JAK激酶抑制剂AG490联合5-氟尿嘧啶抑制结肠癌细胞STAT3信号转导通路的研究

目的 探讨STAT3信号转导通路在药物治疗结肠癌中的作用机制。方法 应用JAK激酶抑制剂AG490与5-氟尿嘧啶(5-Fu)处理结肠癌细胞HCTll6，Western blot检测JAK2／STAT3信号转导通路成员表达，MTT法检测细胞增殖状态，流式细胞技术检测细胞周期与凋亡。结果 AG490与5-Fu可以抑制结肠癌细胞增殖，促进结肠癌细胞凋亡，联合应用AG490与5-Fu可以起协同作用，结肠癌细胞STAT3信号转导通路成员表达与活性明显下降。结论．IAK激酶抑制剂AG490与5-Fu联合应用可能为治疗结肠癌提供了新的理论基础。     

JAK2激酶抑制剂AG490对结肠癌HT-29细胞侵袭性的影响

目的观察JAK2激酶抑制剂AG490对结肠癌HT-29细胞侵袭以及对基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达的影响，探讨STAT3信号转导通路在结肠癌侵袭转移调控中的作用。方法应用JAK2激酶抑制剂AG490处理结肠癌HT-29细胞，Matrigel肿瘤体外侵袭模型检测肿瘤细胞侵袭；Western blot检测STAT3蛋白表达；逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测MMP2mRNA表达。结果AG490可抑制JAK2／STAT3信号转导通路活化及结肠癌HT-29细胞侵袭，在此过程中AG490在mRNA水平抑制MMP-2表达。结论STAT3信号转导通路参与结肠癌细胞侵袭调控，阻断STAT3通路活化可抑制结肠癌细胞侵袭，这一作用可能是通过抑制MMP-2表达实现的。     

抑制信号转导和转录激活因子-3活化对恶性胶质瘤细胞LN229运动能力的影响

目的 观察抑制信号转导和转录激活因子-3( STAT3)的活化对调控人恶性胶质瘤LN229细胞运动能力的影响.方法 应用JAK/STAT3信号通路抑制剂AG490处理LN229细胞株,Westem blot检测STAT3、磷酸化STAT3( p-STAT3)的表达.噻唑蓝(MTr)比色法筛选能够阻断LN229细胞STAT3活化的最适AG490浓度;划痕实验和趋化实验检测AG490给药后,LN229细胞运动能力的变化;F-肌动蛋白( F-actin)实验检测AG490对LN229细胞肌动蛋白聚合能力的影响.结果 AG490可有效抑制LN229细胞STAT3的持续活化.50 μmol/L浓度的AG490在不影响LN229细胞存活时(t=1.862,P＞0.05),能够有效抑制STAT3的磷酸化,对照组和50μmol/L AG490处理组的p-STAT3/STAT3的密度比值分别为0.530±0.040和0.291±0.036(t =4.821,P＜0.01).伤口愈合实验可见50μmol/L AG490处理的LN229细胞非定向运动能力降低,24h时对照组运动的距离为(0.290±0.049) mm;实验组为(0.150±0.054) mm(P ＜0.05).体外趋化实验显示50 μmol/LAG490处理的LN229细胞定向运动能力降低(P＜0.01),表皮细胞生长因子(EGF)浓度为10 μg/L时对照组穿过膜的细胞数为93.92±9.52;实验组为24.52±3.04.50μmol/L浓度的AG490抑制LN229细胞肌动蛋白聚合能力(P＜0.05).结论 STAT3信号转导通路参与调控胶质母细胞瘤LN229的细胞运动过程,阻断STAT3的活化可以抑制恶性胶质瘤的运动能力.     

阻断信号传导和转录活化因子3对胶质瘤细胞侵袭性特征的影响

目的 观察用AG490阻断人胶质瘤细胞株中信号传导和转录活化因子3(STAT3)信号通路对肿瘤细胞侵袭性特征的影响.方法 体外培养的人胶质瘤U251、U87细胞株,应用AG490阻断STAT3信号通路;以Western blot检测STAT3和其激活状态p-STAT3蛋白在AG490作用前后的表达情况;通过Transwell细胞侵袭实验了解肿瘤细胞体外侵袭能力的变化;用明胶酶谱法检测肿瘤细胞基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9的表达;用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)了解血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达的变化.结果 AC490作用后胶质瘤细胞内p-STAT3表达下降,其程度随AG490浓度升高而增强,差异有统计学意义(P<0.01).而STAT3蛋白的表达不受AG490影响,与对照组比较差异无统计意义(P>0.05),说明AG490的作用机制是通过抑制STAT3蛋白的磷酸化激活过程从而阻断STAT3信号通路.AG490作用后,U251细胞的体外侵袭力下降,差异有统计学意义(P<0.01).STAT3信号通路阻断后,胶质瘤细胞MMP-2、MMP-9的表达下调,差异有统计学意义(P<0.01).VEGF mRNA表达也相应下降(P<0.05).结论 应用AG490阻断STAT3信号通路能够抑制胶质瘤细胞的体外侵袭能力,STAT3信号通路有可能成为控制胶质瘤侵袭性生长的有效靶点.     

JAK2-STAT3-波形蛋白信号通路对结肠癌细胞增殖迁移的影响

目的探讨JAK2-STAT3-波形蛋白信号通路在结肠癌细胞增殖迁移中的作用。方法应用JAK2抑制剂AG490处理人结肠癌Lovo细胞株。采用MTT法进行细胞增殖实验：采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力;用免疫荧光染色和Western blot检测Lovo细胞中波形蛋白和磷酸化STAT3（P—STAT3）的表达水平。结果AG490处理后,Lovo细胞增殖明显受到抑制．且呈剂量依赖性和时间依赖性（P〈0．05）。细胞划痕后24h,AG490处理组（实验组）的细胞划痕宽度恢复20％,而对照组划痕宽度恢复60％（P〈0．05）。实验组Lovo细胞中P—STAT3和波形蛋白蛋白表达明显降低（P〈0．05）。结论JAK2-STAT3-波形蛋白信号通路参与调控人结肠癌细胞的增殖和迁移。     

白细胞介素6促胆囊癌细胞增殖、侵袭与JAK/STAT3信号通路的关系

目的:探讨炎症因子白细胞介素6(IL-6)对胆囊癌细胞生物学行为的影响及其与JAK/STAT3信号通路的关系.方法:将胆囊癌细胞株GBC-SD用IL-6或IL-6+AG490(JAK/STAT3通路抑制剂)作用后,分别用MTT法检测增殖情况;Transwell法检测侵袭能力;明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶9(MMP-9)活性;Western blot法检测磷酸化STAT3(p-STAT3)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达.结果:IL-6(10,50,100 ng/mL)作用后,GBC-SD细胞增殖呈浓度依赖性增加(均P＜0.05),AG490能取消IL-6对细胞增殖的促进作用.IL-6作用GBC-SD细胞后,细胞侵袭能力及MMP-9的分泌明显增加(均P＜0.05),细胞p-STAT3和VEGF的表达明显上调,加入AG490后,以上作用均被取消.结论:IL-6能促进胆囊癌细胞的增殖通和侵袭,其作用可能与其活化JAK/STAT3信号通路,从而上调下游的MMP-9和VEGF的表达有关.     

红景天苷通过JAK2/STAT3通路抑制退变髓核细胞的炎症反应和凋亡

目的观察红景天苷对退变髓核细胞凋亡和炎症反应的影响,并探究其与JAK2/STAT3信号通路的关系。方法通过氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)培养建立退变髓核细胞模型,退变细胞分别予浓度为10μg/mL、30μg/mL和50μg/mL的红景天苷培养液。后续实验选择30μg/mL浓度进行,分为Control组、OGD组、红景天苷组、AG490(JAK2/STAT3信号通路抑制剂)组和红景天苷联合AG490干预组。RT-PCR法检测髓核细胞蛋白聚糖(Aggrecan)和Ⅱ型胶原(Col2a1)表达水平;Western blot检测红景天苷对髓核细胞p-JAK2和p-STAT3蛋白水平的影响;ELISA检测上清液中炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平,流式细胞术检测髓核细胞的凋亡。结果与Control组相比,OGD组Aggrecan和Col2a1 mRNA表达明显降低,炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高,p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平明显上调。与OGD组相比,红景天苷组显著抑制细胞凋亡以及炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6的释放,同时,我们发现,AG490组和红景天苷联合AG490干预组上述指标均明显降低,其中红景天苷联合AG490干预组各检测指标较AG490组略低。红景天苷联合AG490干预明显改善髓核细胞的凋亡和炎症反应,并抑制JAK2和STAT3的磷酸化水平。结论红景天苷可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路的活化而减轻退变髓核细胞炎症因子的产生和细胞凋亡。     

JAK/STAT通路在金属蛋白酶1组织抑制剂抑制肾小球系膜细胞凋亡中的作用

目的 探讨金属蛋白酶1组织抑制剂（TIMP-1）抑制大鼠肾小球系膜细胞（RMC）凋亡与Janus激酶/信号转导和转录激活子（JAK/STAT）通路的关系。 方法 用无血清培养基体外培养pcDNA3空载体、人正义、反义TIMP-1基因重组真核表达载体转染RMC。根据是否加JAK2特异性抑制剂AG490刺激24 h,将细胞分为未转染组、未转染＋AG490组、空载体组、空载体＋AG490组、正义组、正义＋AG490组、反义组和反义＋AG490组。另外设正常培养条件下的RMC作为正常对照组。应用流式细胞技术检测各组RMC的凋亡率。RT-PCR检测TIMP-1、bcl-xl、cyclin D1、p27kip1和JAK2 mRNA的表达。Western印迹检测胞质中JAK2、STAT3、STAT5及其相应磷酸化蛋白(p-JAK2、p-STAT3、p-STAT5)的表达。 结果 未转染组、正义组及反义组RMC凋亡率分别为（10.59±0.96）％、（7.08±0.43）％和（21.91±0.25）％，各组间差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。在未加AG490的各组RMC中,bcl-xl和cyclin D1 mRNA在正义组中表达最高，反义组中最低，p27kip1 mRNA在反义组中表达最高。加入AG490后，各组细胞的凋亡率均显著增加（P < 0.01）；TIMP-1、bcl-xl和cyclin D1 mRNA表达均减少；p27kip1 mRNA表达均增加。在未加AG490的各组细胞中，p-JAK2、p-STAT3和p-STAT5在正义组中表达最高，反义组中最低。加入AG490后上述蛋白表达均减少，且正义＋AG490组最高，反义＋AG490组最低。 结论 TIMP-1表达受JAK/STAT信号通路调控，后者可通过上调前者的表达抑制RMC凋亡；TIMP-1通过JAK/STAT信号通路抑制RMC凋亡。 bcl-xl、cyclin D1和p27kip1参与了上述过程。     

SOX2基因对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响研究

目的 探讨SOX2基因对人骨关节炎（OA）软骨细胞凋亡的影响及机制。方法 以正常软骨组织作为对照,通过Western blotting检测OA软骨组织SOX2蛋白表达。从人OA中分离软骨细胞,参照Lipofectamine TM2000说明将重组体pcDNA3.1-SOX2及空载体pcDNA3.1转染软骨细胞,并设置空白对照组。AG490作为JAK2/STAT3信号通路抑制剂,各组细胞处理48 h,通过流式细胞术、ROS试剂盒分别检测各组细胞凋亡率及ROS水平。Western blotting检测JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的蛋白相对表达量。结果 人OA软骨组织SOX2表达明显低于在正常软骨组织表达（0.065±0.009 vs 0.313±0.028, P<0.05）。转染pcDNA3.1-SOX2的OA软骨细胞SOX2表达明显高于空白组（0.556±0.048 vs 0.122±0.013, P<0.05）。pcDNA3.1-SOX2可明显降低OA软骨细胞凋亡率(3.11±0.42 vs 8.54±0.68)及ROS水平(23.46±2.15 vs 52.67±4.41),上调p-JAK2（0.142±0.013 vs 0.065±0.009）和p-STAT3表达（0.218±0.020 vs 0.126±0.015）（P<0.05）,AG490（15.23±1.13 vs 8.15±0.62）可诱导OA软骨细胞凋亡,而pcDNA3.1-SOX2可减弱AG490对OA软骨细胞凋亡促进作用（P<0.05）。结论 SOX2可抑制OA软骨细胞凋亡,其机制可能与激活JAK2/STAT3信号通路有关。     

JAK2信号通路介导人恶性黑素瘤A375细胞的自噬和凋亡机制研究

目的:探讨JAK2/STAT3信号通路介导人恶性黑素瘤A375细胞的自噬和凋亡活性,为黑素瘤的发生机制和潜在干预靶点提供理论依据。方法:人恶性黑素瘤A375细胞经复苏和传代后随机分为对照组和JAK2抑制剂干预组,比较两组细胞培养12h、24h、48h和72h的增殖率(采用MTT定量法)及凋亡率(采用流式细胞术),培养72h的细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、LC3B和p-STAT3蛋白相对表达量(采用Western blot法),检测IL-6和TNF-α水平(采用ELISA法),检测Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNA相对表达量[采用反转录PCR(RT-PCR)法]。结果:两组培养12h、24h、48h和72h的细胞增殖率比较,干预组各时间点均明显小于对照组,而凋亡率明显大于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。干预组培养72h的细胞p-JAK2和p-STAT3蛋白相对表达量、IL-6和TNF-α水平明显低于对照组,但LC3B蛋白、Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNA相对表达量均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:JAK2/STAT3信号通路异常激活可能是人黑素瘤A375细胞恶性增殖的重要通路之一,靶向干预JAK2/STAT3信号通路可以促进细胞自噬和凋亡活性上调,有望成为临床干预的重要靶点。     

过氧化物酶体增殖物激活受体α激动剂非诺贝特抑制高糖条件下的肾脏系膜细胞增殖

目的探讨非诺贝特（Fenofibrate）对高糖条件下大鼠肾脏系膜细胞（mesangial cells,MCs）HBZY-1增殖的影响及其作用机制。方法将对数生长期大鼠肾脏系膜细胞分成正常糖组（NG组）、高糖组（HG组）和非诺贝特组（FN组）。NG组细胞体系常规培养,HG组细胞体系加入40mmol／L葡萄糖,FN组细胞培养体系中加入40mmol／L葡萄糖和非诺贝特100μmol／L。各组细胞培养48h后,利用MTT方法检测细胞增殖;realtime-PCR（实时定量PCR）检测各组细胞PPAR-α、JAK2和STAT3基因表达;Westernblotting检测细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体Q激动剂（peroxisome proliferators activedreceptor-α,PPAR-α）、p-PPAR-a、JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3蛋白的变化。结果与NG组比较,HG组系膜细胞增殖率明显增高（P〈0．05）,JAK2与STAT3mRNA表达水平无统计学差异（P〉0．05）,PPAR-α、JAK2和STAT3蛋白无明显变化（P〉0．05）,但p-PPAR-α、p-JAK2、p-STAT3蛋白明显增加（P〈0．05）;与HG组比较,FN组系膜细胞增值率和JAK2、p-sTAT3蛋白表达均明显下降（P〈0．05）,PPAR-α、JAK2与STAT3mRNA和JAK2与STAT3mRNA表达均无统计学差异,但p-PPAR-α蛋白表达进一步增加（P〈0．05）。结论PPAR-α激动剂非诺贝特能抑制高糖导致的系膜细胞增殖,其作用可能是通过抑制JAK2／STAT3信号激活。     

Blockage of JAK/STAT signalling attenuates renal ischaemia-reperfusion injury in rat.

BACKGROUND: JAK/STAT signalling is one of the major pathways for cytokine signal transduction. However, the role of JAK/STAT in renal ischaemia/reperfusion (I/R) injury is not clear. The present study investigated the protection against renal I/R injury by in vivo inhibition of JAK2 activation. METHODS: Rats subjected to renal I/R were either treated with daily intraperitoneal injection of selective JAK2 inhibitor tyrphostin AG490 (10 mg/kg) or vehicle alone starting 4 h before, immediately after or until 3 h after I/R. Renal function, histology, infiltration of macrophages, apoptosis, expression of chemokines and adhesion molecules were assessed. RESULTS: AG490 treatment significantly inhibited the phosphorylation of JAK2 and its downstream molecule STAT1 and STAT3. Rats pretreated with AG490 exhibited improved renal function, attenuated histological lesions and reduced apoptosis of tubular epithelial cells. AG490 significantly inhibited renal expression of MCP-1 and ICAM-1 mRNA, as well as the expression of ICAM-1 protein, accompanied by decreased macrophage accumulation in the kidney. Immediate post-ischaemic treatment of AG490 also significantly ameliorated renal injury. However, delayed post-ischaemic treatment until 3 h after I/R failed to attenuate renal damage. CONCLUSIONS: This study demonstrated the involvement of JAK/STAT signalling in the pathogenesis of renal I/R injury, suggesting that JAK/STAT pathway may serve as a potential target for early intervention in ischaemic acute renal failure.