人白血病抑制因子受体单抗靶向脂质体微泡的制备及其体外荧光鉴定

目的 制备人白血病抑制因子受体( LIFR)单抗靶向脂质体微泡,并对其微泡微囊的连接可靠性进行体外免疫荧光鉴定.方法 利用生物素-亲和素桥连技术,构建LIFR单抗脂质体微泡(MB-BSB-LIFR-AB).以FITC荧光亲和素标记普通脂质体微泡(MB)、生物素化脂质体微泡(MB-B),以两个不同浓度梯度(1:4和1:16)的DTAF荧光二抗分别标记MB、MB-B、生物素-亲和素脂质体微泡(MB-BS)、MB-BSB-LIFR-AB;荧光显微镜下观察微泡荧光强度并分为0级、1级、2级、3级.结果 加入FITC荧光亲和素后,MB-B呈现3级明亮的绿色荧光,而MB无荧光显示(0级);以1:4和1:16浓度梯度的DTAF荧光二抗孵育后,MB-BSB-LIFR-AB均发出3级明亮的绿色荧光;而MB-BS、MB-B仅在1:4时显示1级微弱的绿色荧光;MB在两个浓度梯度下均无荧光显示(0级).结论 携LIFR单抗通过生物素-亲和素桥连技术有效连接在MB-B微囊;体外荧光法是鉴定靶向脂质体微泡配体连接可靠性的简便方法.     

亲和素桥连构建携抗P选择素单抗靶向超声微泡及体外荧光鉴定

目的 体外荧光方法鉴定生物素-亲和素-生物素(BSB)桥连技术构建携带抗P-选择素单抗靶向超声微泡(MB-BSBp)的町靠性.方法 不同荧光标记物分别标记MB-BSBp的不同部位,观测微泡荧光强度(0、1、2和3级),以普通脂质超声微泡(MB)作对照.结果 加入FITC荧光亲和素孵育,生物紊化脂质微泡(MB-B)呈现明亮的绿色荧光(3级),而MB无荧光显示(0级).以两个浓度梯度(1:4和1:16)的DTAF荧光二抗(抗抗P-选择素单抗抗体)标记MB、MB-B、MB-BS和MB-BSBp,MB-BSBp在两个浓度梯度下均发出明亮的绿色荧光(3级);而MB-B、MB-BS仅在1:4时显示微弱的绿色荧光(1级),MB在两个浓度梯度下均无荧光显示(0级).结论 抗P-选择素单抗通过亲和素桥连有效装配在MB-B表面,体外荧光法是鉴定靶向微泡配体连接可靠性的简便方法.     

携抗P-选择素单抗靶向微泡在炎症模型微循环中黏附机制及行为方式的研究

Objective To evaluate the adhesion mechanisms and microvascular behaviors of P-selectin targeted microbubbles and isotype control microbubbles.Methods The targeted microbubbles with FITC fluorescence and antibodies of P-selectin (MBp), and the isotype control microbubbles with FITC fluorescence and isotype antibodies(MBiso) were constructed.MBp and MBiso were injected intravenously in random to wild-type mice with TNF-α stimulus.The mechanisms and behaviors of MBp and MBiso in cremasteric venules were assessed by fluorescence microscopy.And then velocity variation of ultrasound microbubbles in microvascular was analyzed by tracking fixed-point technology of image-pro-plus software.Results The retention of microbubbles directly to venular endothelium amounted to (8.4 ± 2.1 )/view in MBp-group,while it was only (0.8 ± 0.8)/view in MBiso-group.Difference was evident between of the two groups( P ＜0.01 ).The numbers of MBp and MBiso attachment to activated leukocytes were (3.6± 0.6)/view and (2.2± 0.8)/view separately.There was no obvious difference between the two groups( P ＞0.05).The variation curves of velocity in MBp and MBiso targeting to venular endothelium were different.The flowing rate decreased gradually in MBp-group,while it decreased rapidly in MBiso-group.Conclusions MBp and MBiso have different behaviors targeting to venular endothelium, MBp could adhere to vascular endothelial efficiently and specifically, these results suggest MBp may be used to assess inflammation of vascular endothelial or other tissue injury effectively.     

携抗αvβ3-整合素单抗靶向微泡对肿瘤新生血管靶向效应的研究

目的 探讨携抗αvβ3-整合素单抗靶向微泡对肿瘤新生血管的靶向效应.方法 通过生物素桥接法制成携抗αvβ3-整合素单抗的靶向脂质微泡(MBa)、对照微泡携同型抗体脂质微泡(MBc);选取12只HepG2皮下移植瘤裸鼠模型(肿瘤组)和正常对照裸鼠(对照组),经尾静脉随机注射MBa、MBc和RGDfvV封闭10 min后再注射MBa(Blocking+MBa),并行对比超声检查,测量声强度(VI).分别取肿瘤组肿瘤组织和对照组正常骨骼肌组织行病理学和免疫组化检查.结果 肿瘤组中MBa的VI值(17.43±3.30)U,较MBc的VI值(5.88±1.04)U增大近3倍,差异有统计学意义(P <0.01),应用RGDfvV封闭αvβ3-整合素后MBa的VI值降至(6.14±2.25)U,与MBc及对照组的各VI值比较差异均无统计学意义.免疫组化检查显示:肿瘤组织的新生血管内皮有大量αvβ3-整合素显色,可被RGDfvV封闭;而骨骼肌中仅有少量αvβ3-整合素显色.结论 携抗αvβ3-整合素单抗的靶向微泡对肿瘤新生血管具有明显的靶向效应,有望用于肿瘤的诊断和疗效评估.     

携抗P-选择素单抗靶向微泡在炎症模型微循环中黏附机制及行为方式的研究

Objective To evaluate the adhesion mechanisms and microvascular behaviors of P-selectin targeted microbubbles and isotype control microbubbles.Methods The targeted microbubbles with FITC fluorescence and antibodies of P-selectin (MBp), and the isotype control microbubbles with FITC fluorescence and isotype antibodies(MBiso) were constructed.MBp and MBiso were injected intravenously in random to wild-type mice with TNF-α stimulus.The mechanisms and behaviors of MBp and MBiso in cremasteric venules were assessed by fluorescence microscopy.And then velocity variation of ultrasound microbubbles in microvascular was analyzed by tracking fixed-point technology of image-pro-plus software.Results The retention of microbubbles directly to venular endothelium amounted to (8.4 ± 2.1 )/view in MBp-group,while it was only (0.8 ± 0.8)/view in MBiso-group.Difference was evident between of the two groups( P ＜0.01 ).The numbers of MBp and MBiso attachment to activated leukocytes were (3.6± 0.6)/view and (2.2± 0.8)/view separately.There was no obvious difference between the two groups( P ＞0.05).The variation curves of velocity in MBp and MBiso targeting to venular endothelium were different.The flowing rate decreased gradually in MBp-group,while it decreased rapidly in MBiso-group.Conclusions MBp and MBiso have different behaviors targeting to venular endothelium, MBp could adhere to vascular endothelial efficiently and specifically, these results suggest MBp may be used to assess inflammation of vascular endothelial or other tissue injury effectively.     

含生物素化脂膜超声造影剂的制备与初步评价

目的 制备一种含生物素化脂膜的超声造影剂,并对其功能进行初步评价.方法 以冷冻干燥法在自制＂脂氟显＂（对照微泡）的基础上制备含生物素化脂膜超声造影剂微泡,检测其理化性质和造影功能,同时应用激光共聚焦显微镜和平行板流动腔法观察含生物素化脂膜微泡与链亲和素的黏附性.结果 ①含生物素化脂膜微泡造影剂在理化性质与小鼠肝脏造影显像方面能力与对照微泡比较差异无统计学意义（P〉0.05）;②与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的链亲和素孵育后,含生物素化脂膜微泡荧光检测呈阳性,对照微泡为阴性;③含生物素化脂膜微泡可结合于链亲和素包被的培养皿上,且随着链亲和素包被浓度的增加其结合稳定性也相应提高.结论 应用冷冻干燥法在制备＂脂氟显＂微泡造影剂的基础上,可成功制备含生物素化脂膜超声微泡造影剂,为今后制备靶向显影及载药（基因）超声造影剂奠定了基础.     

携抗白细胞介素-2受体α单抗靶向超声微泡黏附效能的体内外评价

目的构建小鼠携抗白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)单抗靶向超声微泡(MB_(IL-2Rα))及体内外评价其靶向黏附效能。方法采用"亲和素-生物素"桥连法构建携带荧光FITC的MB_(IL-2Rα)和普通超声微泡(MB)。首先利用平行板流动腔体外评价在不同时间点、不同浓度小鼠IL-2Rα包被下MB_(IL-2Rα)结合数目。然后,分别随机经静脉将MB_(IL-2Rα)和MB弹丸式注入对照组(10只)和TNF-α处理组(10只)的小鼠提睾肌炎症模型。同时,200倍荧光显微镜直视下观察并记录5min内两组中不同微泡在提睾肌微血管中的黏附数量和黏附情况。结果体外结果显示,MB_(IL-2Rα)结合数量随着IL-2Rα包被浓度的增高而增加(P0.05),并与结合时间呈明显相关(P0.05);体内荧光显微镜下TNF-α处理组MB_(IL-2Rα)黏附数量[(4.6±1.1)个/200倍视野)]明显高于MB黏附数量[(3.0±0.7)个/200倍视野](P0.05);且TNF-α处理组MB_(IL-2Rα)黏附数量分别为对照组MB_(IL-2Rα)和MB黏附数量的(2.8±0.8)和(3.7±1.4)倍(P0.01)。结论 MB_(IL-2Rα)可与IL-2Rα特异、有效地结合,其高效黏附性能将有助于进一步对移植排斥反应的靶向超声分子显影。     

超声微泡-阳离子纳米脂质体复合体制备的实验研究

目的 利用生物素亲和素系统连接超声微泡与阳离子纳米脂质体,制备一种新型的基因载体.方法 机械振荡法制备生物素化超声微泡(Bio-MB).薄膜分散-膜挤压法制备生物素化阳离子纳米脂质体(Bio-CNLP).采用生物素亲和素系统偶联Bio-MB与Bio-CNLP.以非生物素化超声微泡(MB)加非生物素化阳离子纳米脂质体(CNLP)组作为对照,行激光共聚焦显微镜观察复合物形态与连接效果.结果 Bio-CNLP的平均粒径约291.7 nm,平均表面电荷约(21.6±2.1)mV.激光共聚焦显微镜下Bio-MB+Bio-CNLP组可见绿色Bio-MB壁因连接Bio-CNLP而不光滑,周围可见红色小圆形点状Bio-CNLP呈花环状聚集,而MB+CNLP组MB壁光滑,周围未见CNLP聚集.结论 生物素亲和素系统可成功将Bio-CNLP与Bio-MB牢固连接,有望为肿瘤基因治疗提供一种新的手段,为探索基因载体和转染方法提供一种新的思路.     

包裹紫杉醇的高分子纳米粒与超声脂质微泡复合体的制备研究

目的制备一种利用生物素亲和素技术耦联的新型包裹紫杉醇的微泡,并对其连接效果、理化性质进行检测。方法采用单乳化法制备包裹紫杉醇的PLGA-COOH纳米粒(Pac PLGA),检测其包封率,并用碳二亚胺法将其与链霉亲和素(SA)耦联,免疫荧光法检测Pac-PLGA与SA的连接情况。采用机械振荡法制备生物素化的超声微泡(BIOOMB)及超声微泡(MB)。分2组用激光共聚焦不同时间点观察超声微泡与Pac PLGA的连接效果。结果 Pac PLGA平均粒径为131.1 nm,包封率为(85±2.1)%,电镜观察呈球形,大小均匀,分散度好。荧光检测SA成功的连接在Pac-PLGA上。激光共聚焦观察生物素-亲和素组Pac-PLGA较多地连接在BIO-MB的表面。而对照组MB表面未见Pac PLGA的聚集。结论本实验成功地制备出包裹紫杉醇的新型载药微泡,有望为乳腺癌治疗提供一种理想的药物载体和靶向给药系统。     

生物素-亲和素介导以KDR为靶点的脂质体超声造影剂体外靶向实验研究

目的 以与VEGF的主要受体KDR特异性结合的小肽K237为配体研制靶向脂质体超声造影剂并进行体外性能鉴定.方法 采用"生物素一亲和素"桥接法构建靶向微泡(P-Bio-Av-Bio-Mbs),将KDR不同程度表达的细胞LOVO、HUVECs和LS174T分别与P-Bio-Av-Bio-Mbs孵育,同时另将荧光标记生物素-亲和素桥接靶向脂质体微泡(FITC- P-Bio-Av-Bio-Mbs)、荧光标记的单纯小肽微泡复合物(FITC-P-Mbs)及荧光标记的普通脂质体微泡(FITC-Mbs)分别与LOVO细胞孵育,光镜及荧光显微镜观察微泡与细胞结合的花环形成率及荧光强度;分别以10 ?g、50 ?g的小肽K237预先与LOVO细胞孵育,再将P-Bio-Av-Bio-Mbs与LOVO细胞孵育,观察细胞周围微泡分布.结果 KDR强阳性表达的LOVO细胞周围花环形成率高达90.52%,荧光强度3级,KDR阳性表达的HUVECs周围花环形成率53.46%,荧光强度2级,KDR阴性表达的LS174T细胞周围少数微泡黏附,花环形成率5.57%.荧光强度0～1级,组间花环形成率比较差异有统计学意义(P<0.05).FITC-P-Bio-Av-Bio-Mbs、FITC-P-Mbs及FITC-Mbs与LOVO细胞结合,花环形成率分别为89.62%、7.56%、0%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05),荧光强度分别为3级、0～1级、0级.10?g预处理组靶细胞周围花环结构明显减少,50 ?g封闭组靶细胞周围无花环形成.结论 以KDR为靶点携小肽K237的靶向脂质体造影剂通过生物素-亲和素桥介导成功制备,在体外能与靶细胞高效特异结合.针对KDR为靶点进行肿瘤新生血管分子靶向显像可能为肿瘤早期诊断提供新的思路.     

白细胞介素18靶向超声微泡对动脉斑块分子成像的实验研究

目的研究白细胞介素18（IL-18）靶向超声微泡对动脉粥样硬化斑块的超声分子成像。 方法以高脂喂养-免疫损伤法构建实验兔动脉粥样硬化斑块模型,超声检查监测动脉造模过程。以生物素-亲和素法制备IL-18靶向超声微泡,实验动物麻醉后随机使用裸微泡（MBc）及靶向微泡（MBt）分别对动脉斑块进行超声造影检查,检查结束后处死动物取目标斑块行病理检查及Western-blotting检测。 结果10只实验兔成功构建动脉粥样硬化模型,光学显微镜观察MBt物理性质稳定,荧光显微镜显示MBt表面带有均匀的绿色光环。对目标斑块超声造影强度行半定量分析,MBc组平均强度为202 ± 18,MBt组平均强度为237 ± 7,差异有统计学意义（t=6.472,P < 0.001）。病理检查示动脉管腔内见粥样斑块形成,Western-blotting检测示斑块内均可检测到IL-18蛋白表达,相关性分析示MBc组造影强度与斑块内IL-18蛋白表达相对量没有相关性（r=0.534,P=0.112）,MBt组造影强度与斑块内IL-18蛋白表达相对量呈线性正相关（r=0.904,P < 0.001）。 结论MBt对粥样斑块的显影能力优于MBc,可实现动脉粥样硬化斑块早期、敏感、特异性的诊断和治疗。     

P-选择素靶向超声微泡与普通超声微泡粘附途径和效能的对比研究

目的荧光显微镜直视下对比评价P-选择素靶向超声微泡与普通超声微泡在炎症内皮上的粘附途径和效能。方法构建携荧光FITC、抗P-选择素单抗的靶向超声微泡（MBp）和携荧光FITC普通超声微泡（MB）,随机经静脉弹丸式分别注入对照组（10只）和肿瘤坏死因子（TNF—α）处理组（10只）的小鼠提睾肌炎症模型。同时,20高倍荧光显微镜观测5min内两组不同微泡在提睾肌微血管中的粘附数量和粘附途径。结果TNF—α处理组MBp粘附数量为（12±2．6）个／视野,而MB粘附数量为（3±1．2）个／视野,两者差异有统计学意义（P〈0．01）;且TNF—α处理组MBp粘附数量分别为对照组MBp和MB的（6．4±1．7）倍和（9．9±2．1）倍（P〈0．01）。TNF-Ⅱ处理组和对照组分别有（69．6±2．6）％和（56．6±25．4％）的MBp通过直接与内皮细胞结合实现粘附,而MB内皮粘附率仅为（24．6±23．3）％和（20．0±27．4）％。结论与MB比较,MBp能高效、特异地粘附于炎症组织血管内皮上,应用其可有效评价血管内皮炎症反应或其他组织损伤。     

膜联蛋白Ⅴ微泡体外高特异性靶向识别凋亡细胞

目的制备可识别细胞凋亡的膜联蛋白Ⅴ(annexinⅤ)超声靶向微泡(MB),观察其体外寻靶能力。方法利用生物素-亲和素系统制备靶向MB,并评价其理化性质及靶向配体结合状况。将人甲状腺未分化癌细胞株传代培养至对数期,随机分为3份,以微波消融其中2份,以1份作为对照,获得凋亡细胞并进行验证。于荧光显微镜下观察3组annexinⅤ靶向MB与普通MB:A组,凋亡细胞+普通MB;B组,正常细胞+annexinⅤ靶向MB;C组,凋亡细胞+annexinⅤ靶向MB。结果仅凋亡细胞可与annexinⅤ靶向MB稳定结合。结论 annexinⅤ靶向MB可在体外靶向结合凋亡细胞。     

Annexin V微泡对凋亡组织寻靶的试验研究

目的制备Annexin V靶向微泡,评价其理化性质,并进行初步体外寻靶试验探究。方法生物素-亲和素桥接法制备Annexin V靶向微泡,粒径分析仪、Malvern电位仪评价其理化性质,免疫荧光染色法评估靶向配体结合状况,用荧光显微镜观察其形态、大小及分布状态。建立人甲状腺未分化癌裸鼠模型,对其进行微波消融,诱导肿瘤组织凋亡。随机分组,A组为普通微泡,B组为Annexin V抗体预饱和+靶向微泡,C组为Annexin V靶向微泡,比较3组微泡与消融后凋亡肿瘤组织的结合情况。结果成功制备Annexin V靶向微泡,微泡形态大小一致,理化性质稳定;A组和B组,基本未见微泡与肿瘤组织切片稳定结合,而C组见Annexin V微泡与组织稳定结合。结论采用生物素-亲和素桥接法制成Annexin V靶向微泡;且在体外能与凋亡肿瘤组织稳定结合,即成功寻靶,从而实现识别检测凋亡组织的功能。     

携抗P-选择素单抗靶向微泡在炎症模型微循环中黏附机制及行为方式的研究

目的 荧光显微镜直视下对比评价携抗P-选择素单抗靶向微泡与同型对照微泡在微循环中的黏附机制及行为方式.方法 构建携荧光FITC的抗P-选择素单抗靶向微泡(MBp)和同型对照微泡(MBiso),并随机经静脉注入小鼠提睾肌炎症模型.20倍荧光显微镜直视下观察并记录5min内两种微泡在提睾肌微循环中的黏附情况,并对不同黏附方式的微泡进行计数.应用image-pro-plus分析软件对微泡进行定点追踪,并对其黏附过程中速度的变化进行定量测定.结果 荧光显微镜下观察可见MBp组与内皮黏附数量高达(8.4±2.1)个/视野,MBiso组仅为(0.8±0.8)个/视野,两者间差异有统计学意义(P＜0.01);MBp和MBiso组白细胞黏附数量分别为(3.6±0.6)个/视野、(2.2±0.8)个/视野,两者间差异无统计学意义(P＞0.05).微泡黏附过程速度变化曲线显示MBp和MBiso分别以流动速度逐渐和迅速降低两种方式实现对靶组织的黏附.结论 MBp和MBiso具有不同的黏附方式,MBp能更高效、特异地黏附于炎症组织血管内皮上,为评价血管内皮炎症反应或其他组织损伤的应用提供了理论基础.     

细胞间黏附分子-1靶向微泡超声造影成像评价肾移植后急性排异反应

目的 探讨靶向超声分子成像评价肾移植后急性排异反应的可行性.方法 采用“亲和素-生物素”桥接法构建携抗细胞间黏附分子-1(ICAM-1)靶向微泡(MBI)和携同型抗体对照微泡(MB).10只SD大鼠行左侧肾异种移植术,术后72 h移植肾随机先后注入MBI和MB(间隔30 min),分别于注入3 min后行移植肾超声造影检查,并测量移植肾声强度(VI),最后进行肾组织病理及免疫组化检测.结果 移植肾在注入靶向超声微泡后可见肾区域明显灌注显影,延迟3 min显像MBI组在移植肾可见显著的超声显影增强.而MB组移植肾仅见轻度的超声显影增强,其显影强度较前者明显减弱.MBI组和MB组移植肾VI值分别为(27.0±7.4)U、(10.2±2.4)U,两者之间差异有统计学意义(F=64.744,P＜0.05).结论应用靶向ICAM-1超声微泡和超声造影结合能有效评价大鼠肾移植急性排异.     

αv-整合素超声分子成像可视化评价基质胶血管新生

目的 探讨应用携带αv-整合素分子探针的分子成像可视化评价基质胶血管新生的可行性.方法 10只实验小鼠分别于腹部皮下注射添碱性成纤维细胞生长因子(FGF)-2的基质胶制备血管新生模型.于注射后第10 d所有小鼠经尾静脉随机先后(间隔30min)弹丸注射携抗小鼠αv-整合素单抗靶向微泡(MBα)、携同型抗体对照微泡(MBc),并分别于注入后6 min行基质胶超声造影检查,测量基质胶的显影强度(video intensity,VI).随后,所有小鼠均预先αMBcv-整合素单抗封闭10 min后再注入MBα和MBc行超声造影检查.最后进行基质胶组织学检查.结果 超声造影图像显示MBα组呈明显的超声显影,VI值高达(20.5±3.3)U,而MBc组仅见轻度的超声显影,其VI为(4.8±1.5)U,两者之间差异有统计学意义(P＜0.05).预先单抗封闭αv-整合素后,MBα的VI值仅为封闭前的22.4%,两者之间差异有统计学意义(P＜0.05);而MBα的VI值较封闭前无明显变化,两者之间差异无统计学意义(P＞0.05).病理学检查显示基质胶中有丰富的新生血管形成,新生血管中有大量αv-整合素表达.结论 应用携带αv-整合素分子探针的超声分子成像可有效特异地评价基质胶血管新生.