Thermo-chemotherapy enhances the immunogenicity of oral squamous cell carcinoma cells by inducing the expression of damage-associated molecular patterns

目的 探讨热疗、化疗及热化疗联合能否诱导口腔鳞状细胞癌细胞表达损伤相关分子模式（DAMPs）增强口腔鳞状细胞癌细胞免疫原性。方法 采用CCK-8实验确定平阳霉素（PYM）工作浓度,选择温度39、42及45 ℃作用于口腔鳞状细胞癌CAL27、SCC-15和Tca8113细胞。膜联蛋白V（Annexin V）/碘化丙啶（PI）联合染色、流式细胞术以及酶联免疫吸附试验（ELISA）探究热疗、化疗及两者联合对3株口腔鳞状细胞癌细胞凋亡、钙网蛋白（CRT）膜表达以及高迁徙率族蛋白B1（HMGB1）分泌的影响。应用SPSS 20.0对数据进行统计学分析。结果 热疗及化疗均可诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡,并促进CRT的膜表达及HMGB1的胞外分泌;两者联合应用,细胞凋亡、CRT膜表达及HMGB1分泌均较单纯化疗组升高,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 热疗、化疗及热化疗联合均可在诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的同时,促使CRT在细胞膜表面表达,并促进HMGB1的分泌。热化疗联合应用在凋亡诱导以及诱导DAMPs表达方面效果优于单纯化疗。     

热疗联合Id-1基因沉默对舌鳞癌CAL-27细胞增殖及侵袭的影响

目的: 探讨热疗联合Id-1基因沉默对舌鳞癌细胞增殖及侵袭的影响及其机制。方法: 将培养的舌鳞癌细胞株CAL-27分为4组。①沉默Id-1组（Id-1-siRNA）—用siRNA基因转染法沉默舌鳞癌CAL-27细胞中Id-1的表达,RT-PCR法检测其Id-1的mRNA表达变化;②热疗组（HT）—细胞置于42.5℃恒温培养箱内40min;③联合组（HT+ Id-1-siRNA）—siRNA基因转染法沉默细胞内Id-1的表达后进行42.5℃、40 min的热疗处理;④空白对照组—常规培养细胞。通过CCK8和Transwell侵袭实验,分别检测CAL-27细胞的增殖能力和侵袭能力变化; Western免疫印迹法检测CAL-27细胞中PI3K、磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表达变化。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果: siRNA能成功沉默CAL-27细胞内Id-1的表达,沉默Id-1组与空白对照组相比,Id-1的mRNA表达水平下降81.6%。沉默Id-1和热疗均可抑制CAL-27细胞的增殖和侵袭能力,下调PI3K、p-Akt蛋白表达（P<0.05）,热疗联合沉默Id-1作用于CAL-27细胞后的结果更为显著（P<0.01）。结论: 热疗协同沉默Id-1可显著抑制人舌鳞癌细胞的增殖及侵袭能力,其作用是通过PI3K/Akt信号通路来实现。     

沉默Icmt基因对舌鳞癌CAL-27和SCC-4细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的 探讨异戊二烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶（isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase,Icmt）对舌鳞癌CAL-27和SCC-4细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响及其相关机制。方法 针对人Icmt基因序列设计并构建3条小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,采用脂质体载体瞬时转染Icmt-siRNA抑制舌鳞癌CAL-27和SCC-4细胞Icmt表达,将实验组分为Icmt-siRNA-1组、Icmt-siRNA-2组、Icmt-siRNA-3组;同时将脂质体转染NC-siRNA作为阴性对照组,只加转染试剂作为空白对照组。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质免疫印记法（Western blot）检测转染后各组细胞Icmt、K-Ras的mRNA和蛋白表达及K-Ras膜蛋白的表达;Western免疫印迹检测Cyclin D1、p21、Akt、p-Akt蛋白表达;细胞增殖活性检测试剂盒和流式细胞术检测细胞的增殖活性、周期变化和凋亡能力。应用GraphPad Prism 8.2.1 软件对实验数据进行统计学分析。结果 qRT-PCR和Western 免疫印迹检测结果显示,与对照组相比,实验组Icmt mRNA和蛋白表达显著下降（P<0.05）,K-Ras mRNA和蛋白表达无显著差异（P>0.05）,K-Ras膜蛋白表达显著下降（P<0.05）;周期相关蛋白Cyclin D1表达显著下调,p21表达显著上调（P<0.05）;Ras/PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白Akt表达无统计学差异（P>0.05）,但p-Akt表达显著下降（P<0.05）。细胞增殖活性检测结果表明,与对照组相比,实验组细胞增殖能力显著下降（P<0.05）;流式细胞术检测结果表明,实验组细胞凋亡水平较对照组显著增加,细胞周期被阻滞在G1/S期（P<0.05）。结论 体外沉默Icmt基因可有效抑制CAL-27和SCC-4细胞增殖且诱导凋亡,其作用可能是通过影响K-Ras膜蛋白靶向膜定位,负性调控细胞周期和下调Ras/PI3K/Akt/mTOR信号通路而实现。     

干扰素诱导蛋白10对舌鳞癌细胞增殖、凋亡的影响

目的: 探讨干扰素诱导蛋白10（IP-10）对舌鳞癌细胞CAL-27增殖、凋亡的影响以及与CXCR3A、CXCR3B基因表达的关系。方法: 将CAL-27 细胞分为 3 个实验组和 1 个对照组,3 个实验组分别采用10、20、40 ng/mL 的IP-10刺激,对照组不予刺激。刺激12、24、48、72 h时,利用CCK-8法检测 4 组细胞的增殖活性;24 h 时,利用流式细胞仪检测细胞凋亡。采用Q-PCR检测10 ng/mL IP-10作用下,CAL-27细胞在12、24、48、72 h时CXCR3A、CXCR3B mRNA的表达情况。采用SPSS16.0软件包对数据进行单因素方差分析。结果: 12 h和24 h 时,3种浓度的IP-10 均能促进 CAL-27 细胞增殖（P<0.05）;在 48 h 时,只有40 ng/mL的 IP-10 能够促进 CAL-27 细胞增殖（P<0.01）; 而在72 h时,3种浓度的 IP-10对 CAL-27 细胞的增殖均无促进作用（P>0.05）。24 h后,3个实验组与对照组相比,CAL-27细胞的增殖率降低。24 h 时,3种实验组细胞凋亡率分别为（3.377±0.575）%、（6.867±2.848）%和（5.317±2.794）%,与对照组相比具有显著差异（P<0.05）,但各实验组间无显著差异（P>0.05)。12、24、48、72 h时,CXCR3A mRNA的表达量分别为0.0130±0.0007、0.0274±0.0005 、0.0204±0.0011和0.0174±0.0006,组间差异显著（P<0.05）;CXCR3B mRNA的表达量分别为0.0124±0.0015、0.0209±0.0016、0.0297±0.0013和0.0386±0.0010,组间差异显著（P<0.05）。结论: IP-10既能促进舌鳞癌细胞CAL-27增殖又能够诱导其凋亡,随着作用时间的推移,细胞增殖率降低;CXCR3A mRNA的表达先升高后降低,而CXCR3B mRNA的表达逐渐升高。CXCR3A、CXCR3B可能参与调控IP-10诱导下的舌鳞癌细胞的增殖和凋亡。     

氯喹增强口腔癌CAL-27细胞对顺铂化疗敏感性的观察

目的利用氯喹（chloroquine,CQ）及顺铂（cisplatin,DDP）作用于CAL-27细胞,探讨自噬在口腔癌化疗中的作用及机制,为临床增强口腔癌化疗敏感性提供理论依据。方法应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法比较药物对CAL-27细胞的生长抑制作用,采用激光共聚焦显微镜观察自噬特异性蛋白LC3-Ⅱ的表达,AnnexinV/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡,流式细胞术观察细胞周期的分布。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果不同浓度氯喹及顺铂处理CAL-27细胞不同时间后,细胞生存率逐渐降低,呈浓度和时间依赖性。5 mg/L氯喹联合顺铂在IC₅₀浓度（5 mg/L）处理后,与单独顺铂处理相比,显著降低了CAL-27细胞的生存率（P<0.05）。氯喹或顺铂作用于CAL-27细胞48 h后,自噬在细胞中分布清晰,顺铂组（DDP组）细胞平均荧光强度高于对照组、氯喹处理组（CQ组）及氯喹与顺铂联合处理组（CQ+DDP组）（P<0.05）;氯喹组细胞平均荧光强度显著低于其他3组（P<0.05）。氯喹或顺铂作用于CAL-27细胞48 h后,与对照组相比,DDP组和CQ+DDP组细胞凋亡率显著提高（P<0.05）;与顺铂单独作用相比,CQ+DDP组细胞凋亡率显著提高（P<0.05）。氯喹和顺铂作用于CAL-27细胞48 h后,DDP组和CQ+DDP组G1期细胞明显增多,出现G1期阻滞,CQ+DDP组G1期细胞数显著高于DDP组（P<0.05）。结论抑制自噬能够提高CAL-27细胞对顺铂的化疗敏感性,CAL-27细胞本身的自噬是产生化疗耐药的重要机制。自噬抑制剂有望成为口腔癌化疗的增敏剂。     

核糖体蛋白L29在舌鳞状细胞癌中的表达及意义

目的 探讨核糖体蛋白L29(ribosomal protein L29,RPL29)在人舌鳞状细胞癌（简称鳞癌）中的表达及意义。方法 应用免疫组织化学SP法检测52例舌鳞癌患者癌组织和癌旁组织中RPL29蛋白的表达情况。利用RNA干扰技术,将RPL29-siRNA转染到舌鳞癌CAL-27细胞中,RT-PCR法检测RPL29 mRNA的表达,蛋白质印迹法检测RPL29蛋白的表达,Transwell小室检测细胞的侵袭能力。采用 SPSS 21.0 软件包对数据进行统计学处理。结果 RPL29在舌鳞癌组织中的表达显著高于癌旁组织,RPL29蛋白表达与肿瘤有、无淋巴结转移相关（P<0.05）,与患者性别、年龄、吸烟史、饮酒史、病理分级、T分期无显著相关性（P>0.05）。转染RPL29-siRNA后,舌鳞癌CAL-27细胞中RPL29表达水平下调, CAL-27细胞的侵袭能力显著下降。结论 RPL29在舌鳞癌组织中表达增高,其表达水平与患者有、无淋巴结转移之间差异显著。抑制舌鳞癌CAL-27细胞中RPL29的表达,可降低细胞体外侵袭能力。RPL29在舌鳞癌的侵袭和转移中可能发挥重要作用。     

双硫仑对口腔鳞癌细胞上皮-间充质转化的影响及机制探讨

目的 基于Smad4突变状态探讨双硫仑对口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)细胞上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT)的影响。方法 将2017年6月—2018年6月在安徽医科大学附属口腔医院进行肿瘤切除术的46例OSCC患者手术切除的癌组织和癌旁组织切片纳入研究,同时购置人舌鳞状细胞癌细胞系SCC-25和CAL-27。采用免疫组织化学染色观察组织中Smad4的表达情况,Western免疫印迹测定细胞中Smad4的表达情况,分析双硫仑对TGF-β1诱导的细胞EMT迁移、侵袭、形态学以及p38、JNK和ERK表达的影响。采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计分析。结果 癌组织中Smad4阳性表达率显著低于癌旁组织(P<0.05)。双硫仑浓度为5、10、20 μmol/L时,SCC-25和CAL-27细胞存活率与对照组相比无显著差异(P>0.05),双硫仑浓度≥30 μmol/L后,SCC-25和CAL-27细胞存活率显著小于对照组(P<0.05)。经TGF-β1处理后,SCC-25和CAL-27细胞形态由上皮样转变为间质样,上皮性钙黏附蛋白(E-cadherin)表达显著降低,波形蛋白(Vimentin)和神经性钙黏附蛋白(Snail)表达显著升高,迁移能力显著增强(P<0.05)。经双硫仑+TGF-β1处理后,随着双硫仑浓度上升,SCC-25和CAL-27细胞形态改变逐渐减小,E-cadherin蛋白表达逐渐升高,Vimentin和Snail蛋白表达逐渐降低,迁移能力逐渐减弱(P<0.05)。TGF-β1刺激后5 min后,SCC-25和CAL-27细胞中p-ERK水平逐渐上升,在15 min时达到最大值,随后逐渐降低(P<0.05)。经20 μmol/L双硫仑+TGF-β1处理后,SCC-25和CAL-27细胞中p-ERK水平随作用时间延长而逐渐下降(P<0.05)。结论 双硫仑可通过阻断MAPK信号通路中ERK磷酸化,达到抑制Smad4突变与Smad4非突变OSCC细胞EMT作用。     

β肾上腺素受体在舌癌CAL-27细胞系的表达及β受体阻滞剂对其增殖、迁移、侵袭的影响

目的: 研究舌癌CAL-27细胞系中β-AR的表达及β受体阻滞剂对其增殖、迁移、侵袭的影响。方法: 采用Pan CK抗体对培养的正常口腔上皮细胞进行鉴定;免疫组织化学法及qRT-PCR法检测β-AR在舌癌CAL-27细胞的表达;CCK-8法、细胞划痕实验、Transwell法分别检测普萘洛尔及美托洛尔对CAL-27细胞增殖、迁移、侵袭的影响。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果: β1-AR、β2-AR在CAL-27细胞的表达均显著高于正常口腔上皮细胞（P<0.05）;β2-AR在CAL-27细胞的mRNA水平表达低于正常口腔上皮细胞而β1-AR表达高于正常口腔上皮细胞;两种药物对CAL-27细胞增殖均有抑制作用,药物浓度>50 μmol/L时,普萘洛尔抑制增殖的作用更强（P<0.05）;2种药物浓度>2.5 μmol/L,对CAL-27细胞迁移均有抑制作用,普萘洛尔的抑制作用更强;药物浓度>1.0 μmol/L,2种药物对CAL-27细胞侵袭均有抑制作用（P<0.05）,普萘洛尔对CAL-27细胞迁移抑制作用更强。结论: 在舌癌CAL-27细胞中, β1-AR在mRNA水平的表达高于正常口腔上皮细胞而β2-AR的表达低于正常口腔上皮细胞;低浓度普萘洛尔及美托洛尔对CAL-27细胞的增殖无明显抑制作用,但能抑制CAL-27的迁移和侵袭。     

顺铂诱导舌鳞癌细胞发生上皮-间充质转化及获得肿瘤干细胞样特性的实验研究

目的: 建立舌鳞癌顺铂耐药株,观察其是否具有肿瘤干细胞样特性以及是否发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。方法: 使用顺铂梯度浓度递增法构建舌鳞癌顺铂耐药细胞株,通过MTS、流式细胞术和球囊培养对比舌癌顺铂耐药株和其亲本细胞株化疗耐药性及肿瘤干细胞特性的变化,通过qRT-PCR和Western 免疫印迹检测肿瘤干性因子SOX2、OCT4、BMI1和ABCG2的表达,以及舌癌顺铂耐药株和其亲本细胞株中EMT的指标E-cadherin和Vimentin的表达水平,通过Transwell侵袭迁移实验研究侵袭和迁移能力的变化。采用SPSS 17.0 软件包对数据进行统计学处理。结果: 成功构建了2株舌鳞癌顺铂耐药株CAL27-res和SCC9-res,2株细胞对顺铂具有更强的耐药性。与亲本的舌癌细胞CAL27和SCC9相比,CAL27-res和SCC9-res细胞呈现间充质表型, E-cadherin显著下调(P<0.001),Vimentin和N-cadherin显著上调(P<0.001),侵袭、迁移能力显著增强(P<0.001)。同时,CAL27-res和SCC9-res细胞球囊形成能力增强,肿瘤干性因子SOX2、OCT4、BMI1和ABCG2上调(P<0.001),CD44⁺/CD24^-细胞的比例增高(P<0.001)。结论: 顺铂诱导的舌鳞癌耐药细胞发生EMT且获得了肿瘤干细胞样特性。     

尼古丁对舌鳞状细胞癌Cal27细胞的生物学影响

目的 探讨吸烟对舌鳞癌患者Cal27细胞系的影响。方法 将舌鳞癌Cal27细胞传代培养,将对数生长期细胞分为空白对照组、尼古丁组及 7型烟碱乙酰胆碱受体（ 7nAChR）抑制组。空白对照组不作任何处理,尼古丁组用尼古丁连续处理细胞1周, 7nAChR抑制组给予尼古丁及 7nAChR抑制剂α-银环蛇毒素（ -BTX）处理细胞1周。采用电子显微镜观察空白对照组及尼古丁组细胞形态;采用CCK-8试剂盒检测空白对照组及尼古丁组细胞增殖力;细胞划痕实验检测空白对照组及尼古丁组细胞迁移能力;Transwell小室检测空白对照组及尼古丁组细胞侵袭能力;免疫印迹实验测定尼古丁组、空白对照组及 7nAChR抑制组细胞Wnt信号通路蛋白相对表达水平。采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析。结果 Cal27细胞形态为不规则多角形,体积较大,周围可见伪足伸展,在细胞培养基上呈铺路石样排列。空白对照组、尼古丁组及 7nAChR抑制组Cal27细胞形态无显著差异。孵育96 h后,尼古丁组细胞数显著大于空白对照组及 7nAChR抑制组（P<0.05）;相同时间内尼古丁组细胞划痕愈合程度显著大于空白对照组与 7nAChR抑制组（P<0.05）;相同时间内,尼古丁组穿过小室细胞数显著大于空白对照组及 7nAChR抑制组（P<0.05）;尼古丁组细胞β-catenin、c-Myc、p-GSK3β及Ror2等Wnt通路蛋白相对表达水平显著高于空白对照组及 7nAChR抑制组细胞（P<0.05）。结论 尼古丁可通过激活Wnt信号通路,提高舌鳞癌Cal27细胞增殖、迁移及侵袭能力。     

体外沉默异戊二烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶对人舌鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响

通过小干扰RNA（siRNA）干扰技术体外沉默异戊二烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶（Icmt）基因,探讨体外沉默Icmt对舌鳞状细胞癌（TSCC）细胞增殖和凋亡能力的影响。     

口腔癌诱导化疗中P27Kip1表达与细胞周期、凋亡关系的研究

目的研究口腔鳞癌诱导化疗中P27Kip1与细胞周期、凋亡之间的变化规律,探讨肿瘤细胞凋亡率、P27Kip1等作为癌细胞化疗敏感性指标的临床价值。方法40例N0期口腔鳞癌术前经皮下埋植泵进行诱导化疗,采用流式细胞术检测治疗前后P27Kip1蛋白表达、细胞周期和凋亡变化。按照统一制定的病例选择标准进行治疗前后对照实验。结果(1)诱导化疗治疗前后G0/G1期峰值、凋亡峰值AP、FIP27有显著性差异,治疗前后P27Kip1蛋白与瘤体细胞发生凋亡的变化密切相关。(2)不同疗效P27Kip1蛋白和细胞凋亡有不同表达,治疗有效者P27Kip1蛋白和凋亡率明显升高。结论P27Kip1蛋白表达与瘤体细胞凋亡有直接作用关系,p27Kip1是一种影响化疗药物作用的重要基因。     

α亚族趋化因子受体3在人舌鳞癌细胞株的表达及其配体干扰素诱导蛋白-10对CAL-27细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨α亚族趋化因子受体3(CXC-chemokine receptor 3,CXCR3)在不同人舌鳞癌细胞株的表达以及其配体干扰素诱导蛋白-10(interferon induced protein 10,IP-10)对人舌鳞癌细胞株CAL-27增殖和凋亡的影响。方法采用蛋白印迹法和免疫荧光染色对3种人舌鳞癌细胞株(CAL-27、UM-1、Tca-8113)IP-10的相应受体CXCR3的表达进行检测。CAL-27细胞被分为3个实验组和1个对照组,3个实验组根据IP-10的刺激浓度,分为10 ng/mL组、20 ng/mL组、40 ng/mL组,对照组不予刺激。12 h、24 h、48 h时检测4组细胞的增殖;24 h时用流式细胞仪检测细胞的凋亡。结果 CXCR3在3种人舌鳞癌细胞株均有表达,并且CXCR3在3株细胞的胞膜及胞质内均有染色。和对照组相比,12 h、24 h时,3种浓度的IP-10均能够促进CAL-27细胞增殖(P<0.05);在48 h时,只有40 ng/mL的IP-10能够促进CAL-27细胞增殖(P<0.05),10 ng/mL、20 ng/mL的IP-10对CAL-27细胞的增殖无促进作用(P>0.05)。在24 h时,对照组、10 ng/mL组、20 ng/mL组和40 ng/mL组的细胞凋亡率分别为(0.053 3±0.472 6)%、(3.236 7±0.940 0)%、(4.516 7±1.115 4)%和(3.363 3±0.571 2)%,3种浓度IP-10均能够促进CAL-27细胞的凋亡(P<0.05),但3个实验组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论CXCR3在3种人舌鳞癌细胞株的胞膜及胞质内均有表达;IP-10既能促进CAL-27细胞的增殖,又能促进其凋亡。随着时间的延长,IP-10的促增殖作用减弱,而这种减弱可能是由IP-10的促凋亡作用的逐步发挥所引起的。     

Apicidin对人舌鳞癌CAL-27细胞作用的初步研究

目的探讨Apicidin对体外培养人舌鳞癌CAL-27细胞影响及作用机制。方法体外培养人舌鳞癌CAL-27细胞,采用不同浓度的Apicidin作为实验组,并设立对照组,倒置显微镜观察细胞形态,CCK-8法检测细胞增殖、TUNEL、流式细胞仪检测Apicidin对CAL-27细胞凋亡作用。结果 Apicidin可显著抑制CAL-27细胞的生长(P<0.05),呈时间剂量依赖性。通过TUNEL法、流式细胞仪检测显示CAL-27细胞的凋亡,并且使CAL-27细胞停留在G2期。结论 Apicidin能显著抑制CAL-27的体外生长并能诱导细胞凋亡。     

平阳霉素抑制舌鳞癌细胞系的量效和时效关系及可能的抗癌机制

目的:探讨平阳霉素体外抑制口腔鳞癌细胞系的量效和时效关系及可能的抗癌机制。方法:用不同浓度的平阳霉素培养人舌鳞癌细胞系Tca8113不同时间,以MTT法和荧光显微镜观察细胞增殖抑制情况,流式细胞术分析细胞凋亡率。结果:MTT法和荧光观察显示:不同浓度平阳霉素组间细胞生长抑制率有显著差异(P<0.05),浓度越高,抗增殖效应越明显;随药物作用时间延长,肿瘤细胞生长受抑制递增(P<0.05)。流式细胞术显示:凋亡率随药物浓度增加而增加,但与作用时间长短无关。低浓度药物无法诱导细胞凋亡。结论:平阳霉素在体外能明显抑制人舌鳞癌细胞系Tca8113生长,并具有浓度和时间依赖性。其抗癌机制可能包括细胞毒作用和启动程序化死亡信号等。