β-arrestin1通过miR-652-5p促进T-ALL细胞线粒体活性氧含量的研究

目的:探讨β-arrestin1对急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞线粒体内活性氧含量(ROS)的影响及可能作用机制。方法:构建稳定敲低β-arrestin1(Siβ1)的T-ALL细胞株Jurkat细胞。采用流式细胞术、探针法分别检测细胞及线粒体内ROS含量。microRNA芯片检测及分析和Q-PCR验证β-arrestin1与microRNA的关系。miRbase软件预测microRNA靶基因,Western blot检测microRNA靶基因表达,双荧光素酶报告基因实验验证结合。结果:成功构建Jurkat Siβ1稳定细胞株,Jurkat Siβ1整个细胞水平ROS含量略降低,且线粒体内ROS含量明显降低。microRNA芯片分析发现,多种与T-ALL相关的microRNA呈差异表达,其中miR-652-5p在Jurkat Siβ1中的表达显著升高(P0.05 fold2.0),且Q-PCR显示miR-652-5p在Jurkat Siβ1中上升近5倍;通过miRbase软件预测到P62基因是miR-652-5p靶基因,且其能调控线粒体功能,在miR-652-5p稳定敲低Jurkat细胞中高表达,双荧光素酶报告基因实验证实P62是miR-652-5p靶基因。结论:T-ALL中,β-arrestin1可降低miR-652-5p表达,解除对P62基因的抑制,增加细胞线粒体内ROS含量。     

双氢青蒿素通过激活氧化应激诱导人急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡

目的:观察双氢青蒿素(DHA)对人急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)Jurkat细胞增殖及凋亡的影响。方法:采用CCK-8法检测DHA对Jurkat细胞的增殖抑制作用及N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)对DHA抑制的细胞活力的的恢复;流式细胞术测定细胞凋亡、活性氧(ROS)产生; Western blot法检测DNA损伤和凋亡相关基因的蛋白表达。结果:DHA对Jurkat细胞增殖有明显抑制作用,具有剂量依赖性(r=-0.936),NAC能部分恢复DHA对细胞增殖抑制的活力。流式细胞术检测显示,随着药物浓度的增高,细胞凋亡率增高(r=0.946),ROS累积量也增高(r=0.965);Western blot结果显示,DHA处理Jurkat细胞后,DNA损伤相关基因γ-H2AX和凋亡相关基因p53、c-Caspase3、BAX、cPARP的蛋白表达明显增加,BCL-2蛋白表达降低。结论:DHA诱导Jurkat细胞产生ROS,引起DNA损伤,激活P53凋亡通路,促使细胞凋亡。     

eEF1A1基因敲除对Jurkat细胞增殖和凋亡的影响及其机制探讨

本研究旨在探讨真核翻译延长因子1A1(eEF1A1)表达沉默对人急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞株Jurkat增殖、凋亡的影响及其作用机制。应用实时PCR法和Western blot法分别检测Jurkat细胞和3例健康成人外周血单个核细胞(PBMNC)中eEF1A1 mRNA和蛋白的表达。构建eEF1A1-shRNA慢病毒并感染Jurkat细胞,另设空白和阴性对照组,应用实时PCR法和Western blot法分别检测细胞eEF1A1 mRNA和蛋白的表达;应用MTT法、AnnexinⅤ-APC标记法、DNA倍体法分别检测细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期,Western blot法检测细胞PI3K/Akt信号通路相关信号分子的表达。结果表明,Jurkat细胞eEF1A1 mRNA和蛋白的表达水平明显高于健康成人PBMNC中的表达(P<0.01,P<0.05);构建的eEF1A1-shRNA慢病毒高效沉默Jurkat细胞eEF1A1的表达。与阴性对照组相比,eEF1A1-shRNA组Jurkat细胞增殖能力明显下降,凋亡明显增多,细胞周期被阻滞于G0/G1期,p-Akt、NF-κB、p-NF-κB、mTOR、p-mTOR蛋白的表达明显下调。结论:eEF1A1在T-ALL细胞中可能具有潜在的致癌作用,其表达沉默可有效抑制Jurkat细胞的增殖并诱导凋亡,其机制可能与下调PI3K/Akt/NF-κB和PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。     

eEF1A1回复表达对敲除eEF1A1基因的Jurkat细胞增殖、凋亡的影响及机制研究

本文探讨真核翻译延伸因子1A1(eEF1A1)回复表达对eEF1A1基因敲除人急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)Jurkat细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。构建表达的eEF1A1慢病毒并感染eEF1A1基因敲除的Jurkat细胞,应用RT-PCR和Western blot分别检测细胞eEF1A1 mRNA和蛋白的表达;应用MTT法、Annexin V-APC标记法、DNA倍体法分别检测细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期,Western blot法检测细胞PI3K/Akt信号通路相关信号分子的表达。结果表明,构建的eEF1A1表达慢病毒使基因敲除Jurkat细胞的eEF1A1表达明显回复。与阴性对照组相比,eEF1A1表达组Jurkat细胞增殖能力明显增强,凋亡明显减少,G0/G1期细胞比例明显减少;随着S期、G2/M期细胞比例增多,pAk、NF-κB、p-NF-κB、mTOR、p-mTOR蛋白的表达明显升高。结论:eEF1A1在T-ALL细胞中可能具有潜在的致癌作用,它的表达可有效促进Jurkat细胞的增殖并抑制凋亡,其机制可能与上调PI3K/Akt/NF-κB和PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。     

原发性胆汁性肝硬化患者中β-arrestin 1表达增高及其意义

目的 探讨原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者中β-arrestin 1的表达及其临床意义.方法 采用实时荧光定量PCR检测60例PBC患者、60例乙肝后肝硬化患者和60例健康体检者PBMCs中β-arrestin 1 mRNA水平,采用免疫印迹(western-blotting)技术检测β-arrestin 1蛋白表达水平.结果 PBC患者PBMCs中β-arrestin 1 mRNA的表达显著高于健康对照组和疾病对照组(P＜0.01),而疾病对照组和健康对照组PBMCs中β-arrestin 1 mRNA的表达差异无统计学意义(P＞0.05),并且β-arrestin 1表达水平与Mayo risk score正相关(Pearson r2=0.593 5,P＜0.001).PBC患者PBMCs中β-arrestin 1蛋白水平显著高于健康对照组和疾病对照组(P＜0.01),而疾病对照组和健康对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 PBC患者中β-arrestin 1表达显著增高,提示β-arrestin 1在PBC发病机制中可能起着重要作用,有可能作为PBC疾病进程的一个新的免疫状态标志.     

PTEN基因在急性T淋巴细胞白血病患者中的表达水平及临床价值

目的:研究急性T淋巴细胞白血病患者PTEN基因表达水平及临床意义。方法:选取自2014年1月-2018年5月在本院接受治疗的T-ALL患者124例,同时选取120例健康体检者作为对照组,收集受试者骨髓后分离单个核细胞,通过RT-PCR检测PTEN基因表达水平,采用Western blot检测PTEN蛋白表达水平,Kaplan-Meier法对T-ALL患者进行生存分析,Cox多因素分析患者预后的独立影响因素,并研究PTEN基因水平与T-ALL患者临床特征的相关性及其预后价值。结果:T-ALL患者的PTEN基因相对水平(0. 19±0. 06)显著低于健康者(P 0. 05)。PTEN表达水平与T-ALL患者的白细胞计数(r=0. 993)及外周血幼稚细胞(r=0. 996)呈显著相关关系。PTEN基因表达水平与T-ALL患者的性别、年龄、LDH水平、Hb水平及血小板数无相关性。中危组、标危组及高危组患者PTEN蛋白表达水平显著低于对照组(P 0. 05);高危组患者PTEN蛋白表达水平显著低于其它各组(P 0. 05)。PTEN基因高表达组的OS及DFS均高于PTEN低表达组(P 0. 05)。Cox多因素回归分析表明,白细胞计数及PTEN基因是OS独立影响因素(P 0. 05);血小板计数及PTEN基因是DFS独立影响因素(P 0. 05)。结论:PTEN基因水平与T-ALL患者预后相关,预后较好的患者PTEN基因水平较高。     

白血病骨髓基质细胞黏附培养对Jurkat细胞IAP家族主要成员表达的影响

目的:观察白血病骨髓基质细胞黏附培养对Jurkat细胞化疗敏感性及IAP家族主要成员表达的影响。方法:Jurkat细胞与60Co照射的基质细胞层黏附培养构建共培养模型,扫描电镜观察,0.5μmol/L DNR作用24h后FITC-Annexin V/PI标记流式细胞仪定量Jurkat细胞的凋亡率。Western blot检测黏附培养4、24及48h时Jurkat细胞总蛋白中XIAP和survivin的表达变化,流式细胞仪检测Jurkat细胞周期分布。结果:白血病基质细胞黏附培养组、正常基质细胞黏附培养组Jurkat细胞凋亡率分别为(6.05±0.54)%、(8.48±0.86)%,与悬浮对照组(25.74±6.15)%比较差异均有显著性(P<0.01),且白血病基质细胞黏附培养组与正常基质细胞黏附培养组间差异也有显著性(P<0.05)。Western blot检测结果示,与白血病基质细胞黏附培养4h即观察到XIAP表达的上调,24h和48h尤为明显,但survivin表达的变化呈现相反趋势。与Western blot结果相一致,Jurkat细胞周期阻滞于G0-G1期。结论:白血病骨髓基质细胞黏附培养能介导Jurkat细胞耐药,其机制可能与Jurkat细胞XIAP表达上调和survivin表达下调有关。     

4'-羟基汉黄芩素对急性淋巴细胞白血病细胞增殖和凋亡的作用研究

目的:研究4'-羟基汉黄芩素(4'-hydroxywogonin)对急性淋巴细胞白血病细胞株SUP-B15和Jurkat细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:体外培养SUP-B15和Jurkat细胞,经不同浓度的4'-羟基汉黄芩素处理细胞后,用CCK8法测定4'-羟基汉黄芩素对细胞增殖的抑制作用;Annexin V-APC/7-AAD双染流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测BCL-2,cleaved caspase-3,C-MYC等蛋白表达情况。结果:4'-羟基汉黄芩素呈剂量依赖性抑制SUP-B15和Jurkat细胞的增殖(r=0.78,r=0.89),24 h IC_(50)分别为(6.32±0.53)μg/ml,(12.04±0.42)μg/ml。在梯度药物浓度下,细胞凋亡率增高。Westwrn blot检测结果显示,4'-羟基汉黄芩素使凋亡相关蛋白BCL-2表达下调(P0.01);cleaved caspase-3表达上调(P0.01);细胞增殖相关蛋白C-MYC表达下调(P0.01)。结论:4'-羟基汉黄芩素可通过抑制SUP-B15和Jurkat细胞的增殖及诱导其凋亡而发挥抗肿瘤作用,其机制可能与下调BCL-2,C-MYC表达,上调cleaved caspase-3蛋白表达有关。     

E-cadherin基因在儿童急性白血病中的表达及其临床意义

目的:研究E-cadherin基因在儿童急性白血病(AL)中的表达及其与临床指标的相关性,并探讨其可能的调控机制。方法:采用实时荧光定量PCR检测135例初诊AL患儿骨髓单个核细胞中E-cadherin mRNA的表达水平,并分析其表达水平与临床指标的相关性;应用Western blot法检测E-cadherin、β-catenin、Akt、p-Akt信号通路相关蛋白的表达;同时收集22例非恶性血液病患儿的骨髓作为对照。结果:B-ALL、T-ALL、AML组中E-cadherin mRNA的表达均低于对照组(P0.01)。在B-ALL中,中危组患儿E-cadherin基因表达水平较标危组显著下降(P0.05);伴有脾脏浸润的患儿E-cadherin基因表达水平亦显著降低(P0.01);而在T-ALL、AML患儿各临床指标分组中,E-cadherin基因表达水平均无显著差异。在B-ALL患儿中,免疫分型为Common-BALL的患儿E-cadherin基因表达水平较其他B-ALL患儿显著升高(P0.01)。而在3种AL的FAB分组间均未见E-cadherin表达差异。基于计量资料的相关性分析表明,B-ALL患儿中,随着E-cadherin表达水平的下调,初诊外周血白细胞(WBC)计数、乳酸脱氢酶(LDH)水平有升高趋势(r=-0.419,r=-0.269),而初诊外周血血小板水平呈下降趋势(r=0.335);在T-ALL患儿中,E-cadherin表达水平与LDH、初诊骨髓幼稚细胞比例呈显著负相关(r=-0.567,r=-0.557);而在AML患儿中,随着E-cadherin表达水平下调,初诊WBC计数水平和初诊骨髓幼稚细胞比例呈上升趋势(r=-0.368,r=-0.391)。与对照组比较,3种AL患儿中E-cadherin表达水平下调(P0.001),而β-catenin、Akt则上调(P0.01),p-Akt、p-Akt/Akt表达量在T-ALL中上调(P0.01)。结论:E-cadherin基因表达降低或缺失是儿童急性白血病的预后不良相关因素,可能通过激活Wnt/β-catenin和PI3K/Akt信号通路,促进肿瘤的发生,并引起细胞的一系列恶性生物学行为,E-cadherin有望成为判断预后和指导个性化治疗的指标。     

初发急性髓性白血病患者外周血中TAL1基因异常表达的临床价值

目的探讨急性髓性白血病(AML)细胞中TAL1基因异常高表达在初发急性髓性白血病患者的临床意义。方法选取2016年6月～2018年6月本院收治经细胞免疫学、细胞形态学核组织化学染色等确诊为首次发生的急性髓性白血病患者50例为观察A组,化疗缓解的急性髓性白血病患者50例为观察B组,并收集本实验所涉及的急性白血病细胞组样本(NB4、HL-60、CCRF-CEM、Jurkat细胞株),同时收集30例经体检健康正常人外周血样本作为对照组。分析在AML患者中TAL1 m RNA的表达水平。结果观察组T-ALL细胞TAL1mRNA表达高于对照组,且其在Jurkat细胞内更高,TAL1mRNA在HL-60细胞内表达异常高,不仅高于对照组,更高于T-ALL细胞内的表达水平,差异有统计学意义(P0.05);TAL1mRNA在初发急性髓性细胞白血病患者中表达比经化疗缓解患者中的表达水平要高,且AML-M1、AML-M3和AML-M5均表现为较高的m RNA表达水平,差异有统计学意义(P0.05)。结论 TAL1与AML的发病有密不可分的关系,TAL1异常高表达对于初发急性髓性白血病患者具有一定临床意义。     

他汀类药物通过抑制Akt通路调控急性T淋巴细胞白血病细胞增殖与凋亡

目的:探讨他汀类药物对急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制。方法:Jurkat及CCRF-CEM细胞经不同浓度的氟伐他汀和辛伐他汀药物处理24 h,CCK-8法检测细胞增殖抑制情况;Ed U法检测细胞DNA复制情况;Annexin V/7-AAD双染法分析细胞凋亡情况;流式细胞术分析细胞周期的变化;免疫印迹法检测Cyclin D1、p21、p27、BAX、BCL-2及p-Akt蛋白的表达。结果:氟伐他汀、辛伐他汀均可抑制Jurkat及CCRF-CEM细胞增殖,且抑制效应呈一定的剂量依赖性。氟伐他汀浓度为0.2 mmol/L时,Jurkat和CCRF-CEM细胞抑制率分别达41.14%和57.08%;而辛伐他汀浓度为0.2 mmol/L时,Jurkat和CCRF-CEM细胞抑制率分别达68.42%和77.10%,均接近或超过半数抑制,与溶剂对照组比较有显著差异(P0.05)。不同浓度的氟伐他汀及辛伐他汀分别作用于Jurkat和CCRF-CEM细胞24 h,其早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例均升高,且于0.2 mmol/L和0.3 mmol/L药物浓度时,其总凋亡比例显著升高,与溶剂对照组相比有显著差异(P0.05)。细胞周期检测结果显示,氟伐他汀及辛伐他汀诱导Jurkat和CCRF-CEM细胞G_1期阻滞。Western blot检测结果显示,Jurkat和CCRF-CEM细胞经氟伐他汀或辛伐他汀处理后,BAX、p21和p27表达量逐渐升高,Cyclin D1、BCL-2和p-Akt表达量逐渐减低。结论:他汀类药物可通过抑制Akt信号通路抑制T-ALL细胞的增殖,并诱导其凋亡。     

芹菜素通过抗炎性反应和细胞凋亡保护大鼠髓核细胞

目的探讨芹菜素(API)对大鼠髓核细胞(NPs)的保护作用及相关机制。方法取第3代髓核细胞经100μM过氧化氢(H_2O_2)处理2 h制作大鼠髓核细胞损伤模型,实验分为5组:对照组,模型组、API 10μM组、API 20μM组和API 40μM组,对照组为正常髓核细胞,模型组给与100μM H_2O_2处理2 h,实验组分别给与API 10μM、20μM和40μM处理,24 h后流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot法检测凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达;ELISA法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)以及caspase-3、caspase-9表达。结果 24 h后,模型组细胞凋亡率显著高于对照组,而与模型组比较,芹菜素组能显著抑制髓核细胞的凋亡,并呈剂量依赖趋势(F=37.547,P=0.034);Western blot显示,芹菜素能显著提高Bcl-2表达,并呈剂量依赖趋势(F=22.016,P=0.009),抑制Bax蛋白表达(F=56.971,P=0.000);ELISA结果显示,芹菜素能明显抑制TNF-α、IL-1β以及caspase-3、caspase-9的表达,并呈剂量依赖趋势(F=11.753,P=0.018;F=39.467,P=0.004;F=14.185,P=0.021;F=9.663,P=0.037)。结论芹菜素对髓核细胞的保护作用可能是通过抑制炎性反应以及抗细胞凋亡作用完成,且其作用呈剂量依赖趋势。     

β-arrestin2抗基因RNA慢病毒载体体外基因沉默效应研究

目的:探讨β-arrestin2抗基因RNA慢病毒载体在体外工具细胞中的基因沉默效应及其携带的用于活体核磁共振成像监测的铁蛋白报告基因的表达.方法:用构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒感染NG108-15细胞,实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测β-arrestin2抗基因RNA慢病毒对工具细胞的β-arrestin2 mRNA和蛋白表达的下调作用,以及该病毒所携带的用于活体核磁共振成像监测的铁蛋白报告基因的表达.结果:构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒能显著降低工具细胞中β-arrestin2 mRNA和蛋白的表达,与对照组相比实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测的沉默效率分别为79%和82%(P<0.05).感染病毒组的NG108-15细胞的铁蛋白表达量显著升高,是对照组细胞的2.29倍(P<0.05).结论:构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒在工具细胞中对β-arrestin2基因具有显著的沉默效应,该病毒携带的铁蛋白报告基因在工具细胞中表达.成功验证了β-arrestin2抗基因RNA慢病毒在体外的基因沉默效应和铁蛋白报告基因的表达,为该病毒的在体研究奠定了基础.     

11β-羟类固醇脱氢酶2在恶性淋巴细胞中的表达及与其对糖皮质激素敏感性关系

本研究讨论11β-羟类固醇脱氢酶2(11β-HSD2)在3种来源淋巴的细胞系中的表达及其与恶性淋巴细胞对糖皮质激素敏感性的关系.利用实时定量PCR及Western blot方法检测急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞系、淋巴瘤Daudi和Raji细胞系、以及健康志愿者外周血T淋巴细胞中11β-HSD2的表达;用流式细胞术...     

Netrin-1在急性淋巴细胞白血病患者中的表达及意义

目的:研究Netrin-1蛋白在儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中的表达及其与临床指标的相关性,并探讨其可能的调控机制。方法:采用ELISA法检测48例ALL患儿(初诊、复发)外周血血清中Netrin-1的表达水平,并分析其与27例非恶性血液病患儿对照样本表达水平的差异,进而分析ALL外周血Netrin-1水平与临床指标的相关性。体外培养ALL细胞Jurkat、Molt-4、SUP-B15和Raji,经不同浓度重组人Netrin-1蛋白处理后,用Transwell法检测细胞的侵袭能力;CCK-8法测定Netrin-1对细胞增殖的作用;采用Western blot检测FAK、Erk1/2、PI3K、Akt等信号通路关键蛋白的表达及其磷酸化水平。结果:ALL患儿外周血中Netrin-1的表达量显著高于对照组(P<0.05)。随着Netrin-1表达水平的上调,WBC水平(r=-0.290,P<0.05)呈下降趋势,Plt水平(r=0.483,P<0.05)呈上升趋势,且与年龄、Hb水平、骨髓幼稚细胞比例无显著相关性;Netrin-1浓度在25-50 ng/ml水平时,Netrin-1水平与WBC(r=0.886,P<0.05)呈正相关;WBC>50×10^9/L和Plt<20×10^9/L的患儿Netrin-1表达水平显著降低(P=0.042,P=0.001);Netrin-1的表达水平在危险度分级中具有显著性差异(P=0.017),与低危组与中危组相比,高危组Netrin-1的表达水平显著提高;Netrin-1在性别、肝脾淋巴结肿大、MRD、复发、染色体异常等分组中的表达水平均无显著性差异;Netrin-1对4种细胞的侵袭能力有促进作用(P<0.05),随着Netrin-1浓度的提高,细胞数有先增加后降低的趋势,且均在Netrin-1浓度为100 ng/ml时,侵袭下室的细胞数最高;Netrin-1浓度为25 ng/ml时,4种细胞存活率显著增加(P<0.05),其中SUP-B15细胞在浓度为100 ng/ml时,细胞存活率最高;4种细胞存活率呈现低浓度升高及高浓度降低的趋势;Western blot结果显示,Netrin-1使FAK、Erk1/2、PI3K、Akt等信号通路关键分子磷酸化水平提高(P<0.05)。结论:ALL患儿血清中存在Netrin-1的异常表达,Netrin-1可能通过增加白血病细胞的增殖、侵袭能力来影响ALL的发生发展,可能成为ALL的危险因素或生物治疗中的潜在靶点。     

针对c-myc基因的小干扰RNA对急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞的c-myc、h-tert表达的影响

本研究探讨针对c-myc的小干扰RNA对急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞c-myc,h-tert基因和蛋白表达的影响,为白血病的基因治疗提供新方法和靶点。针对c-myc mRNA的第1545-1565靶位点用化学合成法合成siRNA,经转染剂转染入Jurkat细胞。应用RT-PCR及Western blot分别检测c-myc siRNA作用前后c-myc、h-tert基因的mRNA及蛋白表达的变化。结果表明:c-myc siRNA能明显抑制Jurkat细胞的增殖,作用48小时的半数抑制浓度(IC50)约为75nmol/L。c-myc siRNA可引起Jurkat细胞的c-myc、h-tert mRNA和C-MYC、hTERT蛋白表达水平降低。结论:c-myc siRNA明显降低Jurkat细胞c-myc、h-tert基因的mRNA及蛋白表达水平。c-myc siRNA可能是通过抑制c-myc mRNA表达而降低胞内C-MYC蛋白水平。     

异硫氰酸苯已酯抑制T细胞白血病Jurkat细胞Wnt/β-catenin信号通路的研究

本研究目的在于探索研究异硫氰酸苯己酯(PHI)在体外对人类T细胞白血病Jurkat细胞Wnt/β联蛋白(catenin)信号通路及组蛋白调控、细胞凋亡和增殖的影响。用MTT方法检测PHI作用后Jurkat细胞的增殖率变化;用流式细胞术观察细胞凋亡;用Western blot观察Jurkat细胞Wnt/β-catenin信号转导通路相关蛋白β-catenin、TCF、c-myc、cyclinD1水平的变化,以及组蛋白甲基化H3K4,H3K9、乙酰化H3,H4的变化。结果表明,PHI可抑制Jurkat细胞增殖,诱导细胞凋亡,呈浓度和时间依赖性,48 h的IC50约为20μmol/L;PHI处理3 h后上调组蛋白乙酰化H3、H4和组蛋白甲基化H3K4,下调组蛋白甲基化H3K9,7 h时作用更明显;PHI作用3 hβ-catenin表达水平无变化,7 h后Wnt/β-catenin信号转导通路β-catenin及其周期相关基因TCF、c-myc、cyclinD1表达均下降。结论:PHI抑制Jurkat细胞Wnt/β-catenin信号转导通路,调控组蛋白甲基化、乙酰化,从而诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖。     

调控A20对NF-κB表达及Jurkat细胞的影响

目的:探讨在急性T淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药Jurkat细胞株中,调控A20对NF-κB表达以及Jurkat细胞生物学特性的影响。方法:CCRF CEM和Jurkat细胞中分别加入100、10、1、0.1、0.01和0.001μmol/L地塞米松(DEX),培养24、48和72 h,应用CCK-8检测细胞增殖抑制的变化。构建A20质粒,设计并合成A20-siRNA,分别通过脂质体转染Jurkat细胞,CCK-8检测不同浓度DEX处理组、不同浓度DEX联合A20质粒和A20-siRNA处理组的Jurkat细胞增殖率。应用RT-qPCR检测NF-κB的m RNA表达水平,Western bolt检测蛋白表达水平,采用流式细胞术检测Jurkat细胞凋亡。结果:不同浓度地塞米松(DEX)对CCRF CEM细胞生长的抑制作用呈显著的时间依赖性(r=0.984,P0.05)和浓度依赖性(r=0.966,P0.05);CCRF CEM细胞在24 h时,IC50接近1μmol/L,Jurkat细胞在1μmol/L和10μmol/L开始出现较大差异。由于1μmol/L DEX处理的Jurkat细胞增殖率无明显变化,故选取1μmol/L DEX处理的Jurkat细胞为对照组。检测显示A20质粒转染联合不同浓度DEX处理组细胞增殖率较DEX组及A20-siRNA联合DEX组低(P0.05)。A20质粒转染Jurkat细胞后,NF-κB的mRNA及蛋白表达明显低于对照组(P0.05),细胞凋亡率较对照组明显增高(P0.05);A20-siRNA转染Jurkat细胞后,NF-κB的mRNA及蛋白表达水平明显高于对照组(P0.05),A20-siRNA组细胞的凋亡率与对照组无明显改变(P0.05)。结论:Jurkat细胞对DEX耐药,A20过表达联合DEX可增加对DEX耐药细胞的敏感性,降低Jurkat细胞增殖率;下调Jurkat细胞中NF-κB的表达水平,促进Jurkat细胞的凋亡。     

人参皂苷Rh2对人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞诱导凋亡的作用及其机制

目的:探讨人参皂苷Rh2诱导人急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)Jurkat细胞的凋亡及其机制。方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度的Rh2(0、10、20、40和80μg/ml)对Jurkat细胞增殖活性的影响,并计算48 h下Rh2对Jurkat细胞的半抑制浓度(IC_(50));采用形态学方法及Hoechst 33258荧光染色观察IC_(50)剂量下Rh2共培养48 h的Jurkat细胞凋亡状况。后将细胞实验分为4组:对照组、Rh2(IC_(50))组、PI3K抑制剂LY294002(50μmol/l)组以及Rh2(IC_(50))+LY294002(50μmol/l)组。同步培养48 h后,采用PI单染和Annexin V-FITC/PI双染分别检测Jurkat细胞凋亡及细胞周期变化;采用Western blot检测各组Jurkat细胞凋亡相关蛋白BAX、BCL-2、Cleaved-Caspase 3,细胞周期相关蛋白Cyclin D1以及PI3K/AKT信号通路相关蛋白AKT、p-AKT的表达水平。结果:Rh2(10-80μg/ml)呈剂量-时间依赖性抑制Jurkat细胞增殖(r_(48h)=0.999,P 0.01;r_(80μg/ml)=0.991,P 0.05),并伴有明显的细胞凋亡形态学改变。流式细胞术检测结果显示,与对照组比较,Rh2组和LY294002组细胞凋亡率显著增加,且细胞多数被阻滞在G0/G1期;而与Rh2组和LY294002组比较,Rh2+LY294002组细胞凋亡及细胞阻滞现象更为显著。Western blot结果显示,与对照组比较,Rh2能显著促进BAX、Cleaved-Caspase 3蛋白表达,抑制BCL-2、Cyclin D1及p-AKT的表达,且LY294002对这一效应具有显著的促进作用。结论:Rh2能够呈时间-剂量依赖性地诱导Jurkat细胞的凋亡;且能对Jurkat细胞产生明显的G0/G1期阻滞;这可能与Rh2抑制PI3K/AKT通路进而介导的一系列凋亡信号级联反应密切相关。     

SOX4调控Wnt信号通路影响骨肉瘤细胞增殖侵袭的实验研究

目的探讨性别决定区Y框蛋白4(SOX4)调控Wnt信号通路对骨肉瘤细胞增殖侵袭能力的影响。方法RT-PCR和Western blot检测收集的骨肉瘤组织及对应的瘤旁组织中SOX4的表达水平。体外培养骨肉瘤细胞F5M2,细胞转染SOX4小干扰RNA1(干扰1组)和SOX4小干扰RNA2(干扰2组)、小干扰RNA阴性对照(siRNA-NC组),同时以未转染的细胞为对照组。RT-PCR和Western blot检测各组细胞中SOX4表达水平,筛选出干扰效果较好的干扰2组继续研究。噻唑蓝(MTT)检测细胞存活率,Transwell小室检测细胞侵袭能力,Western blot检测细胞中β-连环蛋白(β-catenin)、磷酸化的糖原合成激酶3β(pGSK-3β)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达水平。结果骨肉瘤组织中SOX4的表达水平明显高于瘤旁组织(P0.05)。干扰1组和干扰2组细胞中SOX4的表达水平明显低于对照组(P0.05),后续选用干扰2组细胞继续研究。干扰2组细胞存活率、侵袭细胞数目及细胞中MMP-2、β-catenin表达水平均明显低于对照组(P0.05),而pGSK-3β表达水平明显高于对照组(P0.05)。siRNA-NC组细胞中SOX4表达水平、细胞存活率、侵袭细胞数目及细胞中MMP-2、β-catenin、pGSK-3β表达水平与对照组比较均无显著差异(P0.05)。结论干扰SOX4后能够抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭,作用机制可能与抑制Wnt信号通路有关。