骨髓间充质干细胞对大鼠BRONJ治疗的研究

目的 评估骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)对大鼠双膦酸盐相关颌骨坏死(bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw, BRONJ)的治疗效果。方法 SD大鼠每周给予尾静脉注射唑来膦酸(80 μg/kg),用药2周后,在全麻下拔除两侧上颌第一磨牙,之后继续用药至12周,构建大鼠BRONJ模型。取第3代大鼠外周骨BMSCs与骨粉支架在体外构建细胞支架复合体以备用。将BRONJ大鼠随机分为4组,在全麻下进行局部去骨清创,分别移植入细胞支架、支架,并设立清创组和对照组,最后缝合创口。移植术后4周和8周分批处死,分离并收集骨组织样本。Micro-CT和组织学分析各组骨缺损区新骨形成情况。ELISA法检测信号通路相关因子NF-kB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor -κB,RANKL)和骨保护素(osteoprotegerin,OPG)的表达。结果 Micro-CT和组织学染色显示,细胞支架组成骨修复效果最佳,支架降解快,新骨生成多,骨矿化密度最高(P<0.05)。支架组成骨修复效果居其次,支架降解较慢,类骨质和矿化骨基质生成较慢,骨矿化密度较低。清创组成骨修复效果最差,凹坑状骨缺损明显,骨面暴露,死骨形成,且缺损范围较清创术后呈现扩大趋势。对照组拔牙创黏膜未愈合或延迟愈合,未愈合的黏膜下方可见暴露坏死骨,结缔组织内有明显的炎症浸润,骨质出现不同程度的硬化,为典型的BRONJ表现。细胞因子检测显示,术后4周和8周,细胞支架组、支架组和清创组RANKL/OPG含量比值依次增高,细胞支架组和支架组较对照组下降(P<0.05),清创组较对照组明显增高(P<0.05)。结论 外周骨BMSCs对BRONJ具有一定的治疗效果,促进BRONJ大鼠清创后的骨缺损修复。RANKL/RANK/OPG信号通路可能在BRONJ病程发展中起重要作用。     

芹黄素对拔牙创早期骨愈合影响的实验研究

目的 芹黄素是一种广泛分布的植物类黄酮,本研究通过动物实验,探讨芹黄素对于拔牙创早期骨愈合的影响。方法 选取24只8周Wistar雄性大鼠,将其随机分为低剂量组、高剂量组、对照组3组,拔除右上颌第一磨牙,腹腔注射芹黄素溶液（10mg/kg、50mg/kg、0mg/kg）,每两天注射一次。在拔牙后28天处死全部大鼠,分离右上颌骨,进行Micro CT扫描及制作石蜡切片。切片行HE染色和OPG、RANKL免疫组织化学染色。采用Prism 7.0软件包对数据进行统计学分析。结果 HE染色及Micro CT扫描显示加药组拔牙创愈合程度优于对照组。芹黄素可以促进OPG的表达(P<0.05）,同时降低RANKL的表达（P<0.05）。结论 芹黄素对于大鼠拔牙创早期的骨愈合具有促进作用。     

唑来膦酸对大鼠颌骨间充质干细胞成骨分化的影响

目的:研究唑来膦酸对大鼠颌骨来源的间充质干细胞增殖、成骨分化及成骨因子RANKL/OPG m RNA表达的影响。方法:体外培养新生SD大鼠颌骨来源的间充质干细胞,观察不同浓度(0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μg/m L)唑来膦酸对细胞增殖的影响。观察较高浓度唑来膦酸对细胞碱性磷酸酶活性、矿化结节形成以及成骨因子RANKL/OPG m RNA表达的影响。结果 :唑来膦酸≥1.0μg/m L能明显抑制细胞增殖,低浓度(0.5μg/m L)则不影响细胞增殖,高浓度唑来膦酸(2.0μg/m L)可抑制碱性磷酸酶活性、矿化结节的形成。高浓度唑来膦酸(2.0μg/m L)能使颌骨间充质干细胞RANKL m RNA表达减少,OPG m RNA表达增加,且明显下调成骨因子RANKL/OPG比率。结论:唑来膦酸在高浓度时明显抑制颌骨来源间充质干细胞的增殖和分化,并通过调节其表面RANKL/OPG m RNA表达,抑制破骨细胞的功能,骨生成与骨吸收同时减少,骨改建过程受抑制。     

唑来膦酸剂量与颌骨坏死相关性的实验研究

目的 建立双膦酸盐相关性颌骨坏死的大鼠模型,分析双膦酸盐剂量与颌骨坏死发生之间的关系。方法 40只SD大鼠随机平均分为4组,腹腔注射剂量分别为33、66、132 μg/kg的唑来膦酸,对照组腹腔注射生理盐水,连续注射12周,每周3次,每周称重。第9周,拔除所有大鼠左侧下颌第一磨牙,第12周处死所有大鼠,取左侧下颌骨,进行影像学和组织病理学分析。采用SPSS19.0软件包对数据进行独立样本t检验。结果 实验组大鼠在拔牙后,体重显著低于对照组（P<0.05）,且X线片显示的拔牙创骨质密度也显著低于对照组（P<0.05）;实验组86.7%的大鼠拔牙创黏膜未完全愈合,而对照组所有大鼠拔牙创黏膜均完全愈合（P<0.05）。组织学检测发现,实验组70%的大鼠发生骨坏死,其中66、132 μg/kg骨坏死程度更为严重,而对照组组织学观察均未见骨坏死（P<0.05）。结论 BRONJ的发生和唑来膦酸的剂量有明显的相关性,低剂量唑来膦酸治疗只引起程度较轻的颌骨坏死,甚至不发生骨坏死,而高剂量唑来膦酸可引起严重骨坏死。     

唑来膦酸对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及 成骨分化的作用研究

目的 研究唑来膦酸对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖及成骨分化的作用。方法 取大鼠BMSCs体外原代培养,使用含不同浓度（1、5、10、20 μmol·L ^-1）唑来膦酸的成骨诱导培养基干预细胞作为实验组,不含唑来膦酸的培养基干预细胞作为对照组。CCK-8检测各组细胞增殖活性;茜素红和碱性磷酸酶染色检测各组细胞成骨分化能力;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测各组细胞碱性磷酸酶（ALP）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）、Ⅰ型胶原酶（COL-Ⅰ）、Runt相关转录因子2（Runx-2）、锌指结构转录因子（Osx）、骨钙蛋白（OCN）、骨桥蛋白（OPN）的mRNA表达量。结果 1 μmol·L ^-1唑来膦酸对BMSCs的增殖、成骨分化无影响,与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。浓度大于1 μmol·L ^-1唑来膦酸抑制BMSCs的增殖和成骨分化,且抑制作用呈浓度依赖性,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。当唑来膦酸浓度为5 μmol·L ^-1时,ALP、BMP-2、COL-Ⅰ等成骨相关基因的表达量高于对照组（P<0.05）,而当唑来膦酸浓度大于5 μmol·L ^-1时,成骨相关基因的表达量低于对照组（P<0.05）。结论 低浓度唑来膦酸对BMSCs增殖和成骨分化无影响,5 μmol·L ^-1唑来膦酸抑制BMSCs增殖但促进其成骨分化,高浓度唑来膦酸抑制BMSCs的增殖和成骨分化。     

唑来膦酸对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的作用研究

目的 研究唑来膦酸对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖及成骨分化的作用。方法 取大鼠BMSCs体外原代培养,使用含不同浓度（1、5、10、20 μmol·L ^-1）唑来膦酸的成骨诱导培养基干预细胞作为实验组,不含唑来膦酸的培养基干预细胞作为对照组。CCK-8检测各组细胞增殖活性;茜素红和碱性磷酸酶染色检测各组细胞成骨分化能力;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测各组细胞碱性磷酸酶（ALP）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）、Ⅰ型胶原酶（COL-Ⅰ）、Runt相关转录因子2（Runx-2）、锌指结构转录因子（Osx）、骨钙蛋白（OCN）、骨桥蛋白（OPN）的mRNA表达量。结果 1 μmol·L ^-1唑来膦酸对BMSCs的增殖、成骨分化无影响,与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。浓度大于1 μmol·L ^-1唑来膦酸抑制BMSCs的增殖和成骨分化,且抑制作用呈浓度依赖性,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。当唑来膦酸浓度为5 μmol·L ^-1时,ALP、BMP-2、COL-Ⅰ等成骨相关基因的表达量高于对照组（P<0.05）,而当唑来膦酸浓度大于5 μmol·L ^-1时,成骨相关基因的表达量低于对照组（P<0.05）。结论 低浓度唑来膦酸对BMSCs增殖和成骨分化无影响,5 μmol·L ^-1唑来膦酸抑制BMSCs增殖但促进其成骨分化,高浓度唑来膦酸抑制BMSCs的增殖和成骨分化。     

PRF复合组织工程骨修复牙周骨缺损中基因的表达及意义

目的探讨组织工程煅烧骨复合富血小板纤维蛋白(PRF)修复牙周骨缺损中BMP-2、骨保护素(OPG)和核因子B受体活化因子配体(RANKL)的表达及意义。方法将36只新西兰大白兔随机均分为4组,制备单侧牙周骨缺损模型,其中3组于骨缺损处分别植入煅烧骨、Bio-oss骨和煅烧骨/PRF复合物,以未植入任何材料者作为空白对照。术后4,8,12周处死动物,获取完整标本,进行大体、Masson染色及免疫组化观察。结果 Masson染色:煅烧骨/PRF组术后8周时即见部分鲜红色成熟骨形成,骨成熟速度明显优于其他3组。免疫组化观察:术后4周时煅烧骨/PRF组BMP-2、OPG、RANKL强阳性表达,数目高于其他3组,差异具有统计学意义(P<0.05)。RANKL阳性细胞的表达在骨改建过程中有不同程度的降低,煅烧骨/PRF组中组中RANKL下降最为明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论煅烧骨/PRF组修复牙周骨缺损会增加BMP-2、OPG、RANKL的表达,通过促进成骨细胞分化成熟而刺激OPG表达升高,抑制破骨细胞,有助于加快牙周骨改建,缩短骨愈合过程。     

双膦酸盐致颌骨坏死的大鼠模型研究

目的 :建立稳定的双膦酸盐相关颌骨坏死大鼠模型,并初步探索其发病机制。方法 :选取雌性SD大鼠20只,8周龄,随机分为实验组(15只),腹腔注射唑来膦酸溶液;对照组(5只),腹腔注射生理盐水。6周后分别拔除右侧上颌第一磨牙,术后12周取材,大体观察拔牙创愈合情况,将上颌骨行Micro CT和组织学检查。结果:实验组建立颌骨坏死模型12只,建模成功率为80%。实验组上切牙过度磨耗,牙冠短小,拔牙创处未见愈合,可见灰黄色死骨暴露;Micro CT显示拔牙创处牙槽骨缺损,组织学显示拔牙创周围死骨形成,骨陷窝呈空泡状,死骨周围骨组织内有较多淋巴细胞浸润,牙周膜纤维疏松紊乱,牙髓腔可见血管扩张。免疫组化示骨坏死区域VEGF表达明显降低。结论:本实验成功建立双膦酸盐颌骨坏死大鼠模型,初步探讨其发病机制可能与局部慢性炎症以及VEGF表达异常等相关。     

唑来膦酸对颌骨骨质的不良反应及相关性研究进展

实验表明唑来膦酸在BPs类药物中抑制骨吸收能力最强[1],这一效应使其对一些口腔疾病起到较好的疗效[2,3],例如：拔牙创的愈合、牙周病治疗后的牙槽骨吸收情况、种植义齿术后的骨整合情况等等。然而,近来有一些实验证实双磷酸盐（包括唑来膦酸）治疗可能会使颌骨坏死,并把这种现象称为双磷酸盐相关性颌骨坏死（BRONJ）,这些实验的结果都只是提出颌骨坏死可能与应用双磷酸盐（包括唑来膦酸）有关,并没有证实确实是由双磷酸盐所致,     

抗牙龈素粘附片段Hgp44卵黄抗体对实验性牙周炎的抑制作用

目的: 观察抗牙龈素粘附片段Hgp44卵黄抗体(抗Hgp44-IgY)对大鼠实验性牙周炎的抑制作用。方法: 24只雄性SD大鼠随机分为4组:空白组(A),生理盐水孵育组(B),抗Hgp44-IgY孵育组(C)和西吡氯铵孵育组(D)。采用细线结扎大鼠4颗第一磨牙,分别接种经处理的牙龈卟啉单胞菌,辅以蔗糖饮水。4周后检测大鼠牙龈指数(GI),龈下菌斑的BANA试验。处死大鼠后检测牙槽骨丧失量(ABL),牙龈的HE染色,利用qRT-PCR检测牙龈中IL-10、OPG和RANKL mRNA相对表达水平以及OPG/RANKL比率。结果: C组和D组与B组相比,GI、ABL以及BANA结果均显著降低(P<0.01),牙龈组织中IL-10和OPG的mRNA表达水平均显著增高(P<0.01),RANKL mRNA的表达水平显著下降(P<0.05),OPG/RANKL比率显著增高(P<0.001),C组与D组相比,GI、ABL、BANA、IL-10,OPG mRNA水平和OPG/RANKL比率无统计学意义,OPG mRNA 表达水平显著降低(P<0.05)。结论: 抗Hgp44-IgY能减少牙槽骨的吸收,减缓大鼠实验性牙周炎的发展进程。     

复方黄芩片对人牙周膜细胞及牙周炎牙槽骨OPG/RANKL表达的影响

目的:探讨复方黄芩片对人牙周膜细胞表面以及对实验性牙周炎大鼠牙槽骨OPG/RANKL表达的影响。方法:采用酶消化组织块法培养hPDLCs,通过ELISA法测定复方黄芩片对LPS诱导下hPDLCs表面OPG/RANKL表达的影响;LPS局部注射法建立大鼠牙周炎模型,免疫组化法测定复方黄芩片对牙周炎大鼠牙槽骨OPG/RANKL表达的影响。结果:0.2 mg/L复方黄芩片溶液对10 mg/L LPS诱导下的hPDLCs表面OPG表达无明显影响,而hPDLCs表面RANKL的表达显著降低(P<0.05),且实验组 hPDLCs表面OPG/RANKL的比值较空白对照组显著降低(P<0.05);复方黄芩片治疗3周后各组大鼠OPG/RANKL免疫组化染色阳性细胞计数结果显示牙周炎组大鼠牙周组织中RANKL的表达水平明显高于其他各组,治疗组OPG表达水平明显高于其他各组。结论:复方黄芩片可以上调牙周膜细胞表面OPG/RANKL的比值;按黄芩苷2.85 g/kg·d^-1的剂量给予牙周炎大鼠复方黄芩片灌胃治疗,复方黄芩片可以抑制牙周炎牙槽骨中RANKL的表达,促进OPG的表达。提示复方黄芩片有望用于牙周炎的临床治疗。     

骨质疏松SD大鼠药物相关性颌骨骨坏死模型的建立

目的：建立骨质疏松SD大鼠药物相关性颌骨骨坏死（medication-related osteonecrosis of the jaw,MRONJ）动物模型。方法：6月龄雌性SD大鼠去势法建立骨质疏松模型,术后12周皮下注射阿仑膦酸钠1.0 mg/（kg·d）,60 d后随机分为两组：第1组（对照组）给药后不予干预;第2组（实验组）连续给药后予以拔除双侧上下颌第一磨牙。术后2、4、8周每组随机处死5只大鼠并进行临床、血清学、组织病理学及组织形态学检测。采用SPSS 19.0软件包进行统计学分析。结果： 临床观察实验组术后2周开始出现MRONJ改变,发病率显著高于对照组（P<0.01）;下颌骨发生率（56.7%）高于上颌骨（26.7%）。血清RANKL和OPG浓度随时间发生显著改变,但与MRONJ发病率无显著相关性（P>0.05）。H-E染色观察MRONJ病变区骨小梁结构紊乱,骨细胞溶解导致大量空虚骨陷窝形成（P<0.05）。根据骨坏死病变和软组织损害程度对所有MRONJ动物进行分级分期,对照组发病率和病变程度显著低于实验组（P<0.05）,MRONJ病变程度随着时间变化逐渐加重。Micro-CT显示MRONJ病变区域有骨微裂发生,骨质溶解破坏; MRONJ大鼠BMD、Tb.N在MRONJ 2期与其他分组有显著差异（P<0.05）,MRONJ 0期时Tb.Sp与正常组差异显著（P<0.05）。结论：骨质疏松SD大鼠动物模型上使用高剂量阿仑膦酸钠皮下注射60 d后予以配合拔牙,术后2周开始出现MRONJ,8周可以建立较为稳定的MRONJ动物模型;拔牙是MRONJ的好发因素;MRONJ病变程度与时间有相关性;血清RANKL/OPG比值变化可能与MRONJ有相关性;Tb.Sp可能是病变早期骨形态学标志,病变区可观察到骨微裂。     

The effects of chronic zoledronate usage on the jaw and long bones evaluated using RANKL and osteoprotegerin levels in an animal model

The discovery of the receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK), RANK ligand (RANKL), and osteoprotegerin (OPG) system (RANK/RANKL/OPG system) has been one of the most important advances in bone biology in the last decade. We investigated how the chronic application of bisphosphonate affects the RANKL and OPG levels in an animal model and whether this effect may be related to bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaws (BRONJ). Thirty female Sprague–Dawley rats were used in this study. The rats were randomly divided into three groups (10 in each): Z, the zolendronate group, injected with zolendronate for 10 weeks; S, a control group, injected with saline solution for 10 weeks; and C, a control group, in which no injection was given. RANKL values in the tibia were increased in the Z group when compared with the two controls; however, the RANKL values in the mandible were decreased when compared with the controls. Although the differences did not reach statistical significance, the mandibular OPG values were increased in the Z group when compared with the C and S groups. The mechanism of RANKL negation and absence in osteoclastic activation could be a predisposing factor for the development of BRONJ.     

慢性牙周炎通过PERK-CHOP信号通路介导睾周脂肪细胞凋亡的研究

目的 探讨慢性牙周炎通过蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)-C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)信号通路对大鼠睾周脂肪细胞凋亡的影响。方法 将20只雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组。实验组构建大鼠慢性牙周炎模型,对双侧上颌第二磨牙行丝线结扎并龈沟内注射牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis-lipopolysaccharid,P. gingivalis-LPS);对照组大鼠龈沟内注射等量PBS。建模3个月后处死大鼠,通过测量牙龈出血指数(gingival bleeding index,GBI)及牙周袋探诊深度(probing pocket depth,PPD)评价牙周组织炎症,采用Micro-CT分析大鼠第二磨牙牙槽骨吸收程度。原位细胞凋亡检测法(TUNEL)染色观察睾周脂肪细胞凋亡情况。蛋白质印迹法(Western blot)检测PERK、p-PERK、CHOP、Caspase-12、Cleaved-Caspase-3的蛋白表达水平。结果 实验组大鼠GBI、PPD及釉牙骨质界至牙槽嵴顶距离显著高于对照组(P<0.05),出现明显牙龈软组织炎症和牙槽骨破坏吸收,大鼠慢性牙周炎模型建立成功。实验组大鼠睾周脂肪细胞凋亡率显著增加(P<0.05),p-PERK、CHOP、Caspase-12、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。结论 慢性牙周炎通过PERK-CHOP信号通路介导大鼠睾周脂肪细胞的凋亡。     

蓬乱蛋白2在高脂血症大鼠种植体周围早期表达的实验研究

目的 研究蓬乱蛋白2（Dvl2）在高脂血症大鼠种植体周围早期的表达。方法 24只雄性Wistar大鼠,随机均分为实验组和对照组,分别给予高脂和普通饲料。8周后,检测大鼠血脂水平并于股骨干骺端植入种植体,术后1、3、5 d处死,获得种植体周围骨组织。采用亚甲基蓝-酸性品红染色观察种植体-骨界面,采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测Runt相关转录因子2（Runx2）、组织蛋白酶K（CatK）和Dvl2的表达,免疫印迹和免疫共沉淀法检测Dvl2、磷酸化Dvl2和泛素化Dvl2的表达。结果 与对照组相比,实验组的成骨细胞、Runx2、Dvl2和磷酸化Dvl2减少（P<0.05）,而破骨细胞、CatK和泛素化Dvl2增多（P<0.05）。结论 高脂血症可能通过上调Dvl2及磷酸化、下调泛素化而抑制种植体周围早期骨改建。     

单纯经牙槽嵴顶入路上颌窦底提升术应用于后牙区严重骨高度不足的临床效果分析

目的 探讨上颌后牙区严重剩余骨高度(residual bone height,RBH)不足,即RBH在4 mm左右时应用单纯经牙槽嵴顶入路上颌窦底提升术,同期植入种植体的临床效果。方法 选择2017—2019年期间于南通市口腔医院种植科进行上颌后牙区种植修复的患者46例(51枚种植),分为不植骨组(21枚)、植骨组(15枚)、浓缩生长因子(concentrated growth factor,CGF)组(15枚),对术后即刻、术后6个月、1年、2年的骨增量变化、种植体稳定系数(implant stability quotient, ISQ)、种植体机械及生物并发症等进行观察,并进行了术后即刻和术后2周患者的满意度调查问卷。运用SPSS21.0软件对数据进行统计学分析。结果 三组术后、6个月的ISQ值比较,差异无统计学意义(P>0.05);上颌窦骨增量方面,三组和术前相比,骨增量的差异具有统计学意义(P<0.05),植骨组和CGF组增量大于不植骨组,差异有统计学意义(P<0.05);在随访问卷中,患者对于单纯经牙槽嵴顶入路上颌窦底提升术具有更高的满意度,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 在上颌后牙区RBH约4 mm左右时,单纯经牙槽嵴顶入路上颌窦底提升术具有良好的临床效果,并且更易得到患者的认可。     

持续静压力作用下牙周膜细胞骨保护素、核因子-κB受体活化因子配体表达的增龄性变化

目的 通过细胞实验观察持续静压力作用下人牙周膜细胞（HPDLCs）表达骨保护素（OPG）、核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）的增龄性变化。 方法 组织块法原代培养HPDLCs,分为A组（13~18岁）、B组（19~29岁）、C组（30~44岁）。CCK-8检测HPDLCs的增殖能力,β-半乳糖苷酶染色检测HPDLCs衰老情况。3组细胞均分别给予0、1.5、3、6、12、24、48、72 h体外持续静压力机械刺激,酶联免疫吸附测定法检测所提上清液中OPG、RANKL的表达。 结果 体外持续静压力刺激后,牙周膜细胞OPG表达水平随加力时间及年龄增长而增加（P<0.01）。RANKL表达水平随加力时间延长而增加,随年龄增长而下降（P<0.01）。OPG/RANKL比值随加力时间呈先下降后增加趋势,且随年龄增长而增加（P<0.01）。 结论 体外持续静压力作用下,增龄因素可上调牙周膜细胞OPG表达及OPG/RANKL比值,下调RANKL表达。