广东省惠州市集中空调系统冷却水及冷凝水中嗜肺军团菌脉冲场凝胶电泳分型分析

目的 分析广东省惠州市公共场所集中空调系统冷却水及冷凝水中分离的嗜肺军团菌的基因特征,初步建立惠州市嗜肺军团菌脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型数据库。方法 采用PFGE技术,对2012-2016年惠州市公共场所集中空调系统冷却水及冷凝水中分离的35株嗜肺军团菌进行电泳分析获得指纹图谱,并用BioNumerics 6.6软件对其进行聚类分析。结果 35株嗜肺军团菌分为29种不同的PFGE带型,菌株间带型相似系数为21.70%~100.00%。每种带型包含1~3株菌,存在5组带型一样的菌株,不存在优势型别;相同PFGE型别的菌株均来源于同一场所;同一场所存在2种以上不同PFGE型别;部分场所的冷却水和冷凝水中分离的菌株存在相同PFGE型别;相同血清型别的菌株经PFGE分型后得到不同的图谱,各菌株间PFGE图谱差异较大。结论 惠州市公共场所集中空调冷却水及冷凝水中分离的嗜肺军团菌呈现基因多样性。     

脉冲场凝胶电泳用于军团菌分型能力的评价

目的 评价脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术用于军团菌属不同种(Legionella species)以及不同血清型菌株的分型能力.方法 选用117株10个嗜肺军闭菌血清型,30种非嗜肺军团菌的参考菌株和我国环境分离菌株,采用Asc Ⅰ内切酶酶切,进行PFGE.从电泳条带的数量和分布、PFGE的分型力、分辨率和与流行病学资...     

上海市浦东新区副溶血弧菌病原学与分子流行病学特征分析

目的 了解上海市浦东新区副溶血弧菌病原学与分子流行病学特征。 方法 运用玻片凝集法对505株副溶血弧菌菌株进行血清学分型,运用K-B纸片法对菌株进行12种抗生素药敏试验,同时对菌株基因组DNA经限制性内切酶NotⅠ酶切后进行脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分子分型,利用BioNumerics Version 6.64 分析软件对图谱进行聚类分析,初步建立PFGE分子分型数据库。 结果 505株菌株中有117株血清型未能分型,O3:K6为患者分离株中的优势血清型,其中69.14%(56/81)的食物中毒分离株和61.87%(185/299)的散发病例分离株血清型为O3:K6型;监测食品分离株血清型分布呈现多样性,无优势菌株。99.41%(502/505)菌株对氨苄西林耐药。505株菌株共获得221个不同的PFGE带型,有26株PFGE未能分型。监测食品分离株的PFGE呈现遗传多样性,无优势带型,并且与散发及食物中毒患者分离株的PFGE带型不同。食物中毒与散发病例分离株的优势带型相同。耐2种或以上抗生素的菌株与其他菌株的PFGE型不相同,相同PFGE带型内的菌株血清型相同,不同时间、不同腹泻监测点之间存在完全相同PFGE条带。 结论 浦东新区未出现多重耐药菌株,存在多起疑似聚集性病例事件,但与监测食品分离株的遗传谱系关系较远。     

土壤中军团菌污染状况调查研究

目的 了解土壤中军团菌的污染状况和分离菌株的分子型别、对抗生素的敏感性和细胞内的生长能力。 方法 采集北京市公共场所土壤样本123份,采用军团菌GVPC选择性培养基培养法和荧光定量PCR检测法对土壤中军团菌进行检测分析。用小鼠巨噬细胞J774细胞对分离菌株进行菌株致病性研究;用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术对分离菌株进行分型分析;用E-test试纸药敏实验法对分离菌株进行红霉素、阿奇霉素、利福平、左氧氟沙星、莫西沙星5种抗生素敏感性检测。 结果 荧光定量PCR检测法在花鸟市场和夏季水库样本中检出军团菌,检出阳性率分别为50.00%和24.24%,平板培养法仅在夏季水库样本中检出军团菌,阳性率为6.06%。 分离的2株军团菌TR1和TR2均为嗜肺军团菌,血清型分别为5型和8型。 2株嗜肺军团菌均具有较高的细胞内生长能力,PFGE分型显示2株菌为不同带型,药敏实验显示2株菌均对红霉素、阿奇霉素、利福平、左氧氟沙星、莫西沙星5种常用抗生素表现敏感性。 结论 公共场所土壤中可检出嗜肺军团菌,且分离株有较高的细胞内生长能力,提示具有致病性,存在导致军团菌病散发流行或暴发的危险,应加强对公共场所土壤中军团菌的监测。      

东莞市腹泻患者沙门菌同源性及耐药性特征

目的了解广东省东莞市2007--2009年腹泻患者中沙门菌感染情况和菌株的血清型别、同源性及耐药性变化。方法对纳入研究的腹泻患者进行沙门菌检测,对分离到的菌株进行血清分型、药物敏感试验和脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型。结果2007--2009年共检测760份腹泻患者粪便标本,分离到53株沙门菌,检出率为7．0％;共分得15种血清型,鼠伤寒和肠炎沙门菌居多;大多数沙门菌对常用的头孢菌素类和喹诺酮类抗菌药物敏感,除肠炎沙门菌、斯坦利维尔沙门菌和B型副伤寒沙门菌外,其余菌株的血清型无同一PFGE型别的菌株;用XbaI酶切11株肠炎沙门菌可分为PFGE—XbsⅠ 1～6型,其中PFGE-XbaI4型为优势型别。用SfiI和Notl酶对5株肠炎沙门菌进行再分型,综合用XbaI／SfiI／NotI3种酶的结果发现仍有2组菌的PFGE图谱是完全一致的。结论2007--2009年度广东省东莞市沙门菌的感染多数为散发病例,头孢菌素类和喹诺酮类抗菌药物是治疗沙门菌感染的首选药物。     

副溶血弧菌分子分型数据库建立与分析

目的 对我国8个省（直辖市）分离的副溶血弧菌使用脉冲场凝胶电泳（PFGE）开展分子分型工作进行回顾性分析;建立副溶血弧菌PFGE分型数据库,分析其特征。方法 对2005-2014年期间分离自8个省（直辖市）的617株副溶血弧菌使用SfiⅠ酶切后进行PFGE实验,使用BioNumerics 5.01软件分析菌株的PFGE图谱并建立副溶血弧菌分子分型数据库。结果 本研究所建立的副溶血弧菌分子分型数据库共包含617条副溶血弧菌的分子分型信息。这些副溶血弧菌的PFGE图谱可以分为360个PFGE型别,按照PulseNet China的规则对这些PFGE型别进行编码。不同PFGE型别的相似系数介于35.8%~99.6%。237株外环境和食品分离菌株有221个PFGE型别,345株患者分离株有127个PFGE型别。相同血清型的副溶血弧菌具有相同或者非常相似的PFGE型别,而不同血清型之间的副溶血弧菌的PFGE型别差异则较大。大流行血清型（如O3:K6和O4:K8）具有多个优势PFGE型别,对于某些血清型,地理位置相近省份分离菌株的PFGE图谱相似性更高。结论 分离自患者菌株的PFGE图谱克隆化程度高,而分离自食品和外环境的菌株,PFGE图谱多态性较大。PFGE在发现病例成簇中能够发挥作用;对于患者相关PFGE图谱成簇的菌株应加强流行病学调查和溯源工作。     

206株中国环境分离嗜肺军团菌1型菌株基因序列分型研究

目的 对中国不同自然环境来源分离的嗜肺军团菌血清1型菌株进行分子分型和种群结构分析。方法 应用7个基因(flaA、pilE、asd、mip、mompS、proA、neuA)序列分型方法(Sequence based typing,SBT)对不同环境来源的206株嗜肺军团菌血清1型菌株进行分型研究,通过查询嗜肺军团菌SBT数据库(http://www.ewgli.org)和用BioNumerics软件构建最小生成树揭示菌株的分子分型和种群结构特征。结果 206株菌分成54个ST型(IOD=0.7205)。其中49株温泉水分离株分成25个ST型(IOD=0.9498),各位点Nei指数 0.7721~0.8563;130株冷却塔水分离株分成31个ST型(IOD=0.6453),各位点Nei指数为0.4227~0.4970;27株管道水分离株分成3个ST型(IOD=0.1453),各位点Nei指数为0.1425~0.1453。ST1型含108株菌,占52.4%,是优势带型。54个ST型形成5个克隆群。通过中国菌株和其他20个国家的菌株综合分析,共计1199株菌分成304个ST型,形成21个序列群。其中ST-1型为全球优势型别,其余型别和序列群呈地区性分布特征。结论 中国环境分离的嗜肺军团菌1型菌株具有高度复杂的基因多态性和种群结构,其中ST1是我国也是全球环境菌株的优势型别。     

肺炎克雷伯菌脉冲场凝胶电泳分型能力评价

目的 评价脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)技术用于肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的分型能力。 方法 选用220株肺炎克雷伯菌,对PFGE方法的分型力、可重复性、分辨力、流行病学一致性及其与多位点序列分型(MLST)的分型一致性进行评价。挑选全部220株菌株进行实验,评价PFGE的分型力;挑选18株菌株重复2次实验评价PFGE的可重复性;分别挑选3组无流行病关联的碳青霉烯耐药临床株、腹泻患者肠道分离株、食品分离株,使用Simpson差异指数(D)评价PFGE的分辨力;挑选同一次暴发期间分离的34株菌株,评价PFGE的流行病学一致性及其与MLST对暴发菌株分型结果的一致性;挑选64株不同来源的菌株,评价PFGE和MLST分型对流行病学不相关菌株的分型一致性。用BioNumerics软件对所有实验菌株的PFGE图谱进行分析。 结果 220株肺炎克雷伯菌中有216株通过PFGE能够获得有效的图谱,其分型力为98.18%(216/220);18株菌株重复2次实验的图谱完全一致;PFGE对无流行病关联的50株碳青霉烯耐药临床株、34株腹泻患者肠道分离株、48株食品分离株分型的D值分别为0.9910、0.9964、1.0000;针对34株暴发期间分离菌株,PFGE能够很好地甄别出暴发菌株,高度相关菌株和不相关菌株,并且分型结果与菌株分离病区、分离时间具有一致性;针对暴发菌株,PFGE能够将相同MLST型别的菌株聚成一簇;针对流行病学不相关菌株,PFGE不能将相同MLST型别的菌株分成相同或相似的带型或者聚成一簇。 结论 PFGE对肺炎克雷伯菌分型具有很好的分型力、可重复性和分辨力;针对暴发菌株,PFGE能够将相同MLST型别的菌株聚成一簇;针对流行病学不相关菌株,PFGE和MLST分型一致性差。     

嗜肺军团菌毒力岛基因聚合酶链反应分型鉴定

目的建立嗜肺军团菌毒力岛基因分型鉴定方法，探讨其致病特性和分布状况。方法根据GenBank公布的嗜肺军团菌核苷酸序列设计和合成嗜肺军团菌种和毒力岛基因鉴定引物，采用PCR法对25株军团菌属标准参考株，3株国内和20株广东分离嗜肺军团菌，53份临床标本和57份水样、进行嗜肺军团菌种和毒力岛基因分型鉴定。结果5株嗜肺军团菌标准株只有嗜肺军团菌1型（Philadelphia-1 ATCC 33152）12个毒力岛基因全阳性，其他4株只检出11个毒力岛基因。20株军团菌属中其他菌株，分别检出2—11个毒力岛基因；3株国内嗜肺军团菌检出11个毒力岛基因；广东地区分离的20株嗜肺军团菌，7株检出12个毒力岛基因，12株检出11个毒力岛基因，1株未检到毒力岛基因。53例病源不明性肺炎患者支气管洗液和痰液，PCR检测嗜肺军团菌DNA阳性5例（9．4％）。结论广东地区嗜肺军团菌广泛存在水源环境中，而且是医院感染性肺炎的重要病源之一。不同血清型嗜肺军团菌所含毒力岛基因不同，毒力岛基因与致病性相关。     

中国六省伤寒沙门菌的脉冲场凝胶电泳分析及数据库的建立

目的对中国六省分离的伤寒沙门菌进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析,初步建立中国伤寒沙门菌的数据库。方法采用PFGE技术,对中国1979-2005年六省分离的伤寒沙门菌用XbaⅠ酶切,用BioNumerics软件对PFGE图谱进行分析,并且建立中国分子分型数据库。结果收集的417株菌株共有288种不同的PFGE带型,相似性系数在55.2%～100%之间,不同的省份和年份之间有交叉带型。结论中国伤寒沙门菌的菌株变异较大,不同的省份可能存在不同克隆系的伤寒沙门菌菌株的流行。 通过建立中国伤寒沙门菌PFGE带型数据库,对中国以后伤寒沙门菌的监测具有重要的意义。     

Macrolide resistance and erythromycin resistance determinants among Belgian Streptococcus pyogenes and Streptococcus pneumoniae isolates

Resistance of streptococci to macrolide antibiotics is caused by target-site modification or drug efflux. The phenotypic expression of target-site modification can be inducible or constitutive. The prevalence of the three phenotypes among Belgian erythromycin-resistant Group A streptococci (GAS) and Streptococcus pneumoniae isolates was surveyed, their MICs for seven antibiotics were determined and the clonality of the isolates was explored. Of the 2014 GAS isolates tested 131(6.5%) were erythromycin resistant (MIC > 1 mg/L): 110 (84.0%) showed the M-resistance phenotype whereas the remaining 21 strains (16.0%) were constitutively resistant. No inducibly resistant strains were detected. Of 100 S. pneumoniae isolates, 33 were erythromycin resistant (MIC > 1 mg/L). In contrast to the GAS isolates, only 9.1% of the 33 erythromycin-resistant S. pneumoniae isolates showed the M-resistance phenotype. The presence of mefA/E and ermB genes in the M-resistant and constitutively and inducibly resistant strains, respectively, was confirmed by PCR analysis. Genomic analysis based on pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) using the restriction enzyme SfiI, revealed 54 different PFGE patterns among the 131 erythromycin-resistant GAS isolates, of which an M6 clone represented 16.0% of the strains; all other clones, exhibiting different M-types, represented <7% of the strains. The S. pneumoniae isolates also appeared to be polyclonally based, as determined by arbitrarily primed PCR. The macrolides miocamycin and rovamycin, the lincosamide clindamycin and the ketolide HMR 3647 showed excellent activity against the M-resistant GAS and S. pneumoniae strains.     

多位点串联重复序列分析应用于中国肠炎沙门菌分型能力的评价

目的 比较脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点串联重复序列分析（MLVA）分型方法用于我国肠炎沙门菌分子分型的能力,建立我国肠炎沙门菌MLVA分型标准操作方法及数据库。方法 根据国际PulseNet公布的肠炎沙门菌PFGE和MLVA分型方案,对来自我国6个省（直辖市）的289株肠炎沙门菌进行分子分型分析,并结合流行病学资料,评价这两种分型方法对我国肠炎沙门菌分离株的分型能力。结果 289株肠炎沙门菌经XbaⅠ酶切,PFGE后获得55种带型,其分辨能力（D值）为0.8433。PFGE优势带型为JEGX01.CN0003及JEGX01.CN0001,带型频率分别为35.6%、25.6%,但二者仅表现两个条带的差异,其余型别均低于5%。采用MLVA分析,获得63种型别,分为2个群,D值为0.8608,说明MLVA分辨能力高于单酶切PFGE,但分型能力仍然有限。MLVA主要型别ST1包含了97株菌株,占37.5%,分布于各省及各年份。若联合PFGE及MLVA分型,则产生104种型别,D值为0.9058。对流行病学调查显示为肠炎沙门菌暴发病例菌株进行PFGE双酶切及MLVA分型,结果均显示这些菌株具有明显的聚集性,但不能与同期散发菌株完全区分开。结论 MLVA与PFGE分型方法的分辨能力在肠炎沙门菌中较低,在确认肠炎沙门菌引起的暴发事件时,需紧密结合流行病学调查资料,采用双酶切PFGE或MLVA进行分型分析。     

Evaluation of restriction enzymes for standardizing pulsed-field gel electrophoresis protocol for rapid subtyping of Vibrio parahaemolyticus

We evaluated the cost-effectiveness of the restriction enzymes with rare-cutting sites in the genome of Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 for pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) analysis. The evaluation indicated that PFGE with both NotI and SfiI was discriminatory, but NotI was more cost-effective. Based on the results of this study, we suggest using NotI and SfiI as the 1st and the 2nd restriction enzyme for standardizing the PulseNet PFGE protocol for molecular subtyping and global surveillance of V. parahaemolyticus.     

肺炎链球菌呼吸道感染分离株的耐药性

目的：研究肺炎链球菌呼吸道感染分离株的耐药性及其传播情况。方法：肺炎链球菌分离株进行药物敏感试验和血清学分型,并结合BOX PCR、脉冲场电泳(pulse—field gel electrophoresis,PFGE)和青霉素结合蛋白基因(penicilin binding proteingene,pbp)指纹等分子生物学方法分析菌株间亲缘关系。结果：呼吸道感染分离株128株中有青霉素低度耐药株(penicillin intermediated Streptococcus pneurnoniae,PISP)10株,未发现青霉素高度耐药株(penicillin resistant Streptococcus pneumoniae,PRSP)。lll株存活菌株分属25种血清型,主要为23F、3、19F、14、9V、6A、6B等。9株存活PISP中有6种PFGE谱型,2株PFGE谱型相同菌株的耐药谱和血清型相仿;2株不同PFGE谱型菌株pbp指纹相似,对青霉素和头孢曲松敏感性相似;上述呼吸道感染分离PISP中未发现与世界主要流行耐药克隆代表株DNA指纹或pbp基因相似菌株。结论：上述肺炎链球菌呼吸道感染分离株青霉素耐药率尚低,存在青霉素耐药克隆和基因的传播,其中尚未发现世界主要流行耐药克隆。     

Epidemiology and evolution of genotype and antimicrobial resistance of an imported Shigella sonnei clone circulating in central Taiwan

Shigella sonnei replaced Shigella flexneri to become the predominant species for shigellosis in 2001 to 2003 in central Taiwan. A total of 425 S. sonnei isolates collected from 1996 to 2004 were available for characterization by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), inter-IS1 spacer typing (IST), and antimicrobial susceptibility testing. The results showed that at least 21 IST clones had emerged for the S. sonnei infections in 1996 to 2004. Most IST clones lasted for a short time; some circulated for 2 to 3 years. An IST1 clone, detected for the first time in 2000, was the most prevalent and responsible for the shigellosis epidemic in 2001 to 2003. Over 3 years of sustained transmission, the IST1 clone evolved into many strains with different PFGE genotypes and antibiograms. The ancestor, with a J16N09.0019 PFGE genotype, remained to be the predominant circulating strain in the period studied; however, new strains with certain PFGE genotypes and antibiograms could become major circulating strains for subsequent infections.