不同rag基因型牙龈卟啉单胞菌在慢性牙周炎患者中的分布

目的分析不同rag基因型牙龈卟啉单胞菌在慢性牙周炎患者中的分布状况。方法收集50例慢性牙周炎患者的150个龈下菌斑样本,采用16S rDNA 聚合酶链反应（PCR）法检测牙龈卟啉单胞菌在牙周炎病变位点的检出率,并根据各rag基因型的特异性引物检测牙龈卟啉单胞菌不同rag基因型在慢性牙周炎病变位点的分布。结果经16S rDNA PCR法检测,病变位点牙龈卟啉单胞菌阳性检出率为70.7%。各rag基因型在牙龈卟啉单胞菌阳性位点的总检出率：rag-1为60.4%,rag-2为23.6%,rag-3为44.3%,rag-4为15.1%;经统计学检验,rag-1和rag-3型检出率较高,高于rag-2和rag-4型（P<0.05）。结论慢性牙周炎患者龈下菌斑中的牙龈卟啉单胞菌存在rag基因多态性,rag-1和rag-3基因型牙龈卟啉单胞菌与中国辽宁地区人群慢性牙周炎的发生发展关系密切。     

牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白A参与诱导小鼠牙槽骨吸收

目的探讨牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白(Fim)A是否参与该菌引起牙槽骨吸收的作用。方法用牙龈卟啉单胞菌ATCC33277野生菌株感染BALB/c小鼠,建立其诱导的牙周病动物模型。用ATCC33277及其fimA基因敲出的牙龈卟啉单胞菌KDP150变异菌株分别感染实验动物BALB/c小鼠(每组5只小鼠),测量其牙槽骨的改变情况,且与未接种细菌的阴性对照组相比较,采用t检验进行统计学分析。结果 ATCC33277组小鼠牙槽骨吸收量高于阴性对照组(P0.05),而fimA基因敲除菌株KDP150与对照组相比较,牙槽骨吸收量差异无统计学意义(P0.05)。野生菌株组小鼠牙槽骨吸收量高于fimA基因敲除菌株组(P0.05)。结论牙龈卟啉单胞菌fimA可能是该菌引起牙槽骨吸收的重要毒力因子。     

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目的 探讨牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)W83、ATCC33277刺激人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)分泌基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)的变化.方法 本研究于2010年9月至2011年6月在中国医科大学口腔医学院中心实验室进行.将P.gingivalis W83、ATCC33277作用于HPDLFs0、6、12、24、48h后,运用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中MMP-1、TIMP-1质量浓度变化,并计算MMP-1/TIMP-1值.结果 P.gingivalis感染HPDLFs的MMP-1和TIMP-1表达均增强,并呈时间依赖性;且MMP-1/TIMP-1值明显高于未感染的对照组(P＜0.05).P.gingivalis W83感染后MMP-1/TIMP-1值明显高于P.gingivalis ATCC33277(P＜ 0.05).结论 P.gingivalis具有促进HPDLFs分泌MMP-1、TIMP-1的作用,且可造成牙周组织破坏;P.gingivalis W83降解细胞外基质的能力高于P.gingivalisATCC33277.     

牙龈卟啉单胞菌不同毒力株基因差异的比较研究

目的比较牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pgingivalis）高毒力株W83与低毒力株标准参考菌ATCC 33277之间的差异基因。方法采用抑制消减杂交技术（SHH）对比牙龈卟啉单胞菌高毒力株W83与低毒力株标准参考菌ATCC 33277的基因差异。以高毒力株W83为被检菌，低毒力株ATCC 33277为参考菌，将提取的基因组DNA用内切酶Rsa Ⅰ酶切，连接特殊设计的接头进行两次消减杂交和PCR扩增，得到消减混合物，与TA克隆载体连接，转化到JM109中，建立消减文库，经PCR筛选鉴定阳性克隆，进而对部分片段进行测序和同源分析。结果经SSH筛选鉴定得到36个片段大小为88～372bp的阳性克隆基因片段。结论从全基因角度研究牙龈卟啉单胞菌高毒力株W83与标准株ATCC 33277之间的分子遗传差异，为牙龈卟啉单胞菌致病基因的筛选及今后牙周病预防、诊治的靶标提供依据。     

两种基因型牙龈卟啉单胞菌对上皮细胞的影响

目的 比较2种fimA基因型牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)刺激下口腔上皮细胞白介素-6( Interlukin-6,IL-6)的表达.方法 以未受P.g刺激的上皮细胞作为对照组,实验组用P.g ATCC 33277(I型菌毛组)和W83、47A-1(Ⅳ型菌毛组)分别与口腔上...     

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目的探讨多重PCR技术用于检测牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)致病岛rag基因的可行性,并研究致病岛rag基因在毒力株和非毒力株中的分布情况。方法本研究于2011年1—6月在山东省口腔生物医学重点实验室进行,对P.gingivalis毒力株和非毒力株进行厌氧培养,采用普通PCR和多重PCR分别对他们的致病岛rag基因进行检测,对比检测结果,并对临床标本进行预实验研究。结果普通PCR和多重PCR均能对P.gingivalis致病岛rag基因进行检测,并且结果一致。多重PCR可用于临床标本的检测。致病岛rag基因不同基因型在毒力株和非毒力株中的分布不同,rag-1型存在于高毒力株P.gingivalisW83中,而rag-4型存在于低毒力株P.gingivalisATCC33277中。结论致病岛rag基因与细菌致病性密切相关;多重PCR技术省时省力、简单快速,为后续临床标本中rag基因的快速检测提供实验依据。     

不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌刺激中性粒细胞产生基质金属蛋白酶8和9的比较

目的比较不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）刺激下人外周血中性粒细胞（PMNs）产生基质金属蛋白酶8、9（MMP-8、MMP-9）的差异。方法采用密度梯度离心分离法分离纯化培养PMNs,P.gingivalis ATCC33277（ⅠfimA）、WCSP 115（ⅡfimA）、WCSP 1.5（ⅢfimA）、W83（ⅣfimA）、WCSP 559（ⅣfimA）菌悬液与新鲜分离的PMNs悬液共孵育2 h,于5 min、30 min、1 h、2 h收集上清液,用ELISA方法检测MMP-8、MMP-9的表达。结果不同fimA基因型P.gingivalis刺激PMNs产生MMP-8、MMP-9的能力都显著高于未受刺激组;ⅡfimA、ⅣfimA（W83）型P.gingivalis刺激PMNs分泌MMP-8在速度及量上均高于ⅢfimA、ⅣfimA（WCSP 559）型P.gingivalis;ⅠfimA、ⅡfimA、ⅣfimA（W83）型P.gingivalis刺激PMNs分泌MMP-9能力高于ⅢfimA、ⅣfimA（WCSP 559）型P.gingivalis。结论ⅡfimA、ⅣfimA型P.gingivalis的致病能力相对较强,提示P.gingivalis的毒力和致病性与fimA基因型存在相关性。     

牙龈卟啉单胞菌对人滋养层细胞增殖及凋亡的影响

目的:检测牙龈卟啉单胞菌感染对人胎盘滋养层细胞(HTR-8细胞)增殖以及凋亡的影响。方法:用不同感染复数(MOI)的牙龈卟啉单胞菌体标准菌ATCC 33277体外感染HTR-8细胞,未感染牙龈卟啉单胞菌的HTR-8细胞作为空白对照组。感染后,用Cell Counting Kit(cck-8)检测HTR-8细胞增殖情况,用线粒体膜电位凋亡检测试剂(JC-1)检测HTR-8细胞凋亡情况。结果:MOI=10组,感染72 h内,HTR-8细胞增殖未受抑制(P>0.05)。而MOI=100组和MOI=200组,感染24 h开始,HTR-8细胞增殖受到明显抑制(P<0.01)。并且与MOI=100组相比,MOI=200组在感染48 h(P<0.05)和72 h(P<0.01)时,HTR-8细胞增殖明显降低。牙龈卟啉单胞菌感染24 h,MOI=200组HTR-8细胞凋亡率显著高于空白对照组(P<0.01)。感染48 h,MOI=100组HTR-8细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.01)。MOI=10组在感染24 h和48 h时细胞凋亡率与空白对照组相比差异无统计学意义。结论:在体外感染模型中,牙龈卟啉单胞菌标准菌ATCC 33277感染可抑制滋养层细胞增殖,且促进其凋亡。提示早产低体重儿与牙龈卟啉单胞菌感染引起滋养层细胞增殖和凋亡失衡有关。     

牙龈卟啉单胞菌感染对大鼠血管平滑肌细胞细胞间黏附分子-1表达的影响

目的 观察牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277感染对大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达的影响。方法 建立体外牙龈卟啉单胞菌感染大鼠VSMC模型,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测ICAM-1基因的表达。结果 牙龈卟啉单胞菌感染VSMC 8、16、24 h后,ICAM-1表达明显增多,与空白对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。感染16 h达高峰,感染8 h与感染16、24 h比较,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 牙龈卟啉单胞菌感染可引起VSMC ICAM-1高表达,这提示牙周致病菌可能参与血管壁的炎症反应,在动脉粥样硬化的发生、发展中有重要的意义。     

P. gingivalis感染对血管内皮细胞VCAM-1表达的影响

目的:观察牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis)ATCC 33277和W83感染对血管内皮细胞血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)转录和翻译的影响.方法:建立体外P. gingivalis感染血管内皮细胞模型,反转录-聚合酶链式反应检测VCAM-1基因表达;蛋白质印迹技术检测VCAM-1膜蛋白表达变化.采用SAS 8.12软件包,多组均数之间的比较采用重复测量资料的方差分析.结果:P. gingivalis感染后4 h即诱导VCAM-1mRNA表达(与对照组比较,P<0.05),8 h达高峰,24 h有持续的高表达;P.gingivalis感染后4 h即诱导VCAM-1蛋白表达(P<0.05),8 h有持续的高表达,24 h表达到达高峰(P<0.05).P.gingivalis W83诱导VCAM-1表达的能力强于ATCC 33277(P<0.05).结论:P.gingivalis感染可引起血管内皮细胞VCAM-1高表达,提示P.gingivalis可能在动脉粥样硬化炎症病理反应中有重要的意义.     

牙龈卟啉单胞菌影响血管内皮细胞增殖和凋亡的实验研究

目的 观察牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivatis,Pg)对血管内皮细胞增殖和凋亡的影响,探讨Pg在动脉粥样硬化发病机制中的作用.方法 建立体外Pg侵入血管内皮细胞模型,甲基噻唑基四唑(MTT)法观察细胞增殖,碘化丙啶染色、流式细胞仪分析细胞周期,Annexin-V-FITC凋亡试剂盒检测细胞凋亡.结果 PgATCC33277侵入后72 h细胞增殖活性降低12.46%,Pg W83侵入后72 h细胞增殖活性降低10.47%(F=786.68,P<0.01);Pg W83侵入后24 h使G1期细胞增加(F=43.23,P<0.01),ATCC 33277侵入后48 h使G1期细胞增加(F=66.72,P<0.01);Pg侵入后24 h即诱导细胞凋亡(F=1074.56,P<0.01).结论 Pg可能通过细胞毒性及诱导凋亡作用,加重血管内皮细胞的局部炎性反应,在动脉粥样硬化炎性病理反应中有重要意义.     

不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌对牙龈成纤维细胞基质金属蛋白酶表达的影响

目的 观察不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人牙龈成纤维细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)表达水平的影响,探讨fimA基因型与Pg致病力之间的关系.方法 Pg ATCC 33277(Ⅰ型)、WCSP115(Ⅱ型)、WCSP1.5(Ⅲ型)、W83(Ⅳ型)分别与牙龈成纤维细胞在标准条件下共同孵育(对照组为达尔伯克氏改良伊格尔培养基),于孵育后1、3、6和12 h收集细胞和培养上清液,应用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和ELISA法分别检测牙龈成纤维细胞MMP-1、MMP-2的mRNA及蛋白的动态表达.结果 与对照组相比,Pg刺激下牙龈成纤维细胞MMP-1、MMP-2的mRNA和蛋白水平表达量均明显上调(P<0.01);其中Ⅱ型fimA型Pg的刺激作用强于其他各型,不同时间点MMP-1 mRNA相对表达量及蛋白分泌水平分别为(28.88±3.12)～(231.01±24.99)、(1.35±0.17)～(3.08±1.20);MMP-2 mRNA相对表达量及蛋白分泌水平分别为(20.42±2.21)～(188.34±37.37)、(2.57±0.76)～(18.08±1.15),与其他各型相比差异有统计学意义(P<0.05);Ⅲ型Pg的刺激作用较弱,不同时间点MMP-1 mRNA相对表达量及蛋白分泌水平分别为[(5.11±0.55)～(72.84±8.84)]μg/L、[(0.68±0.13)～(1.46±0.94)]μg/L;MMP-2 mRNA相对表达量及蛋白分泌水平分别为[(4.55±0.55)～(25.75±3.12)]μg/L、[(2.28±0.93)～(11.22±2.46)]μg/L,与其他各型相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 Pg可以诱导牙龈成纤维细胞过表达MMP,fimA基因型与Pg的毒力作用相关,fimA型可能为Pg致病力差异的基因基础.     

慢性牙周炎合并慢性阻塞性肺疾病患者牙龈卟啉单胞菌rag位点基因分析

目的:分析不同rag基因型牙龈卟啉单胞菌在慢性牙周炎合并慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者中的分布状况.方法:选择慢性牙周炎及合并COPD的慢性牙周炎患者各30例,收集唾液样本,采用16S rDNA聚合酶链反应(PCR)法检测牙龈卟啉单胞菌的检出...     

维甲酸对人舌鳞癌细胞株Tca83 Fas/FasL基因表达的影响

目的探讨不同浓度全反式维甲酸（all-transretinoidacid,简称RA）,在不同作用时间下对人舌鳞癌细胞株Tca83诱导凋亡过程中,相关凋亡基因Fas/FasL的表达及两者之间可能的关系。方法采用TUNEL法检测RA作用下细胞发生凋亡的情况;应用RT-PCR和细胞免疫组化方法检测药物作用组和对照组细胞Fas蛋白水平和mRNA水平的表达。结果TUNEL法显示生理药物浓度1-10uRA作用到第5d时可见明显的凋亡细胞出现,与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。相应的RT-PCR亦显示RA作用到5d时FasmRNA水平明显提高,而细胞的FasLmRNA水平却没有改变。细胞免疫组化结果也显示RA可增强Fas抗原的表达。结论RA能诱导Tca83的凋亡基因Fas的表达。提示临床上可利用RA作为先期诱导药或与增强Fas表达的药物、抗Fas抗体联合应用,以增强RA药效,降低不良反应。     

Correlation between cell-adherent activity and surface structure in Porphyromonas gingivalis

The cell-adherent ability of 6 strains of Porphyromonas gingivalis (381, ATCC 33277, SU63, KD1, W50 and W83) was compared by using radiolabeled bacterial cells and human gingival fibroblasts (Gin 1), human periodontal ligament fibroblasts (HPLF) and human epithelial cells (Ca9-22) that had been grown on collagen beads. The cell-adherent activity of these organisms varied among strains; P. gingivalis strains 381, ATCC 33277 and SU63 bound to the target cells at a range of 14% to 72%, but the other 3 strains (KD1, W50 and W83) were scarcely bound (0.6% to 3.5%). On the other hand, whole bacterial cells and culture supernatants of all strains showed distinct hemagglutinating activity. The 3 strains showing high cell-adherent activity were hydrophobic and the other strains showing less activity were relatively hydrophilic. Furthermore, a number of peritrichous fimbriae were found on the surface of P. gingivalis strains 381, ATCC 33277 and SU63, which showed high adherent activity, whereas, fimbriae on the other 3 strains showing low adherent ability were barely apparent. Therefore, it was assumed that the cell-adherent activity of P. gingivalis was related to the hydrophobicity of the cell surface, which was related to the number of fimbriae.     

Modulation of host matrix metalloproteinases by bacterial virulence factors relevant in human periodontal diseases

OBJECTIVE: Bacterial pathogens involved in periodontal diseases exert a part of their destructive effect by triggering and inducing host cells to elevate their secretion of matrix metalloproteinases (MMPs). Pathogen-secreted phospholipase (PLC) is one bacterial product that may trigger this host response. The roles of exogenous PLC leading to the release, secretion and expression of MMPs by peripheral blood neutrophils (PMNs), cultured epithelial cells of human gingiva and porcine periodontal ligament were investigated. Also the activities of PLC in the diseased and healthy gingival sulcular fluid (crevicular fluid, GCF) and molecular forms of gelatin-ases present in dental plaque were investigated. MATERIALS AND METHODS GCF, salivary and dental plaque samples were analyzed for PLC and proteinase activities. The abilities of PLC to induce PMNs and oral epithelial cells to release and express their MMPs were examined by specific functional, immunological and molecular biology means. RESULTS: PMN-derived MMPs were found to predominate in periodontitis GCF and plaque, and PLC activities were higher in GCF of adult periodontitis patients than in healthy controls. Purified bacterial PLC (1 mU ml^-I) efficiently induced PMN degranulation. PLC also induced MMP expression in the cultured epithelial cells. The strongest response was seen in MMP-9 and less in MMP-2. The induction was dose-dependent in the range of 0.I-1.0 U ml^-1 PI-PLC, and quiescent cultures were more responsive than proliferating ones. PLC induction of MMPs was polar, with increased levels of MMP-9 in the apical region and increased MMP-2 levels secreted in the basal direction. Northern analysis showed a strong increase in mRNA levels of MMP-9 and a smaller increase for MMP-2 and MMP-I. In the second part of the study we investigated the molecular forms of the released MMPs during periodontitis. In bacterial plaque of periodontitis patients the MMP-9 were found to be converted into lower molecular weight forms. Isolated proteinase from Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277) was able to convert human proMMPs to their active forms. CONCLUSION: Bacterial PLC may induce degranulation of PMN MMPs and increase MMP expression in oral epithelial cells. The released proteases can be converted into active form by the proteases of plaque bacteria. Thereby, the pathogenic oral bacteria may indirectly participate in the destruction of periodontal tissues.     

基质金属蛋白酶-9、黏着斑激酶的表达与舌鳞状细胞癌淋巴结转移的关系研究

目的探讨基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)和黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的表达与舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)淋巴结转移的关系。方法运用免疫组化链霉卵白素-过氧化酶法检测TSCC18例淋巴结转移组和57例无淋巴结转移组原发灶中MMP-9和FAK的表达。结果MMP-9和FAK在TSCC淋巴结转移组中的阳性表达率分别为83.3%(15/18)和72.2%(13/18),而在无淋巴结转移组中的阳性表达率分别为42.1%(24/57)和35.1%(20/57)。MMP-9和FAK在淋巴结转移组中的阳性表达率显著高于无淋巴结转移组(P<0.005、P<0.01),MMP-9的阳性表达与FAK的阳性表达之间呈正相关(P<0.005)。结论MMP-9和FAK的高表达提示TSCC淋巴结转移的高风险性,MMP-9和FAK可作为评估TSCC淋巴结转移与否的有用指标。