α桐酸对舌鳞状细胞癌CAL-27细胞的体外抑制作用

目的: 探讨苦瓜籽油中的α桐酸(α-eleostearic acid,α-ESA)对舌鳞状细胞癌CAL-27细胞增殖、迁移、凋亡的影响。方法: 将0、70、80、90、100、110、120 μmol/L的α-ESA培养CAL-27细胞后,用CCK-8法和流式细胞术分别检测加药24、48、72 h后细胞增殖抑制率和加药48 h后细胞凋亡率。再分别以0、80、100 μmol/L的α-ESA培养CAL-27细胞不同时间后,用细胞划痕实验检测加药24 h后细胞的迁移能力,Hoechst 33258染色在荧光显微镜下观察加药48 h后凋亡细胞形态。采用SPSS 21.0软件包对实验数据进行统计学分析。结果: α-ESA对CAL-27细胞的增殖抑制作用呈明显时间和浓度依赖性(P<0.05)。作用24、48、72 h后,半数抑制浓度(IC₅₀)逐渐降低,分别为(123.48±1.00)、(80.22±0.03)和(69.27±80.34) μmol/L。流式细胞检测结果显示,细胞凋亡率随着α-ESA浓度的增加而大幅增高(P<0.05)。培养24 h后,加入80、100 μmol/L的α-ESA的细胞划痕愈合率分别为(40.08±2.19)%、(22.06±2.04)%,显著低于对照组(74.74±2.17)%(P<0.01)。荧光显微镜下观察到致密浓染或碎块状亮蓝色荧光的细胞凋亡现象。结论: α-ESA能够抑制CAL-27细胞的体外增殖及迁移能力,并可诱导细胞凋亡,从而产生一定的抗肿瘤生长作用。     

α亚族趋化因子受体3在人舌鳞癌细胞株的表达及其配体干扰素诱导蛋白-10对CAL-27细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨α亚族趋化因子受体3(CXC-chemokine receptor 3,CXCR3)在不同人舌鳞癌细胞株的表达以及其配体干扰素诱导蛋白-10(interferon induced protein 10,IP-10)对人舌鳞癌细胞株CAL-27增殖和凋亡的影响。方法采用蛋白印迹法和免疫荧光染色对3种人舌鳞癌细胞株(CAL-27、UM-1、Tca-8113)IP-10的相应受体CXCR3的表达进行检测。CAL-27细胞被分为3个实验组和1个对照组,3个实验组根据IP-10的刺激浓度,分为10 ng/mL组、20 ng/mL组、40 ng/mL组,对照组不予刺激。12 h、24 h、48 h时检测4组细胞的增殖;24 h时用流式细胞仪检测细胞的凋亡。结果 CXCR3在3种人舌鳞癌细胞株均有表达,并且CXCR3在3株细胞的胞膜及胞质内均有染色。和对照组相比,12 h、24 h时,3种浓度的IP-10均能够促进CAL-27细胞增殖(P<0.05);在48 h时,只有40 ng/mL的IP-10能够促进CAL-27细胞增殖(P<0.05),10 ng/mL、20 ng/mL的IP-10对CAL-27细胞的增殖无促进作用(P>0.05)。在24 h时,对照组、10 ng/mL组、20 ng/mL组和40 ng/mL组的细胞凋亡率分别为(0.053 3±0.472 6)%、(3.236 7±0.940 0)%、(4.516 7±1.115 4)%和(3.363 3±0.571 2)%,3种浓度IP-10均能够促进CAL-27细胞的凋亡(P<0.05),但3个实验组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论CXCR3在3种人舌鳞癌细胞株的胞膜及胞质内均有表达;IP-10既能促进CAL-27细胞的增殖,又能促进其凋亡。随着时间的延长,IP-10的促增殖作用减弱,而这种减弱可能是由IP-10的促凋亡作用的逐步发挥所引起的。     

β肾上腺素受体在舌癌CAL-27细胞系的表达及β受体阻滞剂对其增殖、迁移、侵袭的影响

目的: 研究舌癌CAL-27细胞系中β-AR的表达及β受体阻滞剂对其增殖、迁移、侵袭的影响。方法: 采用Pan CK抗体对培养的正常口腔上皮细胞进行鉴定;免疫组织化学法及qRT-PCR法检测β-AR在舌癌CAL-27细胞的表达;CCK-8法、细胞划痕实验、Transwell法分别检测普萘洛尔及美托洛尔对CAL-27细胞增殖、迁移、侵袭的影响。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果: β1-AR、β2-AR在CAL-27细胞的表达均显著高于正常口腔上皮细胞（P<0.05）;β2-AR在CAL-27细胞的mRNA水平表达低于正常口腔上皮细胞而β1-AR表达高于正常口腔上皮细胞;两种药物对CAL-27细胞增殖均有抑制作用,药物浓度>50 μmol/L时,普萘洛尔抑制增殖的作用更强（P<0.05）;2种药物浓度>2.5 μmol/L,对CAL-27细胞迁移均有抑制作用,普萘洛尔的抑制作用更强;药物浓度>1.0 μmol/L,2种药物对CAL-27细胞侵袭均有抑制作用（P<0.05）,普萘洛尔对CAL-27细胞迁移抑制作用更强。结论: 在舌癌CAL-27细胞中, β1-AR在mRNA水平的表达高于正常口腔上皮细胞而β2-AR的表达低于正常口腔上皮细胞;低浓度普萘洛尔及美托洛尔对CAL-27细胞的增殖无明显抑制作用,但能抑制CAL-27的迁移和侵袭。     

沉默Icmt基因对舌鳞癌CAL-27和SCC-4细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的 探讨异戊二烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶（isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase,Icmt）对舌鳞癌CAL-27和SCC-4细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响及其相关机制。方法 针对人Icmt基因序列设计并构建3条小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,采用脂质体载体瞬时转染Icmt-siRNA抑制舌鳞癌CAL-27和SCC-4细胞Icmt表达,将实验组分为Icmt-siRNA-1组、Icmt-siRNA-2组、Icmt-siRNA-3组;同时将脂质体转染NC-siRNA作为阴性对照组,只加转染试剂作为空白对照组。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质免疫印记法（Western blot）检测转染后各组细胞Icmt、K-Ras的mRNA和蛋白表达及K-Ras膜蛋白的表达;Western免疫印迹检测Cyclin D1、p21、Akt、p-Akt蛋白表达;细胞增殖活性检测试剂盒和流式细胞术检测细胞的增殖活性、周期变化和凋亡能力。应用GraphPad Prism 8.2.1 软件对实验数据进行统计学分析。结果 qRT-PCR和Western 免疫印迹检测结果显示,与对照组相比,实验组Icmt mRNA和蛋白表达显著下降（P<0.05）,K-Ras mRNA和蛋白表达无显著差异（P>0.05）,K-Ras膜蛋白表达显著下降（P<0.05）;周期相关蛋白Cyclin D1表达显著下调,p21表达显著上调（P<0.05）;Ras/PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白Akt表达无统计学差异（P>0.05）,但p-Akt表达显著下降（P<0.05）。细胞增殖活性检测结果表明,与对照组相比,实验组细胞增殖能力显著下降（P<0.05）;流式细胞术检测结果表明,实验组细胞凋亡水平较对照组显著增加,细胞周期被阻滞在G1/S期（P<0.05）。结论 体外沉默Icmt基因可有效抑制CAL-27和SCC-4细胞增殖且诱导凋亡,其作用可能是通过影响K-Ras膜蛋白靶向膜定位,负性调控细胞周期和下调Ras/PI3K/Akt/mTOR信号通路而实现。     

沙利霉素对舌鳞癌细胞体外增殖、侵袭和迁移能力的影响

目的:探讨沙利霉素对口腔舌鳞癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响,并初步分析其影响机制。方法:CCK8法检测沙利霉素和顺铂分别作用于CAL-27细胞和EA.hy926细胞后,对细胞增殖的影响;Transwell小室法检测沙利霉素对CAL-27细胞侵袭和迁移能力的作用;Western 免疫印迹检测沙利霉素对CAL-27细胞中E钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和β连环蛋白（β-catenin）表达的影响。采用SPSS20.0 软件包对数据进行统计学分析。结果:沙利霉素抑制CAL-27细胞的增殖,呈时间、剂量依赖性,且其增殖抑制作用强于顺铂（P<0.05）;经过沙利霉素(4 μmol/L）处理过的CAL-27细胞,其侵袭和迁移能力均显著低于空白对照组(P<0.05);沙利霉素上调CAL-27细胞中E-cadherin蛋白的表达水平,并且下调vimentin和β-catenin蛋白的表达水平。结论:沙利霉素能够明显抑制CAL-27细胞的增殖能力,显著减弱CAL-27细胞的侵袭和迁移能力,其机制可能与抑制癌细胞发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)有关。     

热疗联合Id-1基因沉默对舌鳞癌CAL-27细胞增殖及侵袭的影响

目的: 探讨热疗联合Id-1基因沉默对舌鳞癌细胞增殖及侵袭的影响及其机制。方法: 将培养的舌鳞癌细胞株CAL-27分为4组。①沉默Id-1组（Id-1-siRNA）—用siRNA基因转染法沉默舌鳞癌CAL-27细胞中Id-1的表达,RT-PCR法检测其Id-1的mRNA表达变化;②热疗组（HT）—细胞置于42.5℃恒温培养箱内40min;③联合组（HT+ Id-1-siRNA）—siRNA基因转染法沉默细胞内Id-1的表达后进行42.5℃、40 min的热疗处理;④空白对照组—常规培养细胞。通过CCK8和Transwell侵袭实验,分别检测CAL-27细胞的增殖能力和侵袭能力变化; Western免疫印迹法检测CAL-27细胞中PI3K、磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表达变化。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果: siRNA能成功沉默CAL-27细胞内Id-1的表达,沉默Id-1组与空白对照组相比,Id-1的mRNA表达水平下降81.6%。沉默Id-1和热疗均可抑制CAL-27细胞的增殖和侵袭能力,下调PI3K、p-Akt蛋白表达（P<0.05）,热疗联合沉默Id-1作用于CAL-27细胞后的结果更为显著（P<0.01）。结论: 热疗协同沉默Id-1可显著抑制人舌鳞癌细胞的增殖及侵袭能力,其作用是通过PI3K/Akt信号通路来实现。     

氯喹增强口腔癌CAL-27细胞对顺铂化疗敏感性的观察

目的利用氯喹（chloroquine,CQ）及顺铂（cisplatin,DDP）作用于CAL-27细胞,探讨自噬在口腔癌化疗中的作用及机制,为临床增强口腔癌化疗敏感性提供理论依据。方法应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法比较药物对CAL-27细胞的生长抑制作用,采用激光共聚焦显微镜观察自噬特异性蛋白LC3-Ⅱ的表达,AnnexinV/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡,流式细胞术观察细胞周期的分布。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果不同浓度氯喹及顺铂处理CAL-27细胞不同时间后,细胞生存率逐渐降低,呈浓度和时间依赖性。5 mg/L氯喹联合顺铂在IC₅₀浓度（5 mg/L）处理后,与单独顺铂处理相比,显著降低了CAL-27细胞的生存率（P<0.05）。氯喹或顺铂作用于CAL-27细胞48 h后,自噬在细胞中分布清晰,顺铂组（DDP组）细胞平均荧光强度高于对照组、氯喹处理组（CQ组）及氯喹与顺铂联合处理组（CQ+DDP组）（P<0.05）;氯喹组细胞平均荧光强度显著低于其他3组（P<0.05）。氯喹或顺铂作用于CAL-27细胞48 h后,与对照组相比,DDP组和CQ+DDP组细胞凋亡率显著提高（P<0.05）;与顺铂单独作用相比,CQ+DDP组细胞凋亡率显著提高（P<0.05）。氯喹和顺铂作用于CAL-27细胞48 h后,DDP组和CQ+DDP组G1期细胞明显增多,出现G1期阻滞,CQ+DDP组G1期细胞数显著高于DDP组（P<0.05）。结论抑制自噬能够提高CAL-27细胞对顺铂的化疗敏感性,CAL-27细胞本身的自噬是产生化疗耐药的重要机制。自噬抑制剂有望成为口腔癌化疗的增敏剂。     

miR-138靶向PLD2基因对口腔癌细胞增殖、迁移的影响

目的：探讨miR-138靶向PLD2基因抑制口腔癌细胞增殖、迁移的机制。方法：口腔癌细胞转染miR-138后,采用RT-PCR检测细胞中miR-138的表达水平,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞转染miR-138后细胞周期的分布,Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力;采用Western 免疫印迹实验检测胃癌细胞MMP-9、PLD2及Cyclin D1的表达水平,采用荧光素酶报告实验分析miR-138与PLD2基因的靶向关系。采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果：口腔癌细胞转染miR-138后,miR-138相对表达水平为4.28±0.16,显著高于空白对照及miR-NC组（P<0.05）。荧光素酶报告基因实验发现,口腔癌细胞转染miR-138后,PLD2野生质粒荧光素酶相对活性低于其他组（P<0.05）,miR-138组的PLD2的mRNA表达水平低于空白对照及miR-NC 组（P<0.05）。口腔癌细胞转染miR-138后,miR-373组的口腔癌细胞的增殖能力低于空白对照及miR-NC组（P<0.05）。流式细胞术实验发现,miR-138组的G₀/G₁期比例为（64.39±6.49）%,显著高于空白对照组及miR-NC组（P<0.05）;miR-138组S期比例为（13.28±3.16）%,显著低于空白对照组及miR-NC组（P<0.05）;各组G₂/M期比例差异无统计学意义（P>0.05）。Transwell实验发现,口腔癌细胞转染miR-138后,迁移细胞数量为138.46±24.37,显著低于空白对照组及miR-NC组（P<0.05）。Western免疫印迹实验发现,miR-138组MMP-9的相对水平为0.14±0.04、Vimentin的相对水平为0.17±0.02、Cyclin D1的相对水平为0.15±0.03,均显著低于空白对照组及miR-NC组（P<0.05）。结论：miR-138可靶向调控PLD2基因表达,对口腔癌的增殖、迁移能力产生抑制作用。     

热疗对Cal27细胞Id-1、HSF1表达的影响

目的: 探讨热疗对人舌癌Cal27细胞中Id-1、HSF1基因表达水平的影响,以及对Cal27细胞增殖、迁徙的影响。 方法: 采用实时荧光定量PCR检测43℃、1 h热疗对Cal27细胞Id-1、HSF1基因表达的影响;CCK-8实验和划痕实验检测Cal27细胞增殖活性、迁徙能力的变化。应用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。 结果: 热疗后Id-1的mRNA表达水平降低,HSF1的mRNA表达水平升高;热疗后2 h,实验组Cal27细胞增殖活性显著降低（P<0.05）;热疗可以显著抑制Cal27细胞的迁徙能力（P<0.05）。 结论: 热疗可抑制Cal27细胞的增殖活性、迁徙能力,降低Id-1的表达,升高HSF1的表达。     

人胚胎干细胞源角质形成细胞用于药物毒理检测的探讨

目的 探讨人胚胎干细胞源角质形成细胞（keratinocytes derived from human embryonic stem cells, K-hESCs）用于药物细胞毒理检测反应的可行性,为建立新的生物安全性评价模型提供依据。方法 应用CCK-8法检测细胞活性和细胞毒性。观察维A酸（RA）、5氟尿嘧啶（5-FU）、地塞米松（DEX）和青霉素G（PG）对K-hESCs、人原代牙龈上皮细胞（human gingival epithelial cells, HGECs）和人永生化口腔上皮细胞系（human immortalized oral epithelial cells, HIOEC）的细胞毒性反应。采用SPSS 16.0软件包对数据进行统计学分析。结果 RA作用于HGECs、HIOEC和K-hESCs 3种角质形成细胞后,其药物半数抑制浓度（IC₅₀）分别为6.1±0.03、5.62±0.05和6.58±0.02;5-FU作用于3种细胞后,IC₅₀分别为1.65±0.02、3.00±0.02和1.72±0.04;DEX作用于3种细胞后,IC₅₀分别为113.67±0.014、328±0.002和126.17±0.05;PG作用于3种细胞后,IC₅₀分别为2200±1.34、3795±2.42和2880±1.5。4种药物对HIOEC和HGECs的IC₅₀有统计学差异（P<0.05）。对K-hESCs和HIOEC的IC₅₀差异也有统计学意义（P<0.05）,但对K-hESCs和HGECs的IC₅₀差异无统计学意义（P>0.05）。结论 在一般细胞毒性上, K-hESCs的药物半数抑制浓度比HIOEC更接近HGECs,可模拟人体正常细胞的反应。     

尼古丁对舌鳞状细胞癌Cal27细胞的生物学影响

目的 探讨吸烟对舌鳞癌患者Cal27细胞系的影响。方法 将舌鳞癌Cal27细胞传代培养,将对数生长期细胞分为空白对照组、尼古丁组及 7型烟碱乙酰胆碱受体（ 7nAChR）抑制组。空白对照组不作任何处理,尼古丁组用尼古丁连续处理细胞1周, 7nAChR抑制组给予尼古丁及 7nAChR抑制剂α-银环蛇毒素（ -BTX）处理细胞1周。采用电子显微镜观察空白对照组及尼古丁组细胞形态;采用CCK-8试剂盒检测空白对照组及尼古丁组细胞增殖力;细胞划痕实验检测空白对照组及尼古丁组细胞迁移能力;Transwell小室检测空白对照组及尼古丁组细胞侵袭能力;免疫印迹实验测定尼古丁组、空白对照组及 7nAChR抑制组细胞Wnt信号通路蛋白相对表达水平。采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析。结果 Cal27细胞形态为不规则多角形,体积较大,周围可见伪足伸展,在细胞培养基上呈铺路石样排列。空白对照组、尼古丁组及 7nAChR抑制组Cal27细胞形态无显著差异。孵育96 h后,尼古丁组细胞数显著大于空白对照组及 7nAChR抑制组（P<0.05）;相同时间内尼古丁组细胞划痕愈合程度显著大于空白对照组与 7nAChR抑制组（P<0.05）;相同时间内,尼古丁组穿过小室细胞数显著大于空白对照组及 7nAChR抑制组（P<0.05）;尼古丁组细胞β-catenin、c-Myc、p-GSK3β及Ror2等Wnt通路蛋白相对表达水平显著高于空白对照组及 7nAChR抑制组细胞（P<0.05）。结论 尼古丁可通过激活Wnt信号通路,提高舌鳞癌Cal27细胞增殖、迁移及侵袭能力。     

miR-181a抑制舌鳞癌细胞上皮-间充质转化及化疗耐药机制的研究

目的:探讨miR-181a调控上皮-间充质转化(EMT)促进舌鳞状细胞癌细胞顺铂耐药的机制。方法:分别在CAL27/CDDP、CAL27中转染miR-181a mimics、miR-181a LNA,免疫印迹及免疫荧光检测E-cadherin、Vimentin的表达;免疫印迹检测Twist1、Slug的表达;Transwell及划痕实验检测细胞的侵袭、迁移能力;MTT法检测细胞对顺铂的半抑制率。利用生物信息学方法:预测Twist1可能为miR-181a的靶基因。构建包含Twist1结合序列片段的荧光素酶报告基因质粒,进行双荧光素酶报告基因实验。采用SPSS17.0软件包对结果进行单因素方差分析。结果:转染miR-181a mimics可逆转CAL27/CDDP的EMT表型,E-cadherin表达增强,Vimentin、Twist1及Slug表达降低,细胞的侵袭、迁移能力显著降低,IC₅₀下降47.57%±6.23%（P<0.05）。转染miR-181a LNA可诱导CAL27细胞发生EMT,E-cadherin表达降低,Vimentin、Twist1及Slug表达增强,细胞侵袭、迁移能力显著增强,IC₅₀升高55.61%±7.20%（P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验证实,Twist1是miR-181a的靶基因。结论:miR-181a靶向调控Twist1,从而抑制舌鳞癌细胞上皮-间充质转化与顺铂耐药。     

Met激酶抑制剂BMS-777607对舌鳞癌细胞CAL27增殖、凋亡的影响

目的: 探讨Met激酶抑制剂BMS-777607对人舌鳞状细胞癌（鳞癌）CAL27细胞增殖、凋亡的影响。方法: 采用MTT、克隆形成实验及EdU细胞成像实验,检测BMS-777607对CAL27细胞增殖的影响。通过Heochst33342染色,观察BMS-777607对CAL27细胞的凋亡形态变化。采用JC-1染色,检测BMS-777607对CAL27细胞线粒体膜电位变化。采用Western免疫印迹检测BMS-777607对CAL27细胞中增殖蛋白Akt、p-Akt,凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved caspase-3、Bax、Parp表达的影响。采用SPSS 22.0软件包对数据进行统计学分析。结果: BMS-777607抑制CAL27细胞增殖,促进其凋亡,呈浓度依赖性（P<0.05）。BMS-777607抑制Bcl-2、p-Akt表达,促进Bax、Cleaved caspase-3、Parp蛋白表达（P<0.05）。结论: BMS-777607能够抑制CAL27细胞增殖并促进其凋亡。