人骨髓间充质干细胞对同种异体调节性T细胞的影响及可能机制实验研究

本研究探讨人骨髓间充质干细胞（human mesenchymalstem cells,hMSC）对同种异体CD4^＋CD25^＋调节T细胞的作用,进一步查明人骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞免疫调节作用的可能机制。从人骨髓中分离培养hMSC,通过免疫组织化学方法检测其表面标记并进行鉴定。从非亲缘供者健康人外周血中提取单个核细胞,在IL-2作用下体外培养,实验组加入不同数量级hMSC（1×10^3,1×10^4,1×10^5）共培养5天,对照组加入PBS。于结束培养前18小时经3H-TdR标记后用β液体闪烁计数仪检测T淋巴细胞增殖,流式细胞术检测各组CD4^＋CD25^＋T细胞的百分率,RT-PCR检测各组细胞Foxp3的相对表达量（Foxp3/β-actin）,ELISA分别测定上清中TGF-β、IL-10、IFN-γ和IL-12的表达。Pearson检验分析Foxp3相对表达量与CD4^＋CD25^＋T细胞百分率的相关性,以及Foxp3相对表达量、CD4^＋CD25^＋T细胞百分率与T淋巴细胞增殖程度（counts per minute,CPM值）,细胞因子TGF-β、IL-10、IFN-γ和IL-12表达量的相关性。结果表明：hMSC能明显抑制T淋巴细胞增殖,且抑制作用与hMSC呈剂量依赖性;实验组各组CD4^＋CD25^＋T细胞亚群含量以及Foxp3相对表达水平均较对照组明显增加（p〈0.05）,且实验组间比较差异仍具有统计学意义（p〈0.05）;Foxp3表达水平、CD4^＋CD25^＋T细胞百分率与T淋巴细胞增殖水平呈明显负相关（p〈0.05）,与TGF-β、IL-10表达量呈明显正相关,而与IFN-γ和IL-12的表达无明显相关性。结论：hMSC呈剂量依赖性抑制同种异体淋巴细胞增殖,其机制可能与hMSC通过分泌TGF-β、IL-10促进CD4^＋CD25^-T细胞向表达Foxp3的CD4^＋CD25^＋调节T细胞转化,进而发挥免疫抑制作用有关。     

氩氦刀治疗小鼠肺腺癌后瘤周注射树突状细胞对冷冻免疫效应的影响

目的探讨氩氦刀治疗小鼠肺腺癌后,在瘤体周围注射树突状细胞(dendritic cells,DCs)是否可提高冷冻免疫效应。方法 38只T739荷瘤小鼠(LA795肺腺癌,瘤体位于右后肢皮下,直径7±0.5mm)随机分成2组(19只/组)。实验组:双循环氩氦冷冻消融后于瘤周注射DCs;对照组:双循环氩氦冷冻消融。术后第3、7、14d脱颈处死小鼠,眼眶采血(3只/组/时间点),流式细胞术微球阵列法检测细胞因子IL-12,IFN-γ,IL-4,IL-10浓度;流式细胞术检测CD4+T、CD8+T细胞比例;每组10只小鼠用于观察生存时间。结果实验组在各时间点IL-12、IFN-γ浓度均高于对照组,IL-4、IL-10浓度均低于对照组;实验组CD4+T细胞比例在各时间点均高于冷冻治疗组,CD8+T细胞在术后第7、14d均高于对照组。以上所有差异均具有统计学意义(P0.05)。在术后第3d,实验组CD8+T细胞比例高于对照组,但其差异无统计学意义(P0.05)。实验组生存率高于对照组,其差异具有统计学意义(P0.05)。结论氩氦冷冻消融术后在瘤周注射DCs可显著提高冷冻治疗的抗肿瘤免疫效应,并延长生存时间。     

前列腺素E2对Th1／Th2和Tcl／Tc2淋巴细胞免疫平衡的调节

本研究探讨前列腺素E2（PGE2）对外周血T淋巴细胞体外增殖的影响,以及对Th1／Th2和Tc1／Tc2细胞的免疫平衡的调节作用。不同浓度PGE2与抗CD3和抗CD28单克隆抗体（mAb）和健康成人外周血单个核细胞（MNC）共同培养120小时,测定细胞增殖程度。ELISA方法测定24、48、72和120小时细胞培养上清液中IFN-γ和IL-4浓度变化。流式细胞仪测定CD4＋IL-4＋T细胞和CD4＋1FN-γT细胞以及CD8＋IL-4＋T细胞和CD8＋IFN-γ＋ T细胞比值。各实验均以不加PGE2为对照。结果表明：①随PGE：的浓度增加,T细胞体外增殖的抑制率明显增高（p=0．001）;T细胞增殖抑制率与PGE2浓度之间呈明显的正相关（r=0．889,P=0．000）。②实验组培养120小时的IFN-γ浓度与第72小时的IFN-γ浓度差异无显著性（P=0．917）,对照组细胞培养上清液中的IFN-γ浓度随时间持续增高（P=0．046）;实验组不同时间的IFN-γ浓度均明显低于对照组（P〈0．05）。实验组在不同时间产生IL-4浓度无明显变化（P=0．400）;对照组24小时细胞培养上清中IL-4浓度高于48、72和120小时（P值分别为0．007、0．003和0．002）;实验组细胞培养24小时时IL-4浓度明显低于对照组（P=0．037）;实验组细胞培养48、72和120小时与对照组IL-4浓度差异无显著性（P〉0．05）。⑧实验组与对照组CD4＋IFN-γT细胞的比例无明显变化（P=0．767）;实验组CD4＋IL-4＋T细胞比例略高于对照组（P=0．051）;实验组CD4 IL-4＋T细胞与CD4＋IFN-γT细胞的比值明显高于对照组（P=0．011）。实验组与对照组CD8＋IFN-γT细胞的比例无明显变化（P=O．441）;实验组CD8＋IL-4＋T细胞的比例明显高于对照组（P=0．015）;实验组CD8＋ IL4＋T细胞与CD8＋IFN-γT细胞的比值明显高于对照组（P=0．038）。结论：PGE2体外抑制外周血T细胞的增殖;PGE2作用24小时即可抑制IFN-γ和儿4的产生,并且明显影响T细胞1FN-γ的高峰出现,对IFN-γ具有持续性的抑制作用,对见-4的持续性影响并不明显;PGE2使CD4＋IL-4＋T细胞与CD4＋IFN-γT细胞的比值和CD8＋IL-4＋T细胞与CD8＋IFN-γT细胞的比值增加,调节T细胞的免疫反应向Th2／T02方向发展。     

IL-23在单纯疱疹病毒Ⅱ型致病中的作用

目的 探讨IL-23在单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)致病机制中的作用.方法 应用ELISA法检测HSV病毒感染复发患者外周血IL-23、IL-12、IFN-γ、IL-14、IL-10水平,以及细胞培养液中IFN-γ水平,流式细胞仪检测记忆性CD4+T细胞表达IFN-γ的水平,同时设立健康对照组进行比较.结果 生殖器疱疹复发患者(RGH)组血清IL-23、IL-12、IFN-γ水平明显低于健康对照组,IL-14、IL-10水平明显高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.01);IL-23剂量依赖性诱导患者单个核细胞(PBMC)产生IFN-γ,并刺激记忆性CD4+T细胞表达IFN-γ.结论 IL-23等Th1型细胞因子在RGH患者体内水平低下,Th1/Th2平衡失调,机体不能有效抑制病毒,是导致病情反复的重要原因;IL-23可能在体内同样刺激T细胞产生IFN-γ,发挥抗病毒效力.     

人肺腺癌细胞总RNA电穿孔法转染的树突状细胞疫苗的体外抗肿瘤效应研究

目的探讨人肺腺癌细胞A549总RNA电穿孔法转染的树突状细胞(dendritic cell,DC)的特征及其特异性抗肿瘤免疫反应的能力。方法用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素4(rhIL-4)从血细胞分离机分离出的外周血采集物中诱导DCs产生,同时从人肺腺癌细胞A549中提取总RNA用以转染DCs,并用转染后的DCs与自体T细胞共同培养,诱导成为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)。实验分未转染DCs组,转染PBS的DCs组,转染RNA的DCs组,以流式细胞术(FCM)鉴定DCs、T细胞表型、RT-PCR证明总RNA转染效率,MTT检测T细胞增殖能力及乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定杀伤肿瘤活性,酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-12、IFN-γ分泌水平并比较各组差异。结果 1)RT-PCR证明电穿孔法可成功使A549的总RNA转染入DCs并可使DCs表达肿瘤抗原。2)RNA转染组的DCs表面标志物CD40、CD80、CCR-7、CD83、HLA-DR都呈强阳性表达,表达率明显高于PBS转染组DCs和未转染组,差异有统计学意义(P<0.05);3)流式结果显示RNA转染的DCs刺激后的T细胞表面标志物CD8比例明显上升;4)RNA转染组IL-12、IFN-γ分泌水平明显高于PBS转染组和未转染组(P<0.05);5)RNA转染组DCs可以有效刺激T淋巴细胞增殖,并且诱导肿瘤特异性CTLs产生,对A549细胞产生特异性杀伤作用。而PBS转染组与未转染组则无明显作用(P<0.05)。结论利用电转染法可成功将A549的总RNA转入DCs内并使其表达肿瘤抗原,在体外能诱导肿瘤特异性免疫反应。     

转化生长因子β1对人外周血T淋巴细胞体外增殖及活化的影响

目的:研究转化生长因子β1(TGF-β1)对人T淋巴细胞的增殖及活化的影响.方法:以MTT法检测TGF-β1对T淋巴细胞增殖的影响;流式细胞术检测TGF-β1对T淋巴细胞活化的影响及CD4+CD25+调节性T淋巴细胞的数量;ELISA法检测TGF-β1对T淋巴细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)的影响.结果:不同浓度的TGF-β1分别作用不同时间后,均可抑制T淋巴细胞的增殖,并随时间的延长、浓度的增加抑制作用增强.不同浓度的TGF-β1作用72 h,均能抑制T淋巴细胞活化,活化标志CD69表达率明显降低(P＜0.01);均能明显上调CD4+CD25+调节性T淋巴细胞的比例(P＜0.01);均能抑制T淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2(P＜0.01),且呈剂量依赖性.结论:TGF-β1可以抑制T淋巴细胞的增殖,抑制T淋巴细胞活化,上调CD4+CD25+调节性T细胞的比例,并抑制IFN-γ、IL-2的分泌.     

血必净注射液对慢性阻塞性肺疾病患者T淋巴细胞功能的影响

目的通过观察血必净对慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease。COPD）患者T淋巴细胞增殖及分泌白细胞介素-2（IL-2）、表达CD25的影响，为血必净对COPD的治疗提供理论依据。方法 采用酶联免疫吸附试验法测定血必净对T淋巴细胞分泌的细胞因子IL-2影响，采用流式细胞仪测定血必净对T淋巴细胞表达CD25影响，用四甲基偶氨唑盐（MTT）比色法观察血必净对T淋巴细胞增殖的影响。结果COPD患者T淋巴细胞生成的IL-2、表达CD25水平与对照组比较显著减低（P〈0．01），T淋巴细胞增殖反应亦明显减低（P〈0．01）；血必净和慢阻肺组，PHA刺激T淋巴细胞，T淋巴细胞生成IL-2、表达CD25的较慢阻肺组高（P〈0．01），T淋巴细胞增殖反应亦明显增加（P〈0．01）。结论COPD患者T淋巴细胞生成的IL-2、表达CD25减低，T淋巴细胞增殖反应亦减低，免疫失衡；血必净促进COPD患者T淋巴细胞分泌IL-2、表达CD25，增强T淋巴细胞增殖反应。     

慢性乙型肝炎患者CD_4~＋CD_（25）~＋调节性T细胞及部分细胞因子的变化

目的研究慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血CD4＋CD25＋调节性T细胞和血清IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和TGF-β的变化,探讨其与乙型肝炎慢性化的关系。方法选择24例CHB患者作为CHB组、8例急性乙型肝炎（AHB）患者作为AHB组,12例健康体检者作为正常对照组,流式细胞仪检测各组CD4＋CD25＋调节性T细胞的百分率,ELISA双抗体夹心法检测慢性乙型肝炎组和正常对照组上述5种细胞因子的水平。结果 CHB组CD4＋CD25＋调节性T细胞百分率均明显高于AHB组和正常对照组,差异有统计学意义（P〈0.01）。CHB组和AHB组的CD4＋CD25＋Treg百分率与血清HBV-DNA及ALT之间无相关关系（P〉0.05）。CHB组血清IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和TGF-β水平均高于正常对照组,差异有统计学意义（P〈0.01）。CHB组IL-2及IFN-γ分别与ALT正相关（P〈0.05）。结论慢性乙型肝炎患者存在免疫紊乱,CD4＋CD25＋调节性T细胞和Th1/Th2细胞的失衡与乙型肝炎慢性化有关。     

慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞PD-L1表达对T 淋巴细胞功能的抑制作用

目的 探究外周血单核细胞PD-L1 表达对慢性乙型肝炎患者T 淋巴细胞功能的影响.方法 流式细胞仪检测慢性乙型肝炎患者外周血CD14+单核细胞PD-L1 表达.以PD-L1 单克隆抗体阻断PD-L1 /PD-1 通路,MTT 法检测慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞和淋巴细胞共培养体系中抗-CD3 抗体诱导的淋巴细胞增殖反应.以HBcAg 和抗PD-L1 加入单核细胞和淋巴细胞共培养体系中,ELISA 测定培养上清IFN-γ或IL-10 水平.结果 慢性乙型肝炎患者外周血CD14+单核细胞PD-L1 表达明显上调.未加入单核细胞组淋巴细胞增殖能力明显高于加入单核细胞组,而抗PD-L1 抗体阻断组淋巴细胞增殖能力恢复至未加入单核细胞组水平.经HBcAg 刺激,与健康人相比,慢性乙型肝炎患者培养上清IFN-γ较低而IL-10 水平升高;抗PD-L1 抗体阻断后慢性乙型肝炎患者培养上清IFN-γ水平显著增高而IL-10 水平降低.结论 周单核细胞PD-L1 高表达对HBV 特异性免疫细胞功能有抑制作用.     

结核多肽特异性细胞内因子多色流式分析

目的建立能同时检测CD3、CD4、CD8表型及胞内因子IFN-γ、IL-4、TNF-α的多色胞内细胞因子染色流式细胞术;评价六条结核特异性多肽的性能。方法将结核患者组及健康对照组的PBMC,用结核特异性多肽或PMA刺激培养后,通过胞内细胞因子流式检测术,收集荧光标记阳性的淋巴细胞等;从而确定各亚群IFN-γ、IL-4、TNF-α阳性细胞的数量及百分率,得出两组间及各多肽间的性能差异。结果 1.各多肽均能刺激活化结核患者PB-MC产生IFN-γ等细胞因子,但百分率较低;IFN-γ及IL-4多数小于1%,而TNF-α则在大约10%左右。与对照组比较,IFN-γ及TNF-α的均值分别高1-12倍或1-3倍,IL-4＋/CD4＋T淋巴细胞活化率的倍数较小,而IL-4＋/CD8＋的倍数则较大;2.不同多肽刺激产生细胞内因子的比较：除多肽H256与H210活性能刺激CD4＋亚群分泌更多IFN-γ外,其余各多肽刺激产生因子的性能无统计学差异;3.对于IFN-γ及IL-4因子,各多肽均无CD4＋或CD8＋亚群差异,但各多肽均可刺激CD8＋细胞亚群产生更多TNF-α;4.双阳性（IFN-γ及TNF-α阳性）多功能T细胞分析,经多克隆刺激剂（PMA）活化后,IFN-γ＋/CD4＋及IFN-γ＋/CD8＋T细胞分别有83.0%及79.9%（均值）为双阳性细胞,而经多肽刺激后则为68.1%及65.7%（均值）。结论多色流式胞内因子染色能很好地检测特异性多功能细胞;所用的6条多肽均能活化结核特异性淋巴细胞产生细胞因子,但细胞因子的活化率较低。     

树突状细胞吞噬经光化学处理的异基因细胞后对同基因T细胞的免疫调控

本研究探讨树突状细胞（DC）吞噬经PuVA（8-methoxypsoralen plus UVA irradiation,8-甲氧基补骨脂素联合长波紫外线照射的体外光化学治疗）处理的同种异基因淋巴细胞后对于同基因T细胞的免疫调控作用。分离LEW大鼠骨髓细胞,经几4和GM—CSF共同诱导制备骨髓来源的LEW大鼠DC。分离DA大鼠脾淋巴细胞（SP）,制备经PUVA处理的DA大鼠脾淋巴细胞（PUVA—SP）,检测NJvA—sP的凋亡率。在体外将PUVA—SP或sP与受者骨髓来源的未成熟DC共同培养,检测上述处理对受者DC表面分子CD40、CD86、MHC—Ⅱ的影响。以cFsE标记PUVA—SP,通过荧光显微镜观察LEW大鼠DC吞噬DA大鼠PuVA—sP的情况。通过混合淋巴细胞培养（MLR）,检测吞噬DA大鼠PUVA—SP的LEW大鼠DC（PUVA—sPDC）对LEW大鼠T细胞的刺激作用,同时检测MLR培养上清中细胞因子1L-4、IL-10、IL-2、IFN-1,的浓度。结果表明：PUVA处理能够在24小时内诱导62．87％的DA大鼠脾淋巴细胞发生早期凋亡。LEW大鼠DC与DA大鼠PUVA—SP共培养后,可有效吞噬PUVA—SP。LEW大鼠DC与DA大鼠sP混合培养后,其表面分子MHc-Ⅱ、CD40以及CD86的表达阳性率分别为65．6％、45．6％和36．5％,明显高于未经处理的受者DC组27．7％、22．9％和13．0％（P〈0．01）;而DC与PUVA—SP混合培养后,其表面分子MHc—Ⅱ、CD40及cD86的表达仍保持较低的水平,分别为25．7％、21．0％和13．4％,与未经任何处理的对照组DC相当（P〉0．05）,而远远低于LPS刺激后的成熟DC（82．3％、71．7％和63．2％）（P〈0．01）。DA大鼠SP共培养后的LEW大鼠DC可以刺激LEW大鼠T细胞显著增殖,刺激指数在加载DC数量为2×10^3、10×10^3、20×10^3组分别为1．7546、3．9798和5．0220,而吞噬DA大鼠PUVA—SP的LEW大鼠DC则诱导了T淋巴细胞低反应性,刺激指数分别为1．0120、1．1518和1．4093,二者差异有统计学意义（P〈0．01）。此外,与SPDc相比,PUVA—SPDC明显抑制了T细胞IFN-γ的分泌（140．17±2．28VS37．67±1．76）（P〈0．01）,刺激了IL--10（33．11±1．82VS69．58±1．83）（P〈0．01）、IL-4的分泌（11．11±1．07VS23．83±0．73）（P〈0．01）,但对IL-2的分泌没有抑制作用（428．18±4．55VS423．86±5．39）（p〉0．05）。结论：PUVA-sP DC能够诱导大鼠T细胞对异基因抗原的免疫低反应,还可在体外诱导LEW大鼠T淋巴细胞由Th1向Th2免疫偏移。     

不同质量浓度粒巨噬细胞集落刺激因子对Lewis大鼠骨髓源性树突状细胞诱导分化的影响

背景:体内成熟和不成熟树突状细胞(dendritic cells,DC)数景极少,仅占外周血单核细胞的1%,占脾细胞的0.2%～0.5%,几乎不能直接从体内分离出大量的纯化的DC,要获得足够的DC,只有依靠体外培养增殖.目的:以不同剂量粒巨噬细胞集落刺激因子诱导分化获得大鼠骨髓源性DC,拟建立合适的大鼠骨髓源性未成熟DC的培养方法.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-06/2008-05在苏州大学附属第一医院临床免疫学实验室和附属儿童医院骨科实验室完成.材料:雄性SPF级Lewis大鼠用于培养骨髓源性DC,雄性SPF级Brown Norway大鼠用于混合淋巴细胞反应实验.方法:采用密度梯度离心法从Lewis大鼠股骨和胫骨获取骨髓源性单个核细胞,分别以2.5,5,10,20 μg/L粒巨噬细胞集落刺激因子和5μg/L白细胞介素4诱导分化获得大鼠骨髓源性DC,采用黏附法纯化DC.主要观察指标:以流式细胞仪分析DC表型.混合淋巴细胞反应中以Lewis大鼠DC作为刺激细胞,以Brown Norway大鼠脾脏T细胞作为反应细胞,检测其刺激同种T细胞增殖能力.ELISA测定分泌细胞上清液中白细胞介素12、干扰素水平.结果:随粒巨噬细胞集落刺激因子质量浓度的增高,诱导的细胞获得率逐渐升高,但DC比例逐渐下降.CD86、MHC-Ⅱ表达阳性率随培养时间延长逐渐增加.培养第5,7天,DC不能有效刺激同种异体T细胞的增殖反应,培养第13天,DC刺激同种异体T细胞的增殖反应能力明显增强(P＜0.01).培养7 d以后,DC上清液中自细胞介素12水平明显增高(P＜0.01),脂多糖刺激以后升高更加明显(P＜0.01).脂多糖刺激后DC表型MHCⅡ、CD86表达明显增加,白细胞介素12分泌增加,刺激同种T细胞增殖能力轻度增强.结论:5 μg/L粒巨噬细胞集落刺激因子为诱导大鼠骨髓源性未成熟DC的最佳剂量,培养9 d可以获得足够数量和纯度的未成熟DC.     

Notch配体Delta-1ike1对小鼠骨髓细胞来源的树突状细胞分化和抗原呈递功能的影响

本研究探讨Notch配体Delta—likel（Dil1）对小鼠骨髓细胞来源的树突状细胞（dendriticcell,DC）分化及其抗原呈递功能的影响。在GM—CSF和IL4存在条件下,用OP9-Dil1和OPt）．GFP细胞分别与小鼠骨髓细胞共培养8天,经肿瘤抗原刺激成熟。用流式细胞仪检测DC表面MHCII、CD80和CD86的表达情况,ELISA法检测肿瘤抗原刺激后DC培养上清细胞因子IL-12和IL110的水平,通过混合T淋巴细胞反应观察DC对T细胞的促增殖能力。结果表明：与GFP组相比,Dll1组的小鼠骨髓来源的树突状细胞明显增多（P〈0．05）。肿瘤抗原刺激后,Dll1组DC表面MHCII、CD80和CD86表达量更高。DC分泌的IL-12水平显著高于对照组（P〈0．05）,而IL-10的水平显著低于对照组（P〈0．01）。Dll1组DC具有更强的促T细胞增殖活性。结论：OP9-Dll1促进小鼠骨髓细胞向DC分化并增强其抗原呈递功能。     

IL-2、IL-7和IL-15联合对T细胞的体外扩增效应

为了建立一种快速有效的体外T细胞扩增方法,本研究比较了不同培养条件对T细胞增殖及其功能和特性的影响。取外周血T细胞,用自体的树突状细胞（DC）和EB病毒转化的B细胞进行周期性刺激,用细胞增殖试验、PI和AnnexinV双标记流式细胞术、Cr释放测定及ELISPOT试验分别测定不同培养条件下细胞的增殖程度、IFN-γ分泌细胞的频率、抗原特异性T细胞的杀伤活力、细胞的凋亡状态和分化能力。结果显示：T细胞在周期性刺激后,用CD3/28微珠的短期扩增效应最好,但多轮刺激后联合应用IL-2,IL-7和IL-15对细胞的扩增最强。Cr释放试验表明,CD3/28微珠扩增的T细胞不具有杀伤活力,高浓度IL-2诱导的T细胞杀伤活性最强,其次为联合应用IL-2,IL-7和IL-15。ELISPOT显示不同培养条件诱导出的分泌IFN-γ的T细胞频率从高到低依此为高浓度IL-2〉联合应用IL-2,IL-7和Il-15〉低浓度的IL-2〉CD3/28微珠。细胞表型分析显示高浓度IL-2和联合应用IL-2,IL-7和Il-15扩增的细胞含有较高比例的CD3＋CD8＋T细胞。对细胞的凋亡测定表明联合应用IL-2,IL-7和IL-15获得的T细胞的存活率最高,处于凋亡早期的细胞比例最低。细胞增殖试验显示联合应用IL-2,IL-7和IL-15扩增的细胞分化能力最强。结论：本研究建立了一种快速有效地体外扩增T细胞的方法,其中联合应用IL-2,IL-7和IL-15对T细胞的扩增最显著,获得的T细胞存活率最高,分化能力最强,该细胞同时也含有较高频率的IFN-γ分泌细胞且表现出较强的杀伤活力。     

Dendritic Cells Loaded with Ultrasound-Ablated Tumour Induce in vivo Specific Antitumour Immune Responses

Previous studies have shown that high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation can induce a local inflammation with marked infiltration of dendritic cells (DCs). The purpose of this study was to investigate whether DCs could capture and present activating signals delivered by necrotic tumour cells that remain in situ after HIFU, thus initiating specific antitumour immunity. Tumour debris was derived from a mouse H22 tumour model after HIFU ablation. Bone marrow-derived DCs were loaded with HIFU-treated tumour, tumour lysate and mouse serum. Syngeneic naïve C57BL/6J mice were immunised with three loaded DCs followed by a subsequent H22 tumour challenge. Tumour size and survival were then recorded in each vaccinated mouse. The results showed that both HIFU-ablated tumour and tumour lysate could significantly increase the number of mature DCs and the secretion of IL-12 and IFN-γ (p < 0.001). The proliferation of splenic lymphocytes co-incubated with the loaded-DCs was significantly higher in both HIFU-ablated tumour and tumour lysate groups (p < 0.01). Cytotoxocity and TNF-α and IFN-γ secretion of cytotoxic T lymphocytes against H22 cells were significantly higher in HIFU-ablated tumour group than that in tumour lysate group (p < 0.01). After the H22 tumour challenge, a significant decrease of tumour volume was observed in HIFU-ablated tumour group (p < 0.01). However, there was no statistical difference of long-term survival rates among three groups (p > 0.05). It is concluded that DCs can be activated by HIFU-ablated tumour debris and, thus, initiate host specific antitumour immune response after HIFU therapy. (E-mail: mfengwu@yahoo.com)     

白介素21对树突状细胞诱导的CTL抗白血病作用的影响

本研究探讨白介素21（IL-21）对树突状细胞（DC）诱导的CTL抗白血病的体外作用。以不同细胞因子诱导培养急性白血病（AL）患者缓解期外周血单个核细胞产生DC，自体AL细胞RNA作为抗原负载DC，与自体T淋巴细胞共培养诱导白血病特异性CTL产生；用LDH释放法检测CTL杀伤自体AL细胞的作用，并检测CTL产生IFN-γ和TNF-α的变化。实验共分2组：实验组，在DC—CTL共培养过程中加用IL-21（200ng／ml）；对照组，不加IL-21。同时对IL-21单独作用培养后成熟DC，检测其表面抗原表达变化以及诱导同种混合淋巴细胞反应能力。结果表明：对照组和实验组的CTL产生率分别为：（56．73±10．21）％，（73．43±18．01）％（P〈0．01）；培养上清中IFN-γ和TNF-α分别为：（154．91±67．20）ng／L，（310．62±141．15）ng／L（p〈0．01）和（8．77±5．09）μg/L，（15．25±6．56）μg／L（p〈0．01）。在效靶比为20：1时，两组对自体AL细胞的杀伤作用分别为（50．22±5．07）％，（75．38±9．47）％（P〈0．01）；IL-21作用后的成熟DC的CD1a、CD83、CD86、CD80和HLA—DR表达没有明显变化；诱导同种混合淋巴细胞反应能力亦没有明显不同。结论：IL-21可促进DC诱导的CTL增殖、增加IFN--γ和TNF—α产生从而增强其抗白血病作用；IL-21对成熟DC表面抗原表达及其免疫功能无明显影响；提示IL-21在白血病免疫治疗中发挥一定的作用，具有潜在的临床应用价值。     

Induction of interleukin 10-producing, nonproliferating CD4(+) T cells with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells

The functional properties of dendritic cells (DCs) are strictly dependent on their maturational state. To analyze the influence of the maturational state of DCs on priming and differentiation of T cells, immature CD83(-) and mature CD83(+) human DCs were used for stimulation of naive, allogeneic CD4(+) T cells. Repetitive stimulation with mature DCs resulted in a strong expansion of alloreactive T cells and the exclusive development of T helper type 1 (Th1) cells. In contrast, after repetitive stimulation with immature DCs the alloreactive T cells showed an irreversibly inhibited proliferation that could not be restored by restimulation with mature DCs or peripheral blood mononuclear cells, or by the addition of interleukin (IL)-2. Only stimulation of T cells with mature DCs resulted in an upregulation of CD154, CD69, and CD70, whereas T cells activated with immature DCs showed an early upregulation of the negative regulator cytotoxic T lymphocyte-associated molecule 4 (CTLA-4). These T cells lost their ability to produce interferon gamma, IL-2, or IL-4 after several stimulations with immature DCs and differentiated into nonproliferating, IL-10-producing T cells. Furthermore, in coculture experiments these T cells inhibited the antigen-driven proliferation of Th1 cells in a contact- and dose-dependent, but antigen-nonspecific manner. These data show that immature and mature DCs induce different types of T cell responses: inflammatory Th1 cells are induced by mature DCs, and IL-10-producing T cell regulatory 1-like cells by immature DCs.     

HBcAg和HBeAg对人树突状细胞成熟和功能的影响

目的观察乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen,HBcAg)和乙型肝炎e抗原(hepatits B e antigen,HBeAg)对人树突状细胞的影响。方法分离20例健康者外周抗凝血淋巴细胞,将贴壁细胞加重组人白细胞介素4和重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子培养至第7天,将树突状细胞分为HBcAg组、HBeAg组和树突状细胞对照组,分别加入HBcAg、HBeAg对树突状细胞刺激培养至第10天,检测刺激培养后细胞表型与分泌的细胞因子及其对树突状细胞体外诱导的淋巴细胞增殖效应和淋巴细胞毒活性的影响。结果 HBcAg组、HBeAg组树突状细胞表面分子(CD83,CD86,HLA-ABC)水平和分泌干扰素-γ、白细胞介素-12p70水平、体外诱导淋巴细胞增殖效应及淋巴细胞毒活性与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);HBcAg组增强树突状细胞的分子表达、分泌白细胞介素-12p70及体外诱导淋巴细胞毒活性与HBeAg组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 HBcAg和HBeAg可增加人树突状细胞表达成熟活化的分子、分泌细胞因子,增强树突状细胞体外诱导淋巴细胞增殖效应及淋巴细胞毒活性。     

Cotransfection of Poly(I: C) and siRNA of IL-10 into fusions of dendritic and glioma cells enhances antitumor T helper type 1 induction in patients with glioma

Apart from generating T-helper (Th) effector responses, dendritic cells (DCs) are capable of initiating tolerance against the inciting antigens. Therefore, successful DC-based immunotherapy against malignant tumors requires an additional strategy to activate antigen-processing DCs. We studied the antitumor immune responses conferred by fusions of DCs and glioma cells in vitro. Fusion cells (FCs) were stimulated with polyriboinosinic polyribocytidylic acid [Poly(I:C)] and/or small interference RNA (siRNA) of IL-10 (IL-10-siRNA). Increased IFN-β expression induced by Poly(I:C) transfection was accompanied by enhanced production of IL-10 and IL-12p70 in the FCs. We also found that the ability of Poly(I:C)-transfected FCs to produce IL-12p70, but not IFN-β, was preserved when endogenous IL-10 was suppressed by IL-10-siRNA. To analyze the antigen-presenting function further, DCs, glioma cells, and peripheral lymphocytes were established from patients newly diagnosed with glioma. In this experiment, peripheral lymphocytes were stimulated with autologous FCs and restimulated with autologous glioma cells. CD4T cells isolated from the stimulated lymphocytes were subjected to the ELISPOT and WST-1 assays, which revealed that the IL-10-siRNA/Poly(I:C)-cotransfected FCs elicit an efficient tumor-specific Th1 response. These findings support the relevance of using Poly(I:C) and IL-10-siRNA in clinical immunotherapy protocols with an FC-based vaccine for patients with malignant glioma as a means of promoting Th1-induced tumor antigen presentation.