胰岛素样生长因子Ⅰ抑制氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡的体外试验

目的：胰岛素样生长因子Ⅰ作为重要的促细胞生长因子之一，其对内皮细胞凋亡影响的报道不多。实验拟验证和探讨胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的抑制作用及可能机制。 方法：实验于2006—12／2007—07在华中科技大学同济医学院协和医院心血管疾病研究所完成。①实验材料及分组处理：取人新鲜脐带（产妇或家属签署知情同意书）分离培养人脐静脉内皮细胞，分为：胰岛素样生长因子Ⅰ组（1×10^-9mmol／L）、氧化型低密度脂蛋白（200mg／L）＋胰岛素样生长因子Ⅰ组（1×10^-9mmol／L）、氧化型低密度脂蛋白（200mg／L）组、正常对照组。分别在细胞培养24h后加入。②实验评估：采用四甲基偶氮唑盐法测定细胞活力；DAPI细胞核荧光染色法观察细胞凋亡的形态学变化及细胞凋亡率的测定；并进行内皮细胞caspase-3活性的检测。 结果：①氧化型低密度脂蛋白可明显抑制人脐静脉内皮细胞增殖，胰岛素样生长因子Ⅰ与氧化型低密度脂蛋白共同加入后，细胞增殖率明显上升（P〈0．05）。②氧化型低密度脂蛋白可诱导人脐静脉内皮细胞发生凋亡，而加入胰岛素样生长因子I刺激后细胞凋亡率降低（P〈0．05）。③caspase-3活性检测表明与对照组相比，氧化型低密度脂蛋白能明显上调caspase-3的表达，而胰岛素样生长因子Ⅰ＋氧化型低密度脂蛋白组caspase-3活性则降低（P〈0．05）。 结论：胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡具有抑制作用，可能与其下调caspase-3蛋白表达有关。     

高浓度低密度脂蛋白对血管内皮细胞NADPH氧化酶4 mRNA水平、活性氧产生及细胞凋亡的影响

目的:低密度脂蛋白进入血管内皮细胞后可刺激细胞产生活性氧,在内皮细胞的生长与损伤过程中起关键作用.实验拟进一步观察高浓度低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞活性氧、NADPH氧化酶4 mRNA 水平和凋亡的影响.方法:实验于2004-12/2006-02在卫生部老年医学重点实验室完成.①实验材料:脐带来自卫生部北京医院产科,产妇或家属签署知情同意书;低密度脂蛋白由卫生部北京医院老年医学研究所生化室经过超速离心提取.②实验过程及分组:分离人脐静脉内皮细胞.先以不同浓度的低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞 24 h以选取最佳的浓度,观察NADPH氧化酶4表达,分为:不加低密度脂蛋白的对照组;0.8 g/L 低密度脂蛋白组;1.6 g /L 低密度脂蛋白组;2.4 g/L低密度脂蛋白组.再以1.6 g/L 低密度脂蛋白浓度处理人脐静脉内皮细胞不同的时间以选取最佳的处理时间观察NADPH氧化酶4表达,分为:不加低密度脂蛋白的对照组,12 h处理组,24 h处理组,48 h处理组.以最佳浓度和最佳时间处理人脐静脉内皮细胞,并观察其NADPH氧化酶4表达、活性氧生成和凋亡.③实验评估:反转录-聚合酶链反应检测人脐静脉内皮细胞中NADPH氧化酶的表达;流式细胞仪检测胞内活性氧生成量和细胞凋亡率,Hoechst 33342染色分析细胞凋亡.结果:①1.6 g/L低密度脂蛋白处理24 h后人脐静脉内皮细胞内活性氧生成量高于对照组(P＜0.05).②1.6 g/L低密度脂蛋白处理24 h组细胞凋亡也比对照组明显增加(P＜.05).③用反转录-聚合酶链反应检测不同浓度(0.8,1.6,2.4 g/L)低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞 24 h和以1.6 g/L低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞不同时间(12,24和48 h)时NADPH氧化酶4 mRNA水平变化,结果显示与不加低密度脂蛋白的对照组相比,各组NADPH氧化酶4 mRNA表达均增强.结论:低密度脂蛋白上调人脐静脉内皮细胞内NADPH氧化酶4 mRNA表达,并促进细胞内活性氧生成和细胞凋亡.     

重组人胰岛素样生长因子Ⅰ对成骨细胞的影响

背景:人胰岛素样生长因子Ⅰ在成骨细胞中含量丰富,与骨密度有密切关系.目的:观察重组人胰岛素样生长因子Ⅰ对体外培养大鼠成骨细胞的增殖、凋亡及碱性磷酸酶合成的影响.方法:不同质量浓度重组人胰岛素样生长因子Ⅰ刺激体外培养的大鼠成骨细胞,噻唑蓝法测定活细胞数量;肿瘤坏死因子α单独或与重组人胰岛素样生长因子Ⅰ共同刺激成骨细胞,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率,采用对硝基酚磷酸盐法测定细胞裂解液中碱性磷酸酶活性.结果与结论:与对照组相比,一定剂量的重组人胰岛素样生长因子Ⅰ能明显增加大鼠成骨细胞数量(P < 0.05),在质量浓度为0.1~100 μg/L时,成骨细胞数量的增加与质量浓度呈正相关;肿瘤坏死因子α在0.1~100 μg/L范围内呈剂量依赖性地促进成骨细胞凋亡(P < 0.05),并使S期细胞减少(P < 0.05),而重组人胰岛素样生长因子Ⅰ能抑制肿瘤坏死因子α对成骨细胞的促凋亡作用(P < 0.05);与对照组相比,重组人胰岛素样生长因子Ⅰ刺激的成骨细胞碱性磷酸酶的活性明显增高(P < 0.05).重组人胰岛素样生长因子Ⅰ对大鼠成骨细胞有明显的促增殖作用,且能明显抑制肿瘤坏死因子α诱导的大鼠成骨细胞凋亡,提示增加成骨细胞数量可能是重组人胰岛素样生长因子Ⅰ促进骨形成的机制之一;重组人胰岛素样生长因子Ⅰ能促进大鼠成骨细胞碱性磷酸酶的合成,提示重组人胰岛素样生长因子Ⅰ有可能促进骨基质的合成和钙化.     

人脐静脉内皮细胞黏附分子1表达与活血中药对单核-血管内皮细胞黏附性能的干预

目的:观察活血注射液对氧化型低密度脂蛋白损伤人脐静脉内皮细胞后血管细胞黏附分子1的表达及与人单核细胞黏附的影响,探讨中药复方制剂防治动脉粥样硬化的作用机制。方法:实验于2004-03/12在北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室完成。①实验材料:活血注射液由丹参、川芎、红花、赤芍组成,比例为丹参2,其余药物为1,含生药2000g/L。新生儿脐带(由中日友好医院妇产科提供,产妇及其家属知情同意,实验符合赫尔辛基宣言中的伦理学标准)。②实验过程:以培养人脐静脉内皮细胞作为靶细胞,在内皮细胞培养基中加入氧化型低密度脂蛋白制备细胞损伤模型。③实验评估:采用蛋白定量法检测人脐静脉内皮细胞与单核细胞的黏附率[将人脐静脉内皮细胞,用M199培养液(对照组)和含不同浓度(10,20,40ml/L)的活血注射液、氧化型低密度脂蛋白等实验因子的培养液(实验组)温育12,24h,再加含单核细胞的M199培养液];反转录聚合酶链反应检测人脐静脉内皮细胞的血管细胞黏附分子1的mRNA表达;用流式细胞仪测定人脐静脉内皮细胞的血管细胞黏附分子1的蛋白表达[(将人脐静脉内皮细胞,分为对照组、氧化型低密度脂蛋白组与氧化型低密度脂蛋白 活血注射液(终浓度分别为10,20,40ml/L)组,分别作用12,24h)。结果:①人单核细胞与人脐静脉内皮细胞的黏附率在氧化型低密度脂蛋白作用12,24h后升高,均明显高于对照组(P<0.01),不同剂量活血注射液可明显抑制人单核细胞与人脐静脉内皮细胞的黏附率,与氧化型低密度脂蛋白组相比差异均有显着性(P<0.01),这种作用随着剂量的增加而增强。②氧化型低密度脂蛋白能明显上调人脐静脉内皮细胞的血管细胞黏附分子1的mRNA和蛋白表达水平,而不同剂量活血注射液能显著下调血管细胞黏附分子1的mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05,P<0.01),与氧化型低密度脂蛋白组相比差异均有显着性(P<0.05,P<0.01),这种作用随着剂量的增加而增强。结论:氧化型低密度脂蛋白促进内皮细胞的血管细胞黏附分子1表达,活血注射液能通过下调血管细胞黏附分子1的表达抑制单核-血管内皮细胞黏附,保护人内皮细胞免受氧化型低密度脂蛋白所致毒性损伤,从而减少或抑制动脉粥样硬化的形成。     

促红细胞生成素预防内皮细胞凋亡时对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3亚家族的影响

目的 探讨重组人促红细胞生成素(rhEPO)在预防氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡过程中对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspases-3)亚家族的影响.方法 体外培养HUVECs,将细胞随机分组,分别加入caspase-3抑制剂DEVD-CHO、caspase-8抑制剂z-IETD-fmk、caspase-9抑制剂z-LEHD-fmk各25 μmol/L预孵育24 h后,再加入100 mg/L ox-LDL处理48 h.平行实验中,加入6.25、25.00、100.00 kU/L的rhEPO预处理HUVECs 24 h,再加入100 mg/L ox-LDL处理48 h.用比色法检测caspase-3、caspase-8、caspase-9活性;用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测HUVECs活性;用流式细胞术检测caspase-3阳性表达率和HUVECs凋亡率.结果 caspase-3抑制剂、caspase-8抑制剂分别降低各自对应的caspase活性,caspase-9抑制剂可同时降低caspase-3、caspase-9活性(P均<0.05).加入rhEPO预处理后,ox-LDL诱导内皮细胞caspase-3、caspase-9活性及caspase-3阳性表达率降低,且呈剂量依赖性(P均<0.05),而caspase-8活性无明显变化,HUVECs的细胞凋亡率也呈剂量依赖性降低(P均<0.05).结论 rhEPO可呈剂量依赖性抑制ox-LDL诱导HUVECs 凋亡时caspase-3、caspase-9活性,提示ox-LDL诱导HUVECs 凋亡信号通路涉及caspase-3、caspase-9,而与caspase-8无关.     

胰岛素样生长因子1及血小板源性生长因子对人退变髓核细胞生物学活性的影响

背景:有研究表明胰岛素样生长因子1和血小板源性生长因子可抑制人椎间盘细胞凋亡.目的:观察在体外培养条件下胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子对人退变髓核细胞生物学活性的影响.方法:体外单层培养人退变髓核细胞,通过免疫组织化学鉴定细胞.对传3代人退变髓核细胞采用分别不同生长因子干预,实验分4组:胰岛素样生长因子1组,血小板源性生长因子组,胰岛素样生长因子1+血小板源性生长因子组及对照组.结果与结论:胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子均可促进细胞增殖,促进细胞合成Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖,其中胰岛素样生长因子1促Ⅱ型胶原合成作用强于血小板源性生长因子(P < 0.05),血小板源性生长因子促蛋白聚糖合成作用强于胰岛素样生长因子1(P < 0.05).胰岛素样生长因子1促进细胞合成Ⅰ型胶原,血小板源性生长因子抑制细胞合成Ⅰ型胶原.结果证实,胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子均可通过促进细胞增殖、促进细胞合成Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖,从而提高人退变髓核细胞的生物学活性.     

胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子、转化生长因子β1对人退变纤维环细胞生物学活性的影响

背景:生长因子可调整椎间盘细胞的增殖、分化及基质代谢,用于椎间盘退变的生物学治疗,既往的研究偏重于成骨性生长因子对髓核细胞的作用,对纤维环细胞的研究相对较少.目的:观察体外培养条件下胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子、转化生长因子β1对人退变纤维环细胞生物学活性的影响.设计、时间及地点:对照观察实验,于2007-11/2008-12在解放军南京军区福州总医院完成.材料:腰椎间盘手术患者的纤维环组织.方法:结合酶消化法和组织块培养法,体外单层培养人退变纤维环原代细胞.传代后通过免疫组织化学染色鉴定细胞.对传3代细胞分别采用不同生长因子干预,分为100 μg/胰岛素样生长因子1组、10 μg/L血小板源性生长因子组、10 μg/转化生长因子β1组、100 μg/L胰岛素样生长因子1+10 μg/L血小板源性生长因子组、100 μg/L胰岛素样生长因子1+10 pg/L转化生长因子β1组、10μg/L血小板源性生长因子+10 μg/L转化生长因子β1组、100 μg/L胰岛素样生长因子1+10 μg/L血小板源性生长因子+10 μg/L转化生长因子β1组,以不加生长因子为对照组.主要观察指标:免疫组织化学染色观察传3代细胞.干预3,6 d后,采用MTT法测定传3代细胞增殖,ELISA法测定细胞培养上清液中Ⅰ、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖质量浓度.结果:传3代细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性.胰岛索样生长因子1促进入退变纤维环细胞增殖,轻度抑制细胞合成Ⅰ型胶原,促进合成Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖,促Ⅱ型胶原合成作用轻度强于转化生长因子β1.血小板源性生长因子促进细胞增殖,作用强于胰岛素样生长因子1,其抑制细胞合成Ⅰ型胶原,轻度促进合成Ⅱ型胶原,无促合成聚集蛋白聚糖作用.转化生长因子β1抑制细胞增殖,促进合成Ⅰ、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖,促聚集蛋白聚糖合成作用强于胰岛素样生长因子1.多种因子联合作用较单种未见明显优势,未能呈现协同效应.结论:胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子、转化生长因子β1明显改变人退变纤维环细胞的生物学活性,可应用于对人类椎间盘退变的生物学治疗.     

尼莫地平对氧化低密度脂蛋白诱导人血管内皮细胞凋亡的影响

目的研究尼莫地平对不同浓度氧化低密度脂蛋白诱导的人血管内皮细胞凋亡的影响。方法在人脐静脉内皮细胞株ECV304培养基中加入不同浓度氧化低密度脂蛋白和尼莫地平（1.2μg/ml）,作用6-24 h。透射电镜观察内皮细胞ECV304的凋亡情况;流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率;用激光共聚焦显微镜检测钙离子浓度。结果不同浓度氧化低密度脂蛋白能明显诱导培养的内皮细胞发生凋亡,尼莫地平可显著降低氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡率（P〈0.01）。结论尼莫地平对氧化低密度脂蛋白诱导的人血管内皮细胞凋亡具有保护作用。     

胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ对高糖条件下成骨细胞的影响

目的观察胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ在高浓度葡萄糖条件下对成骨细胞增殖和矿化的影响,探讨胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ对糖尿病性骨质疏松和骨质减少治疗的作用.方法实验于2004-07/2005-09在第四军医大学唐都医院感染病中心完成.健康新生24 h内的SD仔鼠3只.①采用组织块培养法分离培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞,分别给以不同葡萄糖浓度的培养液,即正常浓度葡萄糖(5.5 mmol/L)和高浓度葡萄糖(25.5 mmol/L).在高糖条件下分别加入胰岛素(10-6 mmol/L)和胰岛素样生长因子Ⅰ(10-7 mmol/L).所有实验分为四组正常浓度葡萄糖组,高浓度葡萄糖组,高浓度葡萄糖+胰岛素样生长因子Ⅰ组,高浓度葡萄糖+胰岛素组.②MTT法检测不同培养条件对成骨细胞增殖的影响.③原子能吸收法检测钙离子吸收量和体外诱导骨结节的形成来评价成骨细胞的分化.结果①MTT比色法显示连续培养5 d,不同组吸光度值均成比例增加,与正常浓度葡萄糖相比,高浓度葡萄糖显著促进细胞的增殖,细胞生长率显著高于其他组.胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ下调了高浓度葡萄糖导致的细胞增殖,除第1天以外,该两组细胞的生长率与正常浓度葡萄糖组的结果相似.②从第17天到第32天,各组的钙吸收量显著增加,但高糖组的钙吸收量明显低于其他组.胰岛素样生长因子Ⅰ组的钙吸收量高于胰岛素组,与正常浓度葡萄糖组的钙吸收量相比没有明显差别(P＞0.05).在第32天,高糖组的骨结节数明显低于其他组,而且多数细胞仍处于增殖阶段,钙化的细胞很少.胰岛素样生长因子Ⅰ组的骨结节数多于胰岛素组(P＜0.05),少于正常葡萄糖组(P＞0.05).结论高浓度葡萄糖刺激成骨细胞增殖但抑制细胞矿化可能直接导致了糖尿病性骨病的病理改变;胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ对其矿化的促进作用可能是治疗糖尿病性骨质减少和骨质疏松的机制之一.     

E1A激活基因细胞阻遏子蛋白在人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用

背景:研究内皮细胞凋亡的机制及其与动脉硬化形成的关系将为动脉粥样硬化的防治提供新的思路.而E1A激活基因的细胞阻遏子蛋白在内皮细胞凋亡中的作用,目前尚未见报道.目的:探讨E1A激活基因的细胞阻遏子蛋白在去血清诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用及其调控机制.时间及地点:实验于2007-10/2008-12在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所实验室完成.材料:人脐静脉内皮细胞,Phoenix amphotropic 293细胞,pLNCX-CREG和pLNCX-GFP反转录病毒真核表达载体.方法:采用持续去血清培养的方法诱导内皮细胞凋亡,用TUNEL染色和Western blot检测去血清饥饿24,48,72 h后各实验组细胞中cleave-caspase3表达;用pLNCX-CREG和pLNCX-GFP反转录病毒真核表达载体转染人脐静脉内皮细胞,并筛选稳定表达的细胞克隆;应用Western blot检测E1A激活基因的细胞阻遏子蛋白的表达,并进一步应用流式双荧光染色分析E1A激活基因的细胞阻遏子蛋白过表达在去血清诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用.主要观察指标:cleave-caspase3表达量,人脐静脉内皮细胞凋亡率.结果:成功构建了E1A激活基因细胞阻遏子过表达的人脐静脉内皮细胞模型,证实内皮细胞E1A激活基因细胞阻遏子的表达随凋亡的增加而增加,E1A激活基因细胞阻遏子过表达的人脐静脉内皮细胞去血清饥饿后凋亡较对照组明显减少.结论:E1A激活基因细胞阻遏子过表达抑制了去血清诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡,机制可能与调控P13K蛋白表达有关.     

线粒体凋亡途经参与热应激后人脐静脉内皮细胞凋亡的研究

目的 观察细胞色素C、caspase-9和caspase-3在热应激后人脐静脉内皮细胞的表达及相互关系,阐明热应激后人脐静脉内皮细胞凋亡的信号转导机制,探讨重症中暑所致血管内皮损害的发病机理.方法 建立人脐静脉内皮细胞热应激模型,对照组将细胞置于标准37℃、5％ CO2细胞培养箱,热应激组将细胞置于39℃、41℃、43℃细胞培养箱中进行热应激2h,热应激后继续在细胞培养箱孵育24h.电子显微镜观察人脐静脉内皮细胞(37℃、43℃)线粒体改变,应用Annexin V-FITC/PI双染色方法检测不同温度热应激后细胞凋亡率、Western blot检测细胞色素C、caspase-9、caspase-3蛋白表达.结果 电镜观察对照组(37℃)HUVEC细胞线粒体结构基本正常.热应激后(43℃)HUVEC细胞线粒体肿胀并出现结构改变;与对照组比较,39℃热应激对内皮细胞凋亡无明显影响(P＞0.05),随着热应激温度的增加人脐静脉内皮细胞凋亡明显增多(41℃17.8％,4 3℃25.6％)并且细胞色素C、caspase-9、caspase-3蛋白表达明显增加(P＜0.05).结论 线粒体通路的激活参与了热应激后人脐静脉内皮细胞凋亡的调控;血管内皮细胞凋亡可能与重症中暑的发病存在相关性.     

转化生长因子β 1对长波紫外线照射皮肤成纤维细胞胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子表达的影响

背景:研究认为衰老和光老化状态下生长因子的表达不一定一致.生长因子与皮肤老化的关系越来越受到重视.目的:验证转化生长因子β 1对长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞胰岛素样生长因子1、角质细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子表达的影响.设计、时间及地点:以体外培养细胞为观察对象,随机重复实验,于2006-07/2008-03在解放军第四军医大学全军整形外科研究所进行.材料:成纤维细胞来自解放军第四军医大学整形外科门诊患者包皮,采用组织块法培养获得.方法:通过酶联免疫法(ELISA)使用不同剂量长波紫外线(0,5,10,20 J/cm2)照射体外培养的皮肤成纤维细胞,测定上清液中胰岛素样生长因了 1、角质形成细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子的质量浓度;以长波紫外线15J/cm2为照射剂量,选择不同剂量转化生长因子β 1即小剂量组(0.1 μ g/L)、中剂量组(1 μ g/L)、大剂量组(10 μ g/L)对培养的皮肤成纤维细胞进行干预.主要观察指标:不同剂量长波紫外线照射、以及转化生长因子β 1处理后皮肤成纤维细胞胰岛素样生长因子1、血管内皮细胞生长因子、角质形成细胞生长因子的表达.结果:长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞导致胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子分泌水平下降.血管内皮细胞生长因子分泌升高:转化生长因子β 1处理后,转化生长因子B 1剂量依赖性地提高长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞分泌的3种细胞因子的水平.转化生长因子β 1大剂量组胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子含量明显高于长波紫外线照射组(P< 0.01).结论:长波紫外线照射抑制体外培养成纤维细胞中胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子表达,促进血管内皮细胞生长因子表达.转化生长因β 1可提高长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞分泌胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子3种细胞因子的水平,有利于真皮内结构的恢复和重建.     

胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子7与毛乳头细胞的生长

背景:毛乳头细胞凝集性生长与其诱导毛发生长有关.毛乳头细胞分泌的多种生长因子如胰岛素样生长因子1、成纤维细胞生长因子7可能对毛乳头细胞生长具有重要的影响.目的:观察正常人毛乳头细胞的增长与生长方式与胰岛素样生长因子1、成纤维细胞生长因子7的相关性.方法:采用二步酶消化法分离培养毛乳头细胞,免疫组化法和流式细胞仪分别检测两种生长因子在凝集性与非凝集性生长的毛乳头细胞中的表达,MTT法检测2,5～100 μg/L质量浓度胰岛素样生长因子1对人毛乳头细胞增殖的影响.结果与结论:胰岛素样生长因子1与成纤维细胞生长因子7均表达于细胞胞浆,但表达量随时间减弱,其中第3代明显比第9代毛乳头细胞中成纤维细胞生长因子7的表达强烈(P＜0.05).与对照组相比,不同质量浓度胰岛素样生长因子1均有明显促进毛乳头细胞增殖的作用(P＜0.05),其中以2.5 μg/L最为显著.提示毛乳头细胞的凝集性生长状态的改变可能与胰岛素样生长因子1、成纤维细胞生长因子7表达下降有关,胰岛素样生长因子1可明显刺激毛乳头细胞增殖.     

胰岛素样生长因子Ⅰ对组织工程肌腱细胞增殖影响的量效关系

目的:胰岛素样生长因子Ⅰ是一种潜在的促有丝分裂剂,对肌腱细胞有促进分裂增殖的作用.实验将不同剂量胰岛素样生长因子Ⅰ作用于第2代肌腱细胞,进一步验证其对细胞增殖的影响并探讨其量效关系.方法:实验于2004-11/2005-04在天津医院实验室完成.①实验材料:天津医院实验室提供的精选法国罗曼鸡受精鸡蛋200只,在孵育19 d时,随机取出10只鸡胚肌腱.②实验过程及分组:分离培养肌腱细胞,观察肌腱细胞形态及生长规律.取第2代肌腱细胞接种于六孔板,分别给予不同浓度的胎牛血清,观察血清浓度对肌腱贴壁及生长的影响.取第2代肌腱细胞接种于96孔板,分为7组.前5组分别加入含不同剂量胰岛素样生长因子Ⅰ(1,5,10,50,200 μg/L)的体积分数为0.02的胎牛血清培养液;第6组加入体积分数为0.05的胎牛血清培养液做为阳性对照,第7组加入体积分数为0.02的胎牛血清培养液做为阴性对照.③实验评估:采用四甲基偶氮唑盐法及瑞士-姬姆萨染色观察不同剂量的胰岛素样生长因子Ⅰ对细胞增殖的影响.结果:①肌腱细胞贴壁后生长很快,原代细胞1周左右即可传代,增殖速度与营养液中胎牛血清浓度呈正相关.②肌腱细胞增殖速度随胰岛素样生长因子Ⅰ剂量加大而有增加趋势.第2天、第4天,胰岛素样生长因子Ⅰ1 μg/L组、5 μg/L组和阴性对照组之间差异无显著性(P＞0.05);胰岛素样生长因子Ⅰ10 μg/L组、50 μg/L组和200 μg/L组之间差异无显著性(P＞0.05).②第2天,阳性对照组增殖高于胰岛素样生长因子Ⅰ1 μg/L组与5 μg/L组,低于10 μg/L组、50 μg/L组和200 μg/L组,差异有显著性(P＜0.000或< 0.006);第4天,阳性对照组增殖高于胰岛素样生长因子Ⅰ各剂量组和阴性对照组,差异有显著性(P＜0.000或< 0.006).③第2天、第4天,胰岛素样生长因子Ⅰ1μg/L组、5μg/L组和阴性对照组低于10μg/L组,50μg/L组,200μg/L组,差异有显著性(P＜0.000);阳性对照组增殖高于阴性对照组,统计分析差异有显著性(P＜0.000).结论:胰岛素样生长因子Ⅰ对肌腱细胞增殖的促进作用,随胰岛素样生长因子Ⅰ浓度增高而有增高趋势,10 μg/L为其较适合浓度,同时发现培养血清浓度对肌腱细胞有其特殊作用,浓度越高,肌腱细胞贴壁越快,并对增殖有明显促进作用.     

人类牙乳头间充质细胞向成牙本质细胞定向的诱导分化

目的:探讨人牙乳头间充质细胞向成牙本质细胞的分化机制和分化过程。方法:实验于2004-04/2005-03在四川大学华西口腔医学院口腔生物医学工程教育部重点实验室完成。①实验材料:选择四川大学华西第二医院自然流产的三四个月胎龄的人胚胎(孕妇知情同意,经过医院伦理委员会批准),胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子(均购自美国Sigma公司)。②实验分组:实验分为空白对照组、胰岛素样生长因子Ⅰ组、碱性成纤维细胞生长因子组和联合组。③实验干预:在建立人牙乳头间充质细胞体外培养模型的基础上,用不含白血病抑制因子的DMEM/F12培养基作为基础培养液,分别用浓度为10μg/L的胰岛素样生长因子Ⅰ、浓度为100μg/L的碱性成纤维细胞生长因子以及同时用这两种因子诱导人牙乳头间充质细胞向成牙本质细胞定向分化。④实验评估:采用倒置显微镜、免疫细胞化学和反转录-聚合酶链反应等方法从形态学和功能方面检测细胞的变化。结果:①培养和诱导细胞形态学变化及碱性磷酸酶活性:诱导细胞培养7d时,联合组和胰岛素样生长因子Ⅰ组的培养细胞均呈现单一胞浆突起,形态上出现成牙本质样细胞改变,细胞的碱性磷酸酶活性明显增高,联合组细胞的胞浆突起更明显,细胞的碱性磷酸酶活性更高;碱性成纤维细胞生长因子组与对照组比较,细胞变化不明显。②细胞免疫化学结果:联合组和胰岛素样生长因子Ⅰ组牙本质涎磷蛋白的免疫细胞化学染色胞浆呈阳性。③细胞hDSPPmRNA的表达:联合组和胰岛素样生长因子Ⅰ组细胞经反转录-聚合酶链反应后获得约599bp的特异性片段,表明两组细胞在mRNA水平表达特异性牙本质涎磷蛋白。而其余两组未见表达。结论:胰岛素样生长因子Ⅰ能刺激人牙乳头间充质细胞向功能性成牙本质细胞样细胞分化,碱性成纤维细胞生长因子可产生协同作用。     

蜂胶乔松素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的保护作用

目的:观察蜂胶乔松素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的影响,探讨其对人脐静脉内皮细胞可能的保护作用。方法:实验于2006-03/10在泰山医学院生命科学研究所(省重点实验室)完成。①实验材料:取出生1h内新生儿脐带,患者知情同意。②实验分组及方法:培养人脐静脉内皮细胞,建立脂多糖损伤模型(以10mg/L的脂多糖培养液培养细胞12h),实验分为空白对照组(加等量D-Hank’s液)、脂多糖组(10mg/L)、乔松素组(加10mg/L脂多糖预孵育12h后,按50,100,200mg/L分别加入乔松素),各组设8个复孔,共同孵育24h。③实验评估:光镜下观察细胞形态,MTT法观察乔松素对人脐静脉内皮细胞活性的影响,ELISA方法检测培养上清中血管假血友病因子的含量,TUNEL检测细胞凋亡率。结果:①细胞形态:空白对照组细胞紧密贴壁,呈铺路石状生长。脂多糖组可见多数细胞呈圆形;乔松素组见上述细胞较脂多糖组明显减少。②乔松素对人脐静脉内皮细胞活性、凋亡及血管假血友病因子含量的影响:与对照组比较,脂多糖组能明显诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡(P<0.01),不同浓度乔松素组可改善内皮细胞形态,组织活性明显升高(P<0.05),同时抑制内皮细胞血管假血友病因子的释放(P<0.05),使脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡细胞数明显减少(P<0.05)。结论:乔松素能增强人脐静脉内皮细胞活性,抑制脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡,从而发挥可能的内皮细胞保护功能。     

促红细胞生成素预防人脐静脉内皮细胞凋亡的作用

目的 建立氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡模型,探讨促红细胞生成素(EPO)对ox-LDL诱导HUVECs凋亡的影响.方法 取体外培养3～6代的HUVECs用于实验.实验分为两组:一组细胞予以不同浓度(6.25、50、100 kU/L)重组人促红细胞生成素(rhEPO)预处理24 h,再加入100 mg/L ox-LDL孵育48 h;另一组细胞加入反式或顺式LOX-1 mRNA预处理24 h,再加入 100 mg/L 的ox-LDL孵育12 h.采用存活率、凋亡率和Bcl-2/Bax比值评价细胞凋亡情况.结果 与ox-LDL组比较,随rhEPO浓度的递增,细胞存活率增高,细胞凋亡率降低,凋亡蛋白Bcl-2/Bax比值增高(P均<0.05),呈剂量依赖性.反式LOX-1 mRNA(0.5 μmol/L)预处理组凋亡蛋白Bcl-2/Bax比值较ox-LDL组明显增高(P<0.05);顺式LOX-1 mRNA(0.5 μmol/L)预处理组Bcl-2/Bax比值与ox-LDL组则无明显差异.结论 ox-LDL可以诱导HUVECs凋亡,并且通过LOX-1 mRNA来调节,rhEPO可增高Bcl-2/Bax比值,抑制ox-LDL诱导的HUVECs凋亡.     

内皮细胞中剪切型XBP1的过表达对动脉粥样硬化形成的影响

目的探讨血管壁内皮细胞中剪切型XBP1的过表达对动脉粥样硬化形成的影响。方法从产后的健康新生儿脐带获取脐静脉内皮细胞,脐静脉内皮细胞传代至第3代后,以不同浓度(10mg/L,20mg/L)的氧化胆固醇(7-酮基胆固醇,7-KC)温育脐静脉内皮细胞,应用Western Blot的方法,检测脐静脉内皮细胞中剪切型XBP1的蛋白表达水平,凋亡蛋白Caspase3的活性,应用流式细胞学的方法检测脐静脉内皮细胞的凋亡率和继发性细胞坏死阳性率。结果 随着7-KC温育浓度的增加,脐静脉内皮细胞中剪切型XBP1的蛋白表达水平增加,Caspase3的活性增加,脐静脉内皮细胞的凋亡率和继发性细胞坏死阳性率增加。结论血管壁内皮细胞S-XBP1的表达可能会激活凋亡途径,使内皮细胞发生凋亡,启动AS的形成。     

胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子对人类牙乳头间充质细胞增殖和分化的影响

背景:研究表明,胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子对细胞的增殖分化有重要作用,但对人类牙乳头间充质细胞生物学特性有何影响尚不清楚.目的:观察胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子对体外培养人类牙乳头间充质细胞增殖和分化能力的影响.方法:在建立人类牙乳头间充质细胞培养模型的基础上,①分别用含体积分数为1%或10%胎牛血清的DMEM/F12培养基将两种生长因子配制成不同的实验终浓度,取第4代生长良好的人类牙乳头间充质细胞,分别加入含0,0.1,1,10,100 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和0,25,50,75,100 μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ的培养基(0 μg/L作对照),培养96 h后四甲基偶氮唑盐法测增殖活性.②设10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子组、100 μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ组、碱性成纤维细胞生长因子+胰岛素样生长因子Ⅰ组和对照组.同上述方法每孔分别加含相应质量浓度生长因子的培养液,分别在培养1,3,5,7 d后,四甲基偶氮唑盐法测细胞增殖活性,改良酶动力学法测定细胞碱性磷酸酶活性.结果与结论:在0～100 μg/L质量浓度范围时,两种生长因子对人类牙乳头间充质细胞增殖具有促进作用,碱性成纤维细胞生长因子的促增殖作用比胰岛素样生长因子Ⅰ大,联合作用时有协同促增殖作用.碱性成纤维细胞生长因子的最大有效质量浓度为10 μg/L,胰岛素样生长因子Ⅰ的最大作用质量浓度为100 μg/L.在0～7 d时,碱性成纤维细胞生长因子对人类牙乳头间充质细胞的碱性磷酸酶活性影响不明显,随时间的增加,胰岛素样生长因子Ⅰ对细胞碱性磷酸酶活性影响增加,与碱性成纤维细胞生长因子联用时,对增加碱性磷酸酶的活性有协同作用.     

胰岛素样生长因子1及血小板源性生长因子对人退变髓核细胞生物学活性的影响

背景：有研究表明胰岛素样生长因子1和血小板源性生长因子可抑制人椎间盘细胞凋亡。目的：观察在体外培养条件下胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子对人退变髓核细胞生物学活性的影响。方法：体外单层培养人退变髓核细胞,通过免疫组织化学鉴定细胞。对传3代人退变髓核细胞采用分别不同生长因子干预,实验分4组：胰岛素样生长因子1组,血小板源性生长因子组,胰岛素样生长因子1＋血小板源性生长因子组及对照组。结果与结论：胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子均可促进细胞增殖,促进细胞合成Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖,其中胰岛素样生长因子1促Ⅱ型胶原合成作用强于血小板源性生长因子（P〈0.05）,血小板源性生长因子促蛋白聚糖合成作用强于胰岛素样生长因子1（P〈0.05）。胰岛素样生长因子1促进细胞合成Ⅰ型胶原,血小板源性生长因子抑制细胞合成Ⅰ型胶原。结果证实,胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子均可通过促进细胞增殖、促进细胞合成Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖,从而提高人退变髓核细胞的生物学活性。