葛根素对大鼠下颌骨骨髓源巨噬细胞破骨细胞向分化的影响

目的: 分析不同浓度的葛根素对于下颌骨骨髓源巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages,BMMs）破骨分化的影响。方法: 体外分离培养4周龄雌性大鼠下颌骨BMMs。通过CCK-8分析1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L葛根素对BMMs细胞活性的影响。使用RANKL诱导BMMs破骨分化的同时加入不同浓度葛根素,采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）酶化学染色及q-PCR分析破骨细胞形成及破骨相关基因的改变。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L葛根素组与对照组活细胞数无显著差异,100 μmol/L组活细胞数较对照组降低（P<0.05）。RANKL可诱导BMMs形成多核破骨细胞。10 nmol/L、100 nmol/L及1 μmol/L葛根素组破骨细胞数目及破骨细胞面积均较对照组降低（P<0.05）。q-PCR分析发现,10 nmol/L、100 nmol/L及1 μmol/L葛根素组NFATc1、C-fos、TRAP及CTSK mRNA表达量均较对照组下降（P<0.05）。结论: 葛根素可抑制下颌骨BMMs破骨分化及相关基因表达,为葛根素应用于下颌骨骨质疏松症的预防与治疗提供了依据。     

牡荆素对脂多糖诱导牙髓干细胞表达炎症因子的影响

目的：探讨牡荆素（vitexin,VTX）对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的人牙髓干细胞（human dental stem pulp cells,hDPSCs）表达炎症因子的影响,并初步探讨其相关作用机制。方法：分离、培养hDPSCs,以CCK-8法检测VTX对hDPSCs增殖的影响,检测VTX毒性浓度范围。铺种hDPSCs,分为4组,空白组以不含LPS和VTX的无血清DMEM,LPS组仅加入含LPS终浓度为2 μg/mL的无血清DMEM培养,VTX处理组1(V1组)加入2 μg/mL LPS+25 μmol/L VTX,VTX处理组2(V2组)加入2 μg/mL LPS + 50 μmol/L VTX。培养48 h,实时荧光定量PCR检测各组细胞中IL-1β、IL-6及IL-8基因转录,蛋白质免疫印迹检测hDPSCs内MPAK信号通路及COX-2等蛋白的变化。采用SPSS 16.0软件包对数据进行统计学分析。结果：VTX在200 μmol/L范围内时细胞活力不受影响(P>0.05);VTX抑制LPS刺激hDPSCs转录IL-1β、IL-6及IL-8,抑制效果与VTX的浓度呈正相关;VTX可显著抑制LPS激活p38及ERK信号通路。结论：VTX可能通过抑制p38及ERK信号通路的激活,降低LPS诱导的hDPSCs转录IL-1β、IL-6及IL-8。     

低强度脉冲式超声波在脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞分化中的抗炎和抗氧化作用

目的研究低强度脉冲式超声波（LIPUS）对RAW264.7巨噬细胞极化的影响及相关分子机制。 方法100 ng/mL脂多糖（LPS）和10 ng/mL白细胞介素（IL）-4诱导巨噬细胞RAW264.7分别向M1和M2型极化，45 mW/cm²强度LIPUS对巨噬细胞处理25 min。采用流式细胞术检测巨噬细胞氧化应激活性氧（ROS）水平、M1分化标志物CD80和CD11b，以及M2分化标志物CD163的表达水平。采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测CD80、CD11b、核转录因子κB（NF-κB）p65、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β和IL-6的mRNA水平。采用Western blot技术检测细胞p65、p-p65、TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平。采用流式细胞术检测细胞培养上清TNF和IL-6表达水平。 结果LIPUS可明显减少LPS诱导的RAW264.7细胞ROS水平。LPS诱导后，RAW264.7细胞M1分化标志物CD80和CD11b表达和转录水平均上调；LIPUS可抑制LPS对RAW264.7细胞向M1的诱导，差异具有统计学意义。并且，LIPUS可促进IL-4诱导的巨噬细胞M2分化标志物CD163表达。LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平上调，LIPUS可下调这些炎症因子的mRNA水平，差异均具有统计学意义。LIPUS抑制了LPS对RAW264.7细胞因子蛋白p65和p-p65、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表达上调的作用。胰酶可以通过激活ROS-NF-κB通路，回复LIPUS促进巨噬细胞M1分化的作用。 结论LIPUS可通过ROS-NF-κB抑制RAW264.7向巨噬细胞M1型分化，促进RAW264.7向巨噬细胞M2型分化。氧化应激和炎症因子表达水平被抑制。LIPUS可能在牙周疾病中起到抑制氧化和炎症的作用，从而发挥对牙周疾病的治疗功能。     

DHA对牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导巨噬细胞炎症的抑制作用

目的 探讨二十二碳六烯酸（DHA）对牙龈卟啉单胞菌（P.g）脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞炎症的抑制作用。方法 用CCK-8方法检测DHA对P.g-LPS诱导的小鼠单核／巨噬细胞系RAW264.7细胞的毒性。将P.g-LPS与RAW264.7细胞共培养24 h后,更换含有DHA的培养基培养24 h,实时荧光逆转录定量PCR（qRT-PCR）检测RAW264.7细胞中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）mRNA的表达。酶联免疫吸附实验检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌。用DCFH-DA方法检测RAW264.7细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生。结果 1 mg/L的P.g LPS对巨噬细胞无毒性作用（P＞0.05）,浓度≥100 μmol/L的DHA对P.g-LPS诱导的RAW264.7细胞有明显毒性作用（P＜0.05）;P.g-LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达显著高于阴性对照组（P＜0.05）;25、50、75 μmol/L的DHA减少TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达和TNF-α、IL-6的合成（P＜0.05）;P.g-LPS组ROS产生增多,25、50、75 μmol/L的DHA减少ROS的产生（P＜0.05）,抑制程度呈浓度依赖性。结论 DHA能够有效抑制P.g-LPS诱发的巨噬细胞炎症反应。     

小分子鹰嘴豆芽素A对人牙髓干细胞成骨分化的影响

目的 探讨不同浓度鹰嘴豆芽素A（biochanin A,BCA）对人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）成骨分化的影响及相关分子机制。方法 通过组织块法分离培养原代人牙髓干细胞,流式细胞术鉴定其细胞表型。通过CCK-8法检测不同浓度BCA对hDPSCs增殖活性的影响,通过q-PCR、碱性磷酸酶染色、茜素红染色等分析0、1、5、10、20、30 μmol/L BCA对hDPSCs成骨分化的作用,通过蛋白免疫印迹研究BCA对hDPSCs成骨分化过程中MAPK信号通路的影响。采用SPSS 16.0软件包对数据进行统计学分析。结果 实验获取的hDPSCs经流式细胞术鉴定,符合间充质干细胞特征。CCK-8结果显示,25 μmol/L以下浓度的BCA对hDPSCs增殖无影响,30 μmol/L以上抑制hDPSCs增殖。q-PCR结果显示,10 μmol/L BCA显著提升hDPSCs成骨分化过程中标志基因ALP、COL-1、OPN、OCN的表达水平;碱性磷酸酶及茜素红染色显示,10 μmol/L BCA组比对照组及其他浓度组染色明显增强;蛋白免疫印迹实验显示,BCA激活P38/MAPK信号通路,但对ERK及JNK无明显激活作用。结论 组织块法可获取纯度较高的hDPSCs,BCA可能通过激活P38/MAPK信号通路,从而促进hDPSCs成骨向分化。     

大豆异黄酮对颌骨骨髓源巨噬细胞破骨细胞向分化的影响

目的 评价大豆异黄酮对大鼠下颌骨骨髓源巨噬细胞（mBMMs）破骨细胞向分化的影响。方法 采用CCK-8法检测mBMMs在100 μmol/L、10 μmol/L、1 μmol/L、100 nmol/L、10 nmol/L及1 nmol/L 大豆异黄酮作用下细胞活性的改变。通过RANKL刺激mBMMs破骨细胞向分化,利用TRAP染色等方法分析不同浓度大豆异黄酮作用下多核破骨细胞数目及破骨相关基因表达的改变。采用SPSS 16.0软件包对数据进行统计学分析。结果 1 μmol/L、100 nmol/L、 10 nmol/L及1 nmol/L大豆异黄酮组mBMMs细胞活性与对照组比较,无显著差异;而高浓度大豆异黄酮（100 μmol/L及10 μmol/L）可抑制mBMMs细胞活性（P<0.05）。mBMMs 在RANKL的诱导下形成破骨细胞,TRAP染色显示为酒红色多核巨细胞。与对照组相比,1 μmol/L及100 nmol/L大豆异黄酮组破骨细胞数目显著减少（P<0.05）。分析破骨相关基因表达,发现1 μmol/L及100 nmol/L大豆异黄酮均能降低NFATc1、Mmp9、Trap及Ctsk mRNA的表达水平（P<0.05）。结论 大豆异黄酮可抑制mBMMs破骨细胞向分化。     

Zeste基因增强子人类同源物2抑制剂GSK343调节巨噬细胞分化的作用

目的 研究Zeste基因增强子人类同源物2（EZH2）抑制剂GSK343调节巨噬细胞亚群的分化,探讨EZH2在牙周炎中潜在的治疗作用。方法 将巨噬细胞RAW264.7分为4组：空白组（A组）、对照组（B组）、内毒素（LPS）刺激组（C组）、LPS+GSK343组（D组）。细胞经培养及相应处理后,利用免疫印迹和酶联免疫吸附试验检测其表型生物学标志变化,包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、白细胞介素-10（IL-10）和精氨酸酶-1（Arg-1）。利用大肠杆菌吞噬试验检测巨噬细胞RAW264.7在不同条件下对大肠杆菌的吞噬作用。结果 LPS可以诱导RAW264.7产生M1表型生物标志（TNF-α和iNOS表达增加）,在加入EZH2抑制GSK343后,IL-10和Arg-1表达升高,提示EZH2抑制剂GSK343可以诱导RAW264.7细胞由M1型向M2型转化;RAW264.7细胞具有吞噬大肠杆菌的作用,加入LPS的条件下吞噬大肠杆菌作用加强,而EZH2抑制剂GSK343可以调节RAW264.7细胞对大肠杆菌的吞噬作用。结论 EZH2抑制剂GSK343可以调节巨噬细胞的分化,在牙周炎的治疗中可能具有潜在作用。     

二十碳五烯酸对人牙龈成纤维细胞生物学活性及炎症因子表达的影响

目的: 探讨二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid,EPA）对人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts,HGFs）生物学活性及炎症因子表达的影响。方法: 分别通过活-死细胞染色、免疫荧光染色、流式细胞术观察EPA对HGFs细胞活性、形态、细胞周期的影响,采用牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P. gingivalis）脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）或热灭活P. gingivalis刺激HGFs,分别通过实时定量PCR 和ELISA观察EPA对白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）、IL-8、IL-1β基因和蛋白表达的作用;进一步采用实时定量PCR 和Western免疫印迹法,观察EPA对血红素氧合酶1（heme oxygenase-1,HO-1）基因和蛋白表达的作用。采用SPSS 22.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 200 μmol/L EPA可抑制HGFs的细胞活性;100 μmol/L EPA不影响HGFs的细胞活性、形态,对细胞周期也无显著影响（P>0.05）。EPA浓度依赖性抑制P. gingivalis LPS及热灭活P. gingivalis诱导HGFs表达的IL-6 mRNA、蛋白以及IL-1β mRNA（P<0.05）;EPA可呈浓度依赖性诱导HGFs表达HO-1 mRNA（P<0.05）,并上调其蛋白表达。结论: EPA在不影响HGFs生物学活性的前提下,显著抑制细胞的炎症因子表达,可能与其对HO-1的诱导作用有关,提示EPA在牙周炎防治中具有潜在应用价值。     

脱蛋白牛骨基质对骨膜细胞影响巨噬细胞M1表型的调控

目的:探讨脱蛋白牛骨基质骨替代材料与炎症环境中骨膜细胞的条件培养液对巨噬细胞M1表型的影响。方法:取P3代小鼠颅骨骨膜细胞,10 ng/mL LPS刺激24 h,分别换成常规培养基和脱蛋白牛骨基质(Bio-Oss骨粉)浸提液培养24 h,取上清记为A液、B液。体外培养小鼠RAW264.7细胞,100 ng/mL LPS诱导成为M1型巨噬细胞,分别加入条件培养液A液(对照组)和B液(实验组)。培养24 h后CCK-8检测细胞增殖活性;qRT-PCR分析M1型表型基因诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)。免疫荧光检测iNOS的表达。结果:CCK-8结果显示,实验组M1巨噬细胞增殖活性提高。与对照组相比,实验组iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA表达均下调(P<0.05);免疫荧光结果显示,实验组的iNOS表达下调。结论:脱蛋白牛骨基质可抑制骨膜细胞间接作用下的巨噬细胞M1表型基因的表达。     

黄芩苷调控的IKKα对HOKs炎症反应的保护作用

目的: 观察黄芩苷对HOKs炎症反应中IKKα介导的MASPIN的调控作用,探讨黄芩苷对口腔黏膜炎症的分子调控机制。方法: 以脂多糖（LPS）刺激人口腔角质细胞（human oral keratinocytes, HOKs）,体外局部模拟口腔黏膜上皮细胞炎性环境。CCK-8法检测黄芩苷对HOKs的毒性作用;在LPS刺激的HOKs中预先加入不同浓度黄芩苷,应用ELISA法检测黄芩苷对LPS刺激的HOKs中IL-6和TNF-α分泌的调控作用;利用RT-PCR及Western免疫印迹检测黄芩苷对LPS刺激的HOKs中IKKα介导的MASPIN基因及蛋白表达水平的调控作用。采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 以10 μg/mLLPS刺激HOKs,可作为口腔黏膜上皮细胞炎症模型。黄芩苷（1~20 μg/mL）对HOKs无毒性作用;随着黄芩苷浓度的升高,MASPIN在LPS刺激的HOKs中的表达逐渐升高,而IKKα及炎性细胞因子TNF-α、IL-6的表达逐渐降低（P<0.05）。结论: 在LPS刺激的HOKs中,黄芩苷可降低炎性因子表达,下调IKKα,上调MASPIN。     

Effect of iRoot SP and mineral trioxide aggregate (MTA) on the viability and polarization of macrophages

ObjectiveThis study was performed to investigate the effect of iRoot SP and mineral trioxide aggregate (MTA) on the viability and polarization of macrophages.MethodsThe effect of iRoot SP and MTA on the viability of RAW 264.7 macrophages was tested using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay after 1 and 2 days of culture. The gene expression levels of interleukin 1β (IL-1β), tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin 10 (IL-10), interleukin 12p40 (IL-12p40) were measured by quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) after stimulation of the RAW 264.7 macrophages with iRoot SP and MTA. The expression levels of CD11c and CD206 in RAW 264.7 macrophages were examined by immunofluorescence and flow cytometry after stimulation with iRoot SP and MTA. The data were analyzed by one-way analysis of variance and the Tukey test.ResultsBoth iRoot SP and MTA were non-toxic to the RAW 264.7 macrophages. The use of iRoot SP and MTA increased the expression of IL-1β, TNF-α, IL-10, IL-12p40 on the first day of culture and could promote macrophage M1 and M2 polarization.ConclusionsMTA and iRoot SP have good biocompatibility with macrophages, and they induced both M1 and M2 polarization of the RAW 264.7 macrophages.     

高浓度唑来膦酸对人成骨细胞成骨分化及凋亡影响的实验研究

目的研究高浓度唑来膦酸对体外分离的健康人下颌骨成骨细胞的影响。方法体外分离培养来源于健康人下颌骨的成骨细胞,取P3代成骨细胞,用1 μmol/L、5 μmol/L唑来膦酸分别处理,不加药组为空白对照。以CCK8检测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞凋亡,ALP染色及定量分析检测细胞成骨分化,荧光定量PCR检测成骨相关基因ALP、OPN和Runx2的表达,Western免疫印迹检测OPN蛋白的表达。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果唑来膦酸处理后的成骨细胞增殖减慢,5 μmol/L处理组较1 μmol/L组增殖更慢。药物处理后的细胞凋亡较对照组增加,且随着药物浓度的增加,凋亡百分比显著上升。1 μmol/L及5 μmol/L唑来膦酸处理后的成骨细胞的成骨分化能力较对照组显著下降。荧光定量PCR结果提示,药物处理后的成骨相关基因ALP、OPN和Runx2的表达显著降低。Western免疫印迹检测结果显示药物处理组OPN蛋白表达量显著下降。结论高浓度唑来膦酸抑制来源于人下颌骨成骨细胞的增殖及成骨分化,促进其凋亡发生。     

α桐酸对舌鳞状细胞癌CAL-27细胞的体外抑制作用

目的: 探讨苦瓜籽油中的α桐酸(α-eleostearic acid,α-ESA)对舌鳞状细胞癌CAL-27细胞增殖、迁移、凋亡的影响。方法: 将0、70、80、90、100、110、120 μmol/L的α-ESA培养CAL-27细胞后,用CCK-8法和流式细胞术分别检测加药24、48、72 h后细胞增殖抑制率和加药48 h后细胞凋亡率。再分别以0、80、100 μmol/L的α-ESA培养CAL-27细胞不同时间后,用细胞划痕实验检测加药24 h后细胞的迁移能力,Hoechst 33258染色在荧光显微镜下观察加药48 h后凋亡细胞形态。采用SPSS 21.0软件包对实验数据进行统计学分析。结果: α-ESA对CAL-27细胞的增殖抑制作用呈明显时间和浓度依赖性(P<0.05)。作用24、48、72 h后,半数抑制浓度(IC₅₀)逐渐降低,分别为(123.48±1.00)、(80.22±0.03)和(69.27±80.34) μmol/L。流式细胞检测结果显示,细胞凋亡率随着α-ESA浓度的增加而大幅增高(P<0.05)。培养24 h后,加入80、100 μmol/L的α-ESA的细胞划痕愈合率分别为(40.08±2.19)%、(22.06±2.04)%,显著低于对照组(74.74±2.17)%(P<0.01)。荧光显微镜下观察到致密浓染或碎块状亮蓝色荧光的细胞凋亡现象。结论: α-ESA能够抑制CAL-27细胞的体外增殖及迁移能力,并可诱导细胞凋亡,从而产生一定的抗肿瘤生长作用。