新基因BC047440原核表达载体构建及其重组蛋白的表达纯化

目的 构建肝癌相关新基因BC047440原核表达载体,表达并纯化出其重组蛋白.方法 从HepG2细胞中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增BC047440cDNA,克隆进质粒pMD19-T,转化E.coliDH5α,测序正确后,酶切目的基因片段,插入质粒pET-28a(+),转化E.coliBL21,IPTG诱导蛋白表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化重组蛋白.结果 电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因BC047440长度一致.RT-PCR纯化产物与载体pMD19-T连接后,经蓝白斑筛选,挑出5个白色菌落做酶切鉴定,其中2个菌落被证实为阳性克隆.测定其基因序列,结果显示与Genbank公布的BC047440基因序列完全一致.将BC047440cDNA插入质粒pET-28a(+),转化E.coliBL21,培养过夜后,挑选7个白色菌落做酶切鉴定,证实均为阳性克隆.IPTG诱导其中一个克隆表达蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量23000左右出现新的蛋白表达条带,诱导4h后表达蛋白量最多,占菌体总蛋白的22.3%.将诱导3h的菌体超声破碎后,Ni柱亲和层析,50和125mmol/L咪唑洗脱液SDS-PAGE电泳显示出清晰的单一条带.结论 成功构建BC047440基因原核表达载体,表达并纯化出重组蛋白,为深入研究其临床应用打下基础.     

风疹病毒E1特异肽段的重组质粒载体构建

目的:构建风疹病毒(RV)E1特异肽段的重组质粒载体,以期表达RVE1特异肽段的重组蛋白。方法:抽提RV减毒活疫苗Wistar RA27/3株的基因组RNA后逆转录,用PCR方法扩增E1特异肽段的基因片段;扩增产物经纯化后克隆至pGEX-2T质粒载体,挑取重组质粒阳性克隆进行双酶切鉴定和测序。结果:成功克隆出330bp左右的目的片段,重组质粒经测序后与预期序列一致。结论:RVE1特异肽段的基因片段的成功克隆及重组质粒的构建为进一步表达相应重组蛋白奠定了基础。     

Cyr61蛋白表达载体的构建及表达

目的：体外表达并纯化Cyr61蛋白片段。方法：提取乳腺癌组织总RNA，用一步法RT—PCR选择扩增编码Cyr61蛋白的cDNA片段，并将之克隆到融合蛋白表达载体pQE80L中，转染大肠杆菌Rosetta—gami^TM2。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白，用亲和层析法纯化。纯化产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹分析鉴定。结果：克隆到编码Cyr61蛋白片段的cDNA片段，其大小为930bp。构建的表达质粒PQE80-Cyr61经限制性内切酶酶切和DNA测序证实为所需要的质粒。表达出相对分子质量分别为32kD的可溶性融合蛋白，经蛋白质印迹分析鉴定为Cyr61的融合蛋白。结论：本实验克隆了编码Cyr61蛋白片段的cDNA序列，并成功地获得了可溶性表达的融合目的蛋白，为进一步制备抗Cyr61蛋白的抗体和建立Cyr61蛋白定量检测方法创造了条件。     

Renalase基因的克隆及表达

目的：克隆与表达人Renalase基因。方法：提取总RNA,RT-PCR获得Renalase cDNA片段,克隆到表达载体pET42b（＋）中,转染大肠杆菌BL21,采用异丙基硫代半乳糖苷诱导,获取融合蛋白,亲和层析纯化后,将产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白质印迹分析。结果：克隆到大小为1 029 bp的Renalase cDNA片段,表达载体pET42b（＋）-Renalase经测序证实为所需质粒。获得的融合蛋白经鉴定证实为重组Renalase蛋白。结论：成功对Renalase基因进行克隆与表达,为进一步研究奠定了基础。     

DOC-1基因的原核表达载体构建及其重组蛋白的表达纯化

目的：克隆DOC-1基因、构建原核表达载体并纯化出其重组蛋白。方法：从人胎脑组织中提取总RNA，经逆转录一聚合酶链式反应（RT—PCR）扩增DOC-1的CDS序列，再通过基因重组技术将该基因片段依次克隆到pMO18-T和pGEX-4T-1载体中，构建融合表达载体pGEX-4T-1-DOC-1，经酶切、测序鉴定后，用该重组质粒转化E．coliBL21，用IPTG诱导表达，Glutathlone Sepharose 4B柱亲和层析纯化重组蛋白。结果：电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因DOC-1长度一致，测序结果与GenBank公布的DOC-1基因序列完全一致，IPTG诱导后经SDS—PAGE电泳分析表明，在相对分子质量38000左右出现新的蛋白表达条带，经亲和层析柱纯化后得到高纯度的GST-p12重组蛋白。结论：成功构建了pGEX-4T-1-DOC-1原核表达载体，表达并纯化出GST-p12重组蛋白，为进一步研究p12^DOC-1蛋白打下了实验基础。     

人Eppin基因的原核表达及抗原性鉴定

目的 构建人附睾蛋白酶抑制蛋白(epididymal protease inhibitor,eppin)基因原核表达质粒,表达并纯化重组蛋白,并探讨其抗原性及应用价值.方法 以健康人睾丸组织cDNA为模板进行PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pET-32a,并转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,并对纯化产物进行Western印迹鉴定.结果 重组质粒经双酶切分析和测序鉴定后证实构建成功;SDS-PAGE结果显示表达产物为相对分子质量36KD的融合蛋白,Western印迹检测纯化后蛋白显示特异性条带.结论 成功构建了pET-32a-Eppin重组质粒,并获得了具有抗原特异性的可溶性Eppin蛋白,为进一步研究其生物学活性及免疫性避孕效应奠定了基础.     

克隆与表达产甲酸草酸杆菌代谢基因Frc及临床意义

目的研究产甲酸草酸杆菌草酸代谢基因Frc转化大肠杆菌BL21后稳定表达代谢草酸相关性酶--甲酰辅酶A转移酶(FCoAT)对草酸的降解效能。方法成功培养产甲酸草酸杆菌后,采用PCR方法从产甲酸草酸基因组中获得Frc基因,克隆到pMDTM19-T载体上进行测序,得到正确的基因片段。经双酶切将目的基因片段插入到原核表达载体PGEX-4T-2上,测序正确后,转化大肠杆菌BL-21,IPTG诱导表达GST-FCoAT融合蛋白,表达产物行western-blot鉴定分析。结果重组克隆载体pMDTM19-Frc经测序鉴定序列正确。成功构建融合原核表达质粒PGEX-4T-2-Frc,大肠杆菌BL21成为载体,并稳定表达可溶性融合蛋白GST-FCoAT的同时获得代谢草酸潜能。结论克隆产甲酸草酸杆菌Frc基因,成功构建PGEX-4T-2-Frc载体,并转化大肠杆菌BL21,能稳定表达可溶性融合蛋白GST-FCoAT,具有代谢草酸潜能,为肠道细菌获得代谢草酸潜能,减少胃肠道内草酸的吸收,降低尿液中草酸含量和临床防治草酸结石的研究奠定理论基础。     

肾癌肿瘤相关抗原G250/MN/CAIX基因的克隆、表达及鉴定

目的 报道G250／MN／CA Ⅸ基因的克隆，蛋白表达及鉴定。方法 从肾癌组织中提取总RNA，采用RT—PCR法扩增G250／MN／CA Ⅸ全长cDNA，将获得的cDNA片段插入pET22b（＋）表达载体，转化BL-21大肠杆菌中，以IPTG诱导进行蛋白表达，SDS—PAGE凝胶电泳观察结果，实验验证。结果 克隆的G250／MN／CA Ⅸ基因经测序证实序列正确，构建重组质粒pET22b（＋）／G250并在原核系统中表达G250／MN／CA Ⅸ重组蛋白，该蛋白具有较好的抗原性和特异性。结论 成功完成G250基因克隆，为在G250蛋白纯化基础上进行抗体制备和G250功能研究提供了实验依据。     

Lck反义RNA重组腺病毒载体的构建及其对肾小管上皮细胞Lck表达的影响

目的:观察淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)在肾小管上皮细胞中的表达及Lck反义RNA对其表达的影响.方法:采用RT-PCR方法从肾小管上皮细胞中获得Lck目的基因片段,将目的基因片段反向插入pDC 316质粒中,构建Lck反义RNA穿梭质粒(pDC 316-antisenseLck),经PCR、酶切及测序鉴定正确后,将此穿梭质粒与辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre 共转染HEK 293细胞,重组产生Lck基因反义RNA腺病毒载体(Ad-antisenseLck).用此重组腺病毒感染体外培养的肾小管上皮细胞,Western blotting方法观测此重组腺病毒载体对IL-2诱导的Lck蛋白表达的影响.结果:构建出Lck反义RNA重组腺病毒载体,此重组腺病毒载体感染培养的肾小管上皮细胞后可明显抑制IL-2诱导的Lck蛋白表达(P<0.05),抑制率可达47%.结论:成功构建出Lck反义RNA重组腺病毒载体,此载体可在肾小管上皮细胞内发挥生物学作用,显著阻抑肾小管上皮细胞的Lck蛋白表达.     

人骨形成蛋白-7成熟肽在大肠杆菌中的高效表达

目的：利用大肠杆菌高效表达人骨形成蛋白-7（human bone morphogenetic protein-7，hBMP-7）成熟肽。方法：将编码hBMP-7成熟肽cDNA的基因片段克隆入受控于PRPL启动子的温控型大肠杆菌表达载体pDH，构建成的重组质粒pDHB-7m以大肠杆菌DH5a为宿主菌进行温度诱导表达。结果：含重组质粒的工程菌经42℃诱导表达后在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上显现出一条新蛋白区带，分子量约为16ku，表达量占菌体总蛋白的20％～25％，以包涵体形式存在，经简单纯化处理，得到纯度高于80％的人骨形成蛋白-7成熟肽。结论：hBMP-7成熟肽在大肠杆菌中得到高效表达，为深入研究其生物学活性和临床应用奠定了基础。     

人ODC重组蛋白及其多抗的制备和临床应用

目的:构建鸟氨酸脱羧酶(ODC)表达载体,表达ODC重组蛋白,制备其多克隆抗体并观察其在大肠癌诊断中的意义.方法:从大肠癌组织中提取总RNA,反转录PCR法扩增全长ODC cDNA,将扩增的基因插入表达载体pQE-30的BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点之间,DNA测序验证插入片段.将重组载体转化入宿主菌M15中进行诱导表达,产生含6-His-tag的融合蛋白.Western Blotting法检测表达蛋白.亲和层析法纯化融合蛋白,以该蛋白免疫小鼠制备多抗,免疫组化检测大肠癌组织中ODC的表达水平.结果:酶切鉴定和DNA测序显示ODC重组表达载体中含有人ODC eDNA全长序列,与NIH基因库的人ODCcDNA比较有99%的同源性.将该重组载体转化入大肠杆菌M15中表达所得蛋白经Western Blotting验证为目的蛋白.纯化融合蛋白,免疫小鼠获得多抗效价较高.免疫组化检测大肠癌组织中ODC的表达显示该抗体检测效果较好,大肠癌组织中ODC的表达水平明显高于正常组织(P＜o.05).结论:成功地构建了ODC表达载体、表达出ODC重组蛋白、制备出ODC多克隆抗体,为进一步研究结直肠癌的发病机理及其诊断和治疗方法打下了良好基础.     

人髓样细胞触发受体-1原核表达载体的构建和表达及多克隆抗体的制备

目的 构建人髓样细胞触发受体-1(TREM-1)原核表达载体使其表达并制备多克隆抗体。方法 采用特异性引物扩增人TREM-1胞外段cDNA,经酶切、连接、构建到原核表达载体pET28a(+),将构建的重组表达质粒转化入E.coli BL21( DE3)菌株,采用IPTG诱导表达、Ni-NTA 柱亲和层析纯化目的蛋白、SDS-PAGE分析蛋白纯度,将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定。结果 序列测定证实构建的重组表达载体pET28a(+)-TREM-1含有人TREM-1编码序列,其序列分析与Genbank中公布序列对比一致,质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为21.80 kDa的目的蛋白,SDS-PAGE分析表明纯化后的目的蛋白达到电泳纯,双向琼脂扩散法检测抗体效价为1:16,ELISA法检测抗体效价为1:25 600,Western blot分析显示抗体能特性结合人TREM-1重组蛋白。结论 成功构建高表达重组人TREM-1蛋白的原核表达载体及制备高效价兔抗人TREM-1多克隆抗体。     

人肿瘤MUC1/Y基因真核表达载体的构建及在BIU-87细胞中的表达

目的：克隆人肿瘤MUC1／Y全长基因及构建真核表达载体EGFP—MUC1／Y，并观察EGFP—MUC1／Y在BIU-87细胞中的表达，以进一步用于生物学功能及肿瘤生物学治疗的研究。方法：取新鲜膀胱肿瘤组织，提取总RNA，采用随机引物进行逆转录，将特异引物扩增的MUC1／Y全长PCR产物克隆至真核表达载体pEGFP-C1，测序鉴定后命名为EGFP-MUC1／Y，用脂质体转染膀胱肿瘤细胞BIU87，以Western Blot检测其表达情况。结果：酶切鉴定和序列分析证实构建质粒含人MUC1／Y全长cDNA编码序列，Western Blot检测和转染实验表明，构建的pEGFP-MUC1/Y基因在BIU-87真核细胞中表达，其绿色荧光蛋白瞬时表达率为20％。结论：人肿瘤MUC1／Y全长cDNA基因克隆及其真核表达载体pEGFP—MUC1／Y构建成功，可用于肿瘤生物学治疗的研究。     

重组蛋白Cox7a2原核表达及鉴定

目的:从原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞中克隆Cox7a2基因,构建pGEX4T-1-Cox7 a2载体,表达和鉴定重组蛋白。方法:应用RT-PCR方法从原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞中克隆Cox7 a2,利用BamH I和EcoR I酶切位点把Cox7a2克隆到pGEX4T-1载体,酶切和测序鉴定后,诱导重组蛋白的表达,进行纯化后,利用蛋白免疫印迹进行鉴定。结果:从原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞克隆到Cox7a2完整的编码序列,构建了pGEX4T-1-Cox7 a2载体,表达了预期相对分子质量的融合蛋白,并经免疫印迹检测鉴定。结论:成功克隆Cox7a2,表达纯化了其融合蛋白,为基因的功能研究奠定了前期基础。     

P-selectin糖蛋白配体-1的基因克隆及其Ig融合蛋白的表达和纯化

目的:克隆P-selectin糖蛋白配体-1的基因,表达和纯化其Ig融合蛋白。方法:RT-PCR法克隆出P-选择素糖蛋白配体-1(CD162)cDNA,构建真核表达载体,DEAD-Dextran法转染COS7细胞,上清经纯化后,分别使用WesternBlot和流式细胞仪鉴定CD162-hIgFc融合蛋白的性质和活性。结果:RT-PCR克隆出801bp的CD-162cDNA片段,插入载体构建出pIg-CD162,将其转染COS7细胞后获得CD162-hIgFc融合蛋白,分子量为74KD。WesternBlot证实其为CD162-hIgFc融合蛋白,流式细胞仪证明获得的CD162-hIgFc融合蛋白能够识别血小板表面的CD62P。结论:本研究成功制备了CD162-hIgFc融合蛋白,为进一步探讨P选择素与其配体CD162之间的作用打下坚实的基础。     

人FasL全长cDNA的克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆人FasL全长cDNA并构建其真核表达载体。方法：采用RT-PCR法从健康人外周血单核细胞中扩增包含全部阅读框架的FasI。全长cDNA，将之与pGEM-T：Easy质粒连接、测序。构建pcDNA3．1-FasL真核表达载体，用脂质体介导方法转染人直肠癌8348细胞，检测FasL表达情况。结果：RT-PCR扩增的FasL产物经限制性内切酶酶切后生成的片段符合预期大小。克隆测序证实所得的FasL cDNA序列与Gene Bank序列完全一致。pcDNA3．1-FasL重组质粒经：EcoRI XhoI双酶切后，电泳显示898bp目的片段和pcDNA3．1载体片段，证明重组质粒正确。转染直肠癌8348细胞后。用RT-PCR方法检测FasL表达阳性。结论：采用RT-PCR方法成功克隆了人FasL全长cDNA并构建了其真核表达载体．为进一步研究FasL功能奠定了基础。     

人精子表面蛋白P34H重组表达载体的构建及诱导表达

目的 :获得纯化的人精子表面蛋白P34H用于基础和临床研究。　方法 :在克隆到P34H基因编码区全长的基础上 ,将P34H基因亚克隆至原核表达载体pQE 30中 ,构建重组表达载体pQE 30 /P34H。将pQE 30 /P34H转化至大肠埃希菌后 ,用异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达 ,通过Ni NTA树脂进行亲和层析纯化上清中可溶性形式的重组蛋白P34H。对表达纯化重组蛋白的质粒进行DNA测序 ,并对重组蛋白P34H行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析 ,鉴定其是否为所需目的蛋白。　结果 :经PCR和双酶切鉴定 ,重组表达载体pQE 30 /P34H为正确克隆。SDS PAGE和DNA测序证实 ,所获的重组蛋白确系所需目的蛋白。　结论 :用上述原核表达的方法可获得纯化的人精子表面蛋白P34H。