5% ZGW含药血清-成骨诱导液组能够促进BMSCs的快速增殖,较早地进入平台期,促进BMSCs中AKP的分泌,提高ALP含量,上调BMSCs细胞中Runx2、ALP和 OPN的蛋白表达水平。结论 ZGW抗骨质疏松的分子机制,可能与调节Runx2激活ALP、OPN蛋白表达,促进BMSCs增殖和向成骨细胞方向分化有关。     

2型糖尿病性骨质疏松大鼠ADSCs成骨能力的研究

目的探讨2型糖尿病性骨质疏松(DOP)大鼠自身脂肪干细胞(ADSCs)的体外成骨分化能力。方法将60只SD大鼠分为对照组、骨质疏松组(OP组)及2型糖尿病性骨质疏松组(DOP组),每组20只。DOP组大鼠喂食高脂高糖饲料后于左下腹部经腹腔注射STZ先建立2型糖尿病大鼠模型,再行卵巢切除术建立2型糖尿病性骨质疏松模型;OP组大鼠行卵巢切除术建立骨质疏松大鼠模型,对照组仅切除卵巢周围脂肪。对照组随机选取10只大鼠,DOP组及OP组从建模成功的大鼠中各随机选取10只作研究。从各研究大鼠腹股沟区脂肪组织中分离脂肪干细胞,培养并传代,取第3代细胞作成骨结节染色及定量分析,PCR检测成骨基因RUNX2、OCN、OPN、ALP mRNA的表达。结果造模后DOP组大鼠BMD明显低于对照组及OP组(P0.05);三组大鼠ADSCs细胞形态学及增殖情况无显著性差异;显微镜下观察见DOP组与OP组ADSCs的钙化结节量较对照组少,DOP组钙化结节最少,并且缺少大片状结节,染色较浅;成骨定量分析结果可得DOP组ADSCs的OD值低于对照组及OP组,差异有统计学意义(P0.05);RT-PCR检测成骨基因的表达,DOP组与OP组RUNX2、OCN、OPN、ALP mRNA的表达量均低于对照组(P均0.05),DOP组与OP组相比较,DOP组RUNX2与ALPmRNA的表达量明显低于OP组(P0.05),而OCN与OPNmRNA的表达量两组无明显差异(P0.05)。结论 DOP大鼠ADSCs成骨分化能力较弱,弱于单纯骨质疏松大鼠,原因可能与高血糖状态下其ADSCs中ALP和RUNX2的表达减少有关。     

尼古丁对体内外成骨活性的影响

目的 观察尼古丁对体外培养的成骨细胞活性和体内成骨活性因子的影响.方法 用含不同浓度尼古丁(1×10-4 mol/L)的DMEM培养基体外培养成骨细胞,分别用噻唑蓝(MTT)比色法检测成骨细胞的增殖,并检测尼古丁对成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性和钙结节形成能力的影响,用酶联免疫吸附试验( ELISA)测定大鼠血清中骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和ALP水平,逆转录-聚合酶链反应( RT-PCR)测量尼古丁作用后大鼠股骨中骨桥蛋白(OPN)、ALP、Ⅰ型胶原蛋白(COL1)的mRNA表达变化.结果 与对照组比较,体外尼古丁处理对成骨细胞的增殖起抑制作用,尼古丁可降低成骨细胞的ALP活性,抑制成骨细胞钙结节形成,尼古丁可以导致大鼠血清中BMP-2和ALP水平下降,并抑制股骨中OPN、ALP、COL1 mRNA表达.结论 尼古丁可抑制成骨细胞的活性,并对体内成骨相关因子也有抑制作用.     

积雪草苷通过TGF-β/Smads通路对BMSCs成骨分化的影响

目的 探讨积雪草苷对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨分化的诱导作用以及潜在机制。方法 使用6个浓度的积雪草苷（0、5、10、20、30、40 μmoL/L）作用BMSCs,利用CCK-8与检测细胞增殖率与细胞凋亡率,筛选出积雪草苷对BMSCs最大无毒浓度。将BMSCs分成3组,空白对照组、积雪草苷组与抑制组,空白对照组正常培养,积雪草苷组使用积雪草苷对BMSCs进行诱导成骨分化,抑制组在此基础上加用SB-431542（50 moL/L）处理。诱导12 d后,茜素红染色观察细胞中矿化结节的数量,RT-qPCR检测细胞中碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OPN）和骨钙素（OCN）基因表达水平,Western blot检测细胞中转化生长因子-β1（TGF-β1）、Smad2、p-Smad2、Smad3和p-Smad3蛋白表达水平。结果 20 μmoL/L的积雪草苷对BMSCs无明显抑制效果。与空白对照组相比,积雪草苷促进BMSCs钙化结节形成增多,ALP、OPN和OCN基因表达水平升高,TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3蛋白表达水平升高（均P＜0.05）;积雪草苷在TGF-β/Smads通路被抑制的情况下仍然能发挥诱导BMSCs成骨分化作用。结论 积雪草苷具有诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的潜力,可能涉及的机制为激活细胞中TGF-β/Smads通路,上调OPN、ALP与OCN基因表达量,帮助骨髓间充质干细胞完成成骨分化。     

双基因pCDNA 3.1-NGF-IRES-BMP2真核质粒转染大鼠BMSCs诱导成骨的研究

[目的]研究双基因NGF与BMP2转染大鼠BMSCs并诱导BMSCs成骨分化后表达情况。[方法]将第三代大鼠BMSCs,分为五组,单基因pCDNA3.1-NGF转染组(A组),单基因pCDNA3.1-BMP2转染组(B组),双基因pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2转染组(C组),空质粒对照组(D组)、阴性对照组(E组)。运用Lipofectamine2000介导将各组基因转染BMSCs,Western-blot检测目的基因蛋白表达情况,免疫组织化学染色检测I型胶原蛋白表达含量并测定灰度值。ALP试剂盒检测ALP表达含量,茜素红染色测定转染后各组钙结节并计数。[结果]各组基因转染BMSCs后,Western-blot、I型胶原免疫组化染色、ALP试剂盒检测、茜素红染色钙结节及统计学分析均提示双基因转染组的目的蛋白表达量、I型胶原蛋白表达量、ALP表达量、钙结节形成数目均高于单基因转染组、空质粒组及阴性对照组。[结论]转染双基因pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2组BMSCs可同时表达两种目的蛋白,能诱导BMSCs向成骨细胞分化,NGF的加入能够增强BMP2的成骨作用。     

成骨细胞条件培养液对BMSCs诱导分化作用研究

目的 探讨大鼠成骨细胞条件培养液对同种大鼠BMSCs的成骨诱导分化作用,为骨组织工程种子细胞的获得寻找一种新方法 . 方法 健康1周龄SD大鼠10只,雌雄不限,体重20～30 g,采用贴壁法和酶消化法分别获得BMSCs和成骨细胞,并进行鉴定.无菌条件收集第1～5代成骨细胞培养液上清,与完全培养基1:1混合,制备成骨细胞条件培养液,与第2代BMSCs共培养为诱导组,相同代次BMSCs与完全培养液共培养为对照组.倒置相差显微镜下观察共培养后BMSCs形态变化,MTT法检测BMSCs生长情况,免疫组织化学染色检测共培养后BMSCs的ALP、Col Ⅰ、骨钙素(osteocalcin,OCN)蛋白的表达,采用RT-PCR检测Col Ⅰ、OCN mRNA的表达. 结果 诱导组共培养7 d BMSCs体积变大,细胞由长梭形展开为扁平形和多边形,并带有突起;9 d细胞呈集落状生长.细胞生长曲线示BMSCs数量随培养时间延长而增加,对照组增殖能力较诱导组强;诱导培养4～7 d,对照组细胞数量与诱导组比较差异有统计学意义(P<0.05).诱导组培养12 d,ALP染色呈阳性表达;18 d 出现钙结节;21 d Col Ⅰ和OCN呈阳性表达;对照组均呈阴性表达.RT-PCR检测示诱导组培养21 d有Col Ⅰ、OCN mRNA表达,对照组未见表达. 结论 体外大鼠成骨细胞条件培养液有明显的诱导同种大鼠BMSCs向成骨样细胞分化的作用.     

特异性阻抑DKK-1对小鼠脂肪细胞向成骨细胞转分化的影响研究

[目的]研究特异性阻抑Wnt信号通路抑制因子DKK-1对脂肪细胞向成骨细胞的转分化的影响,以进一步探讨激素性股骨头坏死的发病机制及其防治。[方法]将小鼠前脂肪细胞3T3～L1诱导分化为脂肪细胞,将分化成功的脂肪细胞分为两组:对照组在DMEM(H)培养基培养,实验组在DMEM(H)+DKK-1抗体培养基培养。两组细胞培养3周后分别行油红O染色、ALP染色及茜素红钙结节染色;RT-PCR检测PPARγ-2、LPL、ALP、OCN及Runx-2基因mRNA的转录水平;Western-blot检测PPARγ-2、Runx-2的蛋白表达水平。[结果]与对照组相比,加入DKK-1抗体的实验组的细胞形态呈长梭形,胞浆内未见脂滴沉积,有成骨活性表达,有钙结节形成;RT-PCR结果显示实验组成骨因子Runx-2、ALP及OCN基因mRNA的表达显著高于对照组,而成脂因子PPARγ-2及LPL基因mRNA的表达显著低于对照组(P<0.05);Western-blot检测结果显示实验组PPARγ-2蛋白几乎无表达,而成骨转录分化因子Runx-2蛋白的表达则明显增强,与RT-PCR的结果一致。[结论]在一定条件下,DKK-1抗体可以促使脂肪细胞转分化为具有一定成骨活性的成骨细胞,这为防治激素性股骨头坏死提供了新的思路。     

人BMSCs自噬水平和成骨分化能力比较

目的比较老年骨质疏松(osteoporosis,OP)和健康成年人椎体中骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)自噬水平和成骨分化能力。方法取从2组手术患者椎体中培养的BMSCs细胞,Western blot检测自噬相关基因LC3和P62蛋白表达。转染含LC3-GFP质粒的腺病毒后,激光共聚焦下观察代表自噬体的绿色荧光斑点数。细胞经成骨诱导分化培养基刺激后,碱性磷酸酶染色比较早期成骨指标,茜素红染色比较晚期成骨指标钙盐沉积的影响。荧光定量PCR(q-PCR)检测骨形成相关基因I(collagen type I,COL I)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)以及Runt相关转录因子2(RUNX2)。结果 Western blot结果显示OP组BMSCs的LC3-II/I表达明显降低,而P62表达明显增高(P0.05);激光共聚焦观察进一步证实OP组中绿色荧光斑点数目显著下降,说明细胞内自噬体数目减少(P0.05)。两组BMSCs经成骨诱导后,茜素红和碱性磷酸酶染色发现OP组阳性程度明显弱于正常对照组,而q-PCR结果显示成骨分化的一些关键指标COL I、OCN、OPN和RUNX2在OP组中均显著下降,差异具有统计学意义(P0.05)。结论骨质疏松的BMSCs中自噬水平较正常细胞低,且成骨分化能力更弱。     

环指蛋白11调控Akt信号通路促进BMSCs成骨分化的机制研究北大核心CSCD

目的研究BMSCs成骨分化过程中环指蛋白11(ring finger protein 11,RNF11)对Akt信号通路的调节作用,为进一步阐明BMSCs成骨分化机制和用于临床治疗提供思路。方法从健康人体新鲜骨髓中分离培养BMSCs并传代,取第4代细胞经流式细胞术,成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定后用于实验。BMSCs成骨诱导分化培养0~14 d,通过茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,并用Western blot法检测RNF11蛋白表达。取第4代BMSCs,分为空白对照组(A组)、空载慢病毒(Lv-NC)组(B组)和敲低RNF11(Lv-ShRNF11)组(C组),成骨诱导分化培养0~14 d,采用Western blot检测RNF11蛋白表达,茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,14 d实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测BMSCs成骨标志物Runx2、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测Akt、Smad1/5/8及β-catenin信号通路蛋白相对表达量,以磷酸化前后比值表示。为研究RNF11对Akt信号通路的影响机制,取第4代BMSCs分为Lv-NC转染组(A1组)、Lv-ShRNF11转染组(B1组)和添加Akt信号通路激活剂SC79的Lv-ShRNF11转染组(C1组),14 d时采用Western blot检测RNF11和Akt信号通路蛋白相对表达量,茜素红染色、ALP染色及qRT-PCR检测成骨相关指标。结果流式细胞术及成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定显示分离培养细胞为BMSCs。RNF11蛋白相对表达量随成骨分化时间延长而逐渐增加(P<0.05);下调RNF11后,茜素红和ALP染色示C组相较于A、B组BMSCs成骨分化程度降低,qRT-PCR检测示Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量减少(P<0.05)。随成骨分化时间延长,RNF11与Akt信号通路蛋白相对表达量均上升(P<0.05)。下调RNF11后,C组相较于A、B组,其Akt信号通路蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),而对Smad1/5/8以及β-catenin信号通路蛋白相对表达量无明显影响(P>0.05)。B1、C1组相较于A1组,其RNF11蛋白相对表达量减少(P<0.05),B1组相较于A1、C1组,其Akt信号通路蛋白相对表达量降低(P<0.05);茜素红与ALP染色示C1组BMSCs成骨分化程度稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05);qRT-PCR检测示C1组Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05)。结论RNF11通过正向调控Akt信号通路激活水平促进BMSCs向成骨细胞分化。RNF11可作为提高BMSCs修复骨缺损疗效以及治疗骨代谢病的潜在靶点。     

STIM1调控Ras信号通路促进成骨细胞增殖的研究

目的成骨细胞增殖的抑制导致成骨细胞数量减少是骨质疏松症发生发展的重要原因。之前的研究发现介导受体依赖性钙离子内流的钙通道蛋白Orai1在调控成骨细胞增殖、分化、凋亡等细胞功能有非常重要的作用。STIM1是一类可激活Orai1的重要蛋白。然而,至今还未见STIM1是否参与调控成骨细胞增殖相关报道。本研究旨在明确STIM1是否参与调控成骨细胞增殖。方法应用靶向STIM1的siRNA在MC3T3-E1成骨细胞中沉默STIM1的表达,然后用MTT法检测细胞增殖变化、流式细胞仪检测细胞周期变化、Real-Time PCR检测CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK6的转录水平,并用Western Blot检测Ras信号通路活性。结果我们转染靶向STIM1的siRNA后,MC3T3-E1细胞中STIM1的表达和转录均明显降低(P0.05);接着,我们发现在MC3T3-E1细胞中沉默STIM1的表达后,MC3T3-E1细胞增殖抑制并且细胞周期阻滞在G0/G1期,并且调控细胞增殖的细胞周期蛋白CyclinD1的转录水平也显著下降(P0.05);进一步研究发现,在MC3T3-E1细胞沉默STIM1的表达后,明显抑制了钙离子依赖的Ras信号通路的活性(P0.05)。应用ARS-853抑制Ras信号通路的活性后,明显抑制了STIM1促进成骨细胞增殖的作用(P0.05)。结论 STIM1激活Ras信号通路发挥促进成骨细胞增殖的作用。     

小剂量阿司匹林对去势大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]检测不同浓度低剂量阿司匹林对去势后(OVX)大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响.[方法]建立SD大鼠去势模型,全骨髓贴壁法培养骨髓基质干细胞(BMSCs),传代4次后进行成骨诱导,建立对照组和不同浓度阿司匹林组(0.25、0.5、1、2及5mmol/L).于不同的培养时间点,倒置显微镜观察并进行MTT检测细胞增殖生长情况;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测培养细胞上清ALP活性;于诱导7d和21d时分别行细胞碱性磷酸酶染色和茜素红钙化结节染色.[结果]阿司匹林无明显促进BMSCs增殖作用,而大剂量阿司匹林(5 mmol/L)具有抑制BMSCs增殖作用.实验组(0.25、0.5、1、2 mmol/L阿司匹林组)细胞培养上清中ALP浓度较对照组显著增强(P＜0.05);碱性磷酸酶染色(1、2 mmol/L组)阳性表达增强;茜素红染色显示,实验组(0.5、1、2mmol/L组)钙结节数量、钙化面积均高于对照组(P＜0.05).[结论]阿司匹林不能直接促进去势大鼠BMSC增殖活性,但小剂量阿司匹林可显著提高体外培养BMSC成骨活性,增强钙盐沉积,促进钙结节形成.