吲哚美辛诱导视网膜色素上皮细胞凋亡的实验研究

背量一些与视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞凋亡相关的疾病均与炎症刺激有关.目的探讨用吲哚美辛诱导体外培养的人胚胎视网膜色素上皮细胞的凋亡.设计随机对照、单盲法的前瞻性研究.地点和对象实验在中南大学湘雅二院实验中心进行,胎儿标本来源于中南大学湘雅二院妇产科.干预加入终浓度分别为100,200,400,600 μmol/L的吲哚美辛作用24 h;600 μmol/L作用6,12,24后用透射电镜定性观察凋亡细胞,并用吖啶橙荧光染色进行定量和定性分析.主要观察指标凋亡RPE细胞形态和数量的变化.结果经200,400,600μmol/L吲哚美辛作用24 h后RPE细胞凋亡数为(2.7000±1.3375),(5.100 0±1.370 3),(6.800 0±1.686 5),与对照组(0.200 0±0.421 6)相比,差异有显著性意义(t值分别为4.624,9.062,12.206,P＜0.01),随着吲哚美辛浓度的增加,RPE细胞凋亡数逐渐增多;600 μmol/L吲哚美辛作用12,24 h后RPE细胞凋亡数为(4.400 0±0.8433),(6.400 0±1.2649),与对照组(0.200 0±0.4216)相比,差异有显著性意义(t值分别为8.617,13.274,P＜0.01).结论吲哚美辛能诱导体外培养的人胚胎RPE细胞的凋亡,并且RPE细胞的凋亡呈现出随浓度增加和时间延长凋亡细胞数明显增多.     

骨髓基质细胞向成肌细胞分化中吲哚美辛的作用

目的：探讨吲哚美辛对骨髓基质细胞(marrow stroma cells，MSCs)分化的影响，为合理利用细胞工程解决肌损伤修复提供理论及实验基础。方法：实验动物为6～8周龄Balb／c雄性小鼠80只。单用吲哚美辛、5氮杂胞苷以及联用吲哚美辛／5氮杂胞苷诱导MSCs分化，分别在诱导前及诱导后1，3，5，12，24h应用反转录-聚合酶链反应检测MSCs中PPARγ及MyoD的mRNA表达，免疫组化检测myosin及PPARγ表达。结果：联用吲哚美辛／5氮杂胞苷诱导MSCs分化后，MSCs不向成肌细胞分化而向脂肪细胞分化。PPARγ在诱导后3h开始表达(0．162&;#177;0.033)，与3h相比，诱导后24h明显增强(0．195&;#177;0．056，P&;lt;0．05)，MyoD表达明显受到抑制。结论：吲哚美辛能抑制MSCs向成肌细胞分化，促进其向脂肪细胞分化，这种作用可能是通过PPARγ途径而起作用的。     

肿瘤坏死因子-α在大鼠脑缺血再灌注中的表达及对神经细胞凋亡的影响

目的：观察大鼠脑缺血再灌注损伤后肿瘤坏死因子-α(tumor necmsis factor-alpha，TNF-α)表达及细胞凋亡情况，探讨TNF-α在脑缺血再灌注损伤中的作用。方法：采用大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，分为3组：脑缺血再灌注组大鼠大脑中动脉阻塞2h，再灌注2，6，12，24，48，72，96h、假手术组及永久缺血组，分别测定TNF-α表达(用免疫组织化学法)及细胞凋亡数(原位凋亡检测试剂盒)。结果：脑缺血再灌注组TNF-α表达水平[6h：(15．0&;#177;3．21)个／mm^2，12h：(47．0&;#177;0．87)个／mm^2，24h：(49．0&;#177;10．3)个／mm^2，48h：(44．8&;#177;6．9)个／mm^2，96h:(37．9&;#177;6.4)个／mm^2、细胞凋亡数[2h：(33．3&;#177;0．8)个／mm^2，6h:(56．6&;#177;1．6)个／mm^2，12h:(72．3&;#177;4.2)个／mm^2．24h：(86．6&;#177;5．5)个／mm^2，48h：(96．8&;#177;0．9)个／mm^2]明显高于假手术组(P&;lt;0.01)及永久缺血组(P&;lt;0.05)；且TNF-α表达与细胞凋亡数关系密切(r=0．567．P&;lt;0，01)。结论：大鼠脑缺血再灌注损伤后TNF-α在神经元迟发性坏死中起着重要作用。     

大鼠脑组织缺血再灌注后促红细胞生成素对神经元的保护

目的：观察促红细胞生成素对缺血再灌注大鼠脑组织海马CA1区神经元数量、凋亡细胞数量变化、脑组织匀浆一氧化氮含量、丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性改变的影响。方法：实验于2003-03／2004-12在解放军第三军医大学附属新桥医院中心实验室完成。选择健康Wistar大鼠66只，随机分为正常对照组6只，缺血再灌注生理盐水组30只(生理盐水对照组)，缺血再灌注促红细胞生成素组30只(促红细胞生成素治疗组)。除正常对照组线栓法制备大鼠大脑中动脉阻断局灶性脑缺血模型，缺血2h后再灌注。促红细胞生成素组于再灌注开始时经腹腔按2000U／kg注入生理盐水稀释的重组人红细胞生成素(200U／mL)，生理盐水对照组经腹腔注入等量的生理盐水。再灌注后观察时相点为2．6，12，24，48h，每个时间点6只。应用苏木精-伊红染色观察脑海马CA1区细胞数量情况，应用末端脱氧核苷酸转移酶缺口标记法检测海马CA1区神经元凋亡情况，应用硝酸还原酶法测定脑组织一氧化氮含量，羟胺法测定脑组织超氧化物歧化酶活性，硫代巴比妥酸法测定脑组织中丙二醛含量。结果：66只大鼠全部进入结果分析。①脑海马CA1区细胞计数：促红细胞生成素治疗组再灌注后12，24，48h比生理盐水对照组细胞数明显增加[(286.7&;#177;33.8)，(268.6&;#177;44.5)个／视野；(271．9&;#177;30．4)．(240．8&;#177;22，5)个／视野：(258，3&;#177;29．5)，(2018&;#177;307)个／视野；(t=3.189～5.589，P&;lt;0.01)]。②脑海马CA1区凋亡细胞计数：促红细胞生成素治疗组再灌注后6，12，24，48h比生理盐水对照组阳性细胞数明显减少[(21.5&;#177;5.8)，(28．4&;#177;6．51个／视野：(327&;#177;4．6)，(48.8&;#177;7.6)个／视野；(42.8&;#177;6.6)，(60．7&;#177;10.2)个／视野；(51.8&;#177;9.5)个／视野，(81.6&;#177;12．3)个／视野，(t=3.457～6.347,P&;lt;0.01)1。③脑组织一氧化氮含量：促红细胞生成素治疗组再灌注后2，6．12，24，48h比生理盐水对照组一氧化氮含量明显降低[(48．2&;#177;5．1)，(59，4&;#177;5．5)mmol／L;(51．4&;#177;6，3)，(66，3&;#177;98)mmol／L：(59．7&;#177;6．6)，(80.7&;#177;10.2)mmol／L；(55．7&;#177;8．1)，(77．8&;#177;9.2)mmol／L：(49.3&;#177;6．7)，[67．3&;#177;7，1)mmol／L，(t=3．258～5，624，P&;lt;0．01)]。④脑组织超氧化物歧化酶活性：促红细胞生成素治疗组再灌注后2，6，12，24，48h比生理盐水对照组超氧化物歧化酶活性明显增高[(3.78&;#177;0.74)，(3.21&;#177;0．31)μkat／L；(3．41&;#177;0.43)，(2．92&;#177;0.31)μkat／L；(3．21&;#177;0．35)，(2．51&;#177;0．27)μkat／L；(3．64&;#177;0．55)，(3.01&;#177;0.32)μkat／L；(4．10&;#177;0.56)，(3.55&;#177;0.41)μkat／L，(t=3．485～6，457，P&;lt;0．01)]。⑤脑组织丙二醛含量：促红细胞生成素治疗组再灌注后2，6，12，24，48h比生理盐水对照组丙二醛含量明显降低[(40.7&;#177;4．4)，(54.6&;#177;6．7)μmol／L；(51.3&;#177;5.4)，(65.7&;#177;8．8)μmol／L；(61.7&;#177;7．2)，(77.4&;#177;7.5)μmol／L；(53.8&;#177;6．4)，(67．8&;#177;9.1)μmol／L；(39．7&;#177;4．0)，(53．3&;#177;4.9)μmol／L，(t=3.541～6.045，P&;lt;0．01)]。结论：促红细胞生成素可增加大鼠局灶性脑缺血再灌注组织海马cAl区细胞存活数量，对海马CA1区细胞凋亡具有阻抑作用，降低一氧化氮生成量，使脂质过氧化反应的程度减轻，起到了对神经细胞的保护作用。     

不同浓度氟对兔成骨细胞细胞周期及凋亡的影响

目的：建立成骨细胞体外培养模型，并观察不同浓度的氟对成骨细胞增殖行为的影响，为氟治疗骨质疏松的研究提供实验依据。方法：用幼兔肋骨培养成骨细胞，并纯化、鉴定。用不同浓度的氟化钠处理(20，160，240，400μmol／L)，MTT法测定氟对成骨细胞增殖活性的影响：流式细胞术测定细胞周期变化及凋亡的改变。结果：低浓度的氟(20μmol／L)在体外可显著促进成骨细胞增殖(作用24h后A值为：0．089&;#177;0．012，P&;lt;0．01)，不引起成骨细胞的凋亡，可使S期和G2／M期的细胞明显增多；高浓度的氟(160，240，400μmol／L)则抑制成骨细胞的增殖。(作用24h后的A值分别为：0．055&;#177;0．010，0．054&;#177;0．006，0．023&;#177;0.010，P&;lt;0．01)，引起成骨细胞的凋亡(9．53&;#177;2．10，24．43&;#177;3．03，P&;lt;0．01和32．63&;#177;1．17，P&;lt;0．05)，G2／M期细胞明显减少。结论：低浓度的氟可以促进成骨细胞的增殖；高浓度的氟抑制成骨细胞的增殖，诱导细胞的凋亡，抑制细胞由S期向G2／M期转化。低浓度的氟可用于对骨质疏松的治疗。     

碱性成纤维细胞生长因子对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的抑制

目的：探讨大鼠脊髓损伤后应用碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor bFGF)对脊髓损伤区细胞凋亡的影响。方法：利用Allen氏WD(Weight drop，WD)技术，以10g&;#215;2．5cm致伤力造成SD大白鼠Ts脊髓损伤模型，并于损伤平面以下蛛网膜下腔置细塑料导管。bFGF治疗组(A组)分别于术后即刻，1，2，4，8，12，24，及48h经导管注入bFGF溶液20μL(含bFGF100u），以后每周经导管注，20μL bFGF：对照组(B组)则在同时间注入等量生理盐水：损伤后1，3．7，14，28d对脊髓损伤区进行细胞凋亡的检测(TuNEL)，采用计算机图像分析技术进行定量分析并计算凋亡指数(AI)，AI=凋亡细胞核数，总细胞核数计算：结果：A，B两组中均发现凋亡细胞，A组损伤后不同时间段神经细胞凋亡指数分别为(4.57&;#177;0．43)，15．38&;#177;1.16)，(3．43&;#177;0．65)．(3.38&;#177;058)．(2．63&;#177;0．43)；B组分别为(7.36&;#177;0．68)，(13.96&;#177;2．74),(9．26&;#177;1．03)，(7．25&;#177;0．73)，(5．79&;#177;0．57).B组细胞凋亡率大于A组结论：bFGF能抑制脊髓损伤后脊髓损伤区的细胞凋亡。     

缺氧诱导人视网膜色素上皮细胞19中血管内皮生长因子mRNA表达及金雀异黄素的抑制作用

目的：观察缺氧对人视网膜色素上皮细胞19中血管内皮生长因子mRNA表达的诱导作用，以及金雀异黄素对其血管内皮生长因子mRNA和蛋白表达的抑制作用。方法：实验于2004—02／12在南京医科大学生理学实验室完成。视网膜色素上皮细胞缺氧(体积分数为0．05的CO2／体积分数为0．95的N2)2，12，24，36h后，用反转录聚合酶链反应检测该区域血管内皮生长因子mRNA表达；细胞用50，100，200μmol／L金雀异黄素和50μmol／L PD98059预处理后缺氧2和24h，用反转录聚合酶链反应检测人视网膜色素上皮细胞19细胞中血管内皮生长因子mRNA表达，用酶联免疫吸附分析检测细胞培养液上清中血管内皮生长因子蛋白表达。结果：①缺氧2，12，24，36h人视网膜色素上皮细胞19细胞血管内皮生长因子mRNA表达是正常组的2．6，3．1，8．4，2．9倍(P&;lt;0．05，n=8)。②缺氧2h：50，100，200μmol／L金雀异黄素和50μmol／LPD98059可以抑制缺氧组血管内皮生长因子mRNA表达的51．1％，71．6％．79．7％和55％(P=0．01，n=10)，蛋白表达分别为(97．00&;#177;12．79)，(58．85&;#177;20．21)．(37．93&;#177;14．41)，(57．83&;#177;9．66)ng／L。③缺氧24h：50，100，200μmol／L金雀异黄素和50μmol／LPD98059可以抑制缺氧组血管内皮生长因子mRNA表达的55．0％，78．7％，90．7％和67．2％(P=0．000，n=10)，蛋白表达分别为(189．60&;#177;20．20)，(117．70&;#177;21．97)，(49．7&;#177;13．17)，(86．33&;#177;12．47)ng／L。结论：缺氧对血管内皮生长因子mRNA表达的诱导呈时间依赖性；金雀异黄素可以在转录及转录后水平抑制缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞19细胞中血管内皮生长因子表达的上调。金雀异黄素对血管内皮生长因子mRNA和蛋白表达的抑制作用也呈浓度依赖性。     

党参总皂苷抗缺氧缺糖再给氧诱导大鼠皮质神经细胞凋亡的作用

目的：以原代培养的胚胎大鼠大脑皮质神经细胞进行缺氧缺糖再给氧处理，观察党参总皂苷对神经细胞凋亡的抑制作用。方法：胚胎大鼠大脑皮质神经细胞原代培养，含连二亚硫酸钠的无糖Earle’s液进行缺氧缺糖处理造模，MTT法测定细胞存活率，Hoechst 33342和PI原位双染法荧光显微镜观察细胞形态学变化和坏死、凋亡细胞百分率，APO-BRDU法流式细胞术检测凋亡细胞百分率，Fluo-3法流式细胞术检测细胞内Ca^2+浓度，评价药效。结果：细胞存活率：与模型组[(19．69&;#177;5．80)％]比较党参总皂苷0．52mg／L组[(39．21&;#177;12．21)％]，0．052mg／L组[(37．9l&;#177;4．67)％]能显著提高细胞存活率(P&;lt;0．001)；细胞坏死率：与模型组[(44．99&;#177;12．81)％]比较党参总皂苷0．52mg/L组[(15．66&;#177;4．67)％]，0.052mg／L组[(23、98&;#177;4.04)％]和0．0052mg／L组[(20．50&;#177;5．19)％]能显著降低细胞坏死率(P&;lt;0．001)；原位双染法细胞凋亡率：与模型组[(17．44&;#177;4．82)％]比较党参总皂苷0．52mg／L组[(10．58&;#177;2．04)％]，0．052mg／L组[(11．61&;#177;2．35)％]能显著降低细胞凋亡率(P&;lt;0．05)；流式细胞术检测细胞凋亡率：与模型组[(8．55&;#177;3．84)％]比较党参总皂苷0．52mg／L组[(3．85&;#177;1．92)％]，0．0052mg／L组[(3．45&;#177;2．22)％]能显著降低细胞凋亡率(P&;lt;0．05)；细胞内Ca^2+平均荧光值，与模型组(47．37&;#177;9．68)比较党参总皂苷0．52mg／L组(23．56&;#177;13．19)能显著降低细胞内Ca^2+平均荧光值(P&;lt;0．05)，表明党参总皂苷能明显降低细胞内Ca^2+浓度。结论：党参总皂苷对缺血再灌注损伤后神经细胞的坏死和凋亡过程均具有抑制作用，这种作用可能与其能降低细胞内Ca^2+浓度有关，提示党参总皂苷是党参治疗脑卒中急性期的主要效应成分。     

甘精胰岛素干预游离脂肪酸诱导RIN-m细胞凋亡的变化

目的：观察甘精胰岛素对游离脂肪酸诱导的β细胞(RIN—m细胞)凋亡是否具有保护作用，并与普通胰岛素及胰岛素样生长因子1的干预效果进行对比。方法：本实验于2004—05／2004—10在中山大学附属第二医院林百欣医学科学研究中心完成。RIN—m细胞被培养并常规培养传代。诱导凋亡接种于6孔板或者96孔板后常规培养2d，待细胞长至70％满左右时，吸去培养基，加入含10g／L血清白蛋白，10mL／L乙醇，20mL／L胎牛血清的培养基(正常对照组)，或者含10g／L血清白蛋白，体积分数为0．01乙醇、体积分数为0．02胎牛血清和0．3mmol／L棕榈酸的培养基(凋亡对照组)，或者含10g／L牛血清白蛋白，体积分数为0．01乙醇、体积分数为0．02胎牛血清，0．3mmol／L棕榈酸以及100nmol／L甘精胰岛素(甘精胰岛素组)或者100nmol／L普通胰岛素(普通胰岛素组)或者10nmol／L胰岛素样生长因子1组的培养基，孵育24h后，将细胞接种于6孔板，诱导细胞凋亡。采用Hoechst33342染色、流式细胞仪以及酶联免疫吸附反应方法检测各组RIN-m细胞的凋亡，吸光度值代表细胞裂解液中核小体的数量，即DNA断裂的数量。结果：0．3mmol／L棕榈酸孵育后RIN-m细胞出现核皱缩、碎裂等典型凋亡表现。①甘精胰岛素组、普通胰岛素组、胰岛素样生长因子1组亚二倍体细胞比率[(32．00&;#177;3．08)％，(35．97&;#177;3．14)％，(25．25&;#177;1．66)％]明显高于正常对照组[(3．28&;#177;1．44)％](P&;lt;0．01)；但明显低于凋亡对照组(42．10&;#177;4．24)％(P&;lt;0．01)。②甘精胰岛素组、普通胰岛素组、胰岛素样生长因子1组细胞裂解液中核小体的数量(A值)(2．372&;#177;0．21，2．758&;#177;0．20，1．704&;#177;0．16)明显高于正常对照组(0．341&;#177;0．023)(P&;lt;0．01)；但明显低于凋亡对照组(3．333&;#177;0．23)(P&;lt;0．01)。甘精胰岛素组和胰岛素样生长因子1组裂解液中核小体的数量(A值)明显低于普通胰岛素组(P&;lt;0．05)。结论：甘精胰岛素对游离脂肪酸诱导的B细胞凋亡具有抑制作用，该种作用强于普通胰岛素。     

脑缺血预处理后Caspase-8蛋白的表达与神经元的保护作用

目的：探讨脑缺血预处理后凋亡相关基因Caspase-8蛋白表达与神经元保护作用的关系。方法：雄性Wistar大鼠70只，随机分为对照组（10只)、预处理组(10只)、缺血预处理组(25只)和缺血组(25只)。四血管阻断法复制全脑缺血模型，尼氏和TUNEL染色法观察脑皮质及海马CA1区神经元数和凋亡细胞数，免疫组化方法检测Caspase-8蛋白在缺血预处理后表达变化情况。结果：①缺血7d时，缺血预处理组皮质及海马CA1区神经元数无显著变化[(2.68&;#177;8．5)个／视野]，缺血组神经元数则显著减少[（135.0&;#177;5.6）个／视野]。②缺血预处理组Caspase-8蛋白缺血12h表达升高[(125.6&;#177;9.0)个／视野]，24h达高峰[(167.0&;#177;8.1)个／视野]：缺血组(caspase-8蛋白缺血6h表达升高[(154．2&;#177;18.4)个／视野]，12h达高峰[（222.8&;#177;17.1)个／视野]：各对应时点缺血组Caspase-8蛋白阳性表达细胞较缺血预处理组明显增多。③缺血预处理组和缺血组均在缺血12h皮质及海马CA1区凋亡细胞数开始增多[(15．5&;#177;2．1)，（39.8&;#177;3．9)个／视野]，缺血48h凋亡细胞数达高峰[(68.3&;#177;13.6），(328.4&;#177;24．0)个／视野]，但缺血组凋亡细胞数较缺血预处理组显著增多。结论：全脑缺血可能通过诱导Caspase-8蛋白的表达增多，启动细胞凋亡，导致缺血后神经元凋亡的发生，缺血预处理延缓并降低缺血后Caspase-8蛋白表达并减少细胞凋亡的发生可能是其神经元保护作用机制之一。     

刺五加皂甙对缺氧复氧性神经元损伤的保护作用

目的：从细胞分子水平研究刺五加皂甙(acanthopanax senticosus saponins，ASS)对培养神经元缺氧复氧损伤的保护作用及其机制。方法：取孕13～15d ICR胎鼠大脑皮质神经元进行原代分离培养，建立缺氧复氧诱导的皮质神经元损伤模型。随机分成正常对照组、缺氧复氧组及ASS组；用MTT法测定神经元存活率，用硝酸还原酶法测定细胞培养上清液中一氧化氮合酶(NOS)的含量，用流式细胞仪检测神经元凋亡率。结果：神经元缺氧2，4，6，8h复氧24h后，存活率分别为(0．604&;#177;0．022)％，(0．592&;#177;0．017)％，(0．543&;#177;0．037)％，(0．534&;#177;0．021)％；缺氧8h复氧24h后，神经元凋亡率由(4．13&;#177;0．87)％增加至(31．34&;#177;0．85)％，NOS含量由(5．23&;#177;0．28)μmoL／L增加至(11．39&;#177;0．21)μmoL／L(P&;lt;0．01)；ASS组神经元存活率、神经元凋亡率、NOS含量分别为(0．636&;#177;0．021)，(16．37&;#177;0．66)％，(8．02&;#177;0．18)μmoL／L，与缺氧8h复氧24h比较差异有非常显著性意义(P&;lt;0．01)。结论：ASS对缺氧复氧引起的神经元损伤有保护作用；ASS可能是通过抑制一氧化氮的释放、抑制神经元凋亡来拮抗神经元损伤。     

大鼠脑缺血再灌注后细胞间黏附分子1表达与白细胞浸润的关系及吲哚美辛的干预效应

目的：观察脑缺血2h再灌注不同时间点脑组织细胞间黏附分子1的表达与白细胞浸润的关系，并观察吲哚美辛对细胞间黏附分子1表达及白细胞浸润的影响。 方法：实验于2004-09／2005-03在大连医科大学附属第二医院中心实验室完成。取35只雄性SD大鼠随机分为假手术组5只、对照组25只，吲哚美辛组5只，对照组又分为缺血2h再灌注2，12，24，48．72h 5个亚组，每个亚组5只。①造模：采用线栓法制作大鼠大脑中动脉阻断模型，阻断大鼠大脑中动脉血流2h之后进行再灌注。②给药：吲哚美辛组在再灌注24h时灌胃给予吲哚美辛（按10mg／kg，溶于2mL生理盐水中），对照组中的再灌注24h亚组给予等容生理盐水。③观察指标：经免疫组化和苏木精-伊红染色，测定细胞间黏附分子1表达阳性微血管数和白细胞计数。 结果：35只大鼠均进入结果分析。①在脑缺血再灌注早期坏死区周围微血管内皮细胞表达细胞间黏附分子1即开始增多[再灌注2h：（15．94&;#177;1．90）个／视野，再灌注12h：（30．73&;#177;3．01）个／视野]，并于24h达高峰[（37．86&;#177;2．21）个／视野]，各对照亚组与假手术组[（0．68&;#177;0.69）个／视野]比较差异有显著性意义（P〈0．01），且各亚组间比较差异有显著性意义（P〈0．01）。②在脑缺血再灌注早期坏死区周围白细胞浸润即开始增多[再灌注2h：（2．30&;#177;0．91）个／视野，再灌注12h：（9．99&;#177;1．40）个／视野]，并于24h达高峰[（22．11&;#177;1．71）个／视野]，各对照组亚组与假手术组比较有显著性差异（P〈0．01），且各亚组两两比较组间差异有显著性意义（P〈0．01）。③细胞间黏附分子1表达与白细胞浸润的相关性分析表明两者之间呈正相关（r=-0．731，P〈0．01）。④吲哚美辛组细胞同黏附分子1表达及白细胞浸润计数[（16．01&;#177;11．43）个／视野，（10．55&;#177;2．64）个／视野1均低于再灌注24h亚组（P〈0．01）。 结论：脑缺血再灌注后细胞问黏附分子1可介导白细胞与内皮细胞的黏附；吲哚美辛可降低脑缺血再灌注后细胞间黏附分子1的表达和白细胞的浸润，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。     

钙三醇和甲状旁腺素对鼠心肌细胞凋亡的影响及机制

目的：研究甲状旁腺素(parathyroid hormone，PTH)对心肌细胞内游离钙和细胞凋亡的影响，以及钙三醇的修复作用。方法：利用培养的新生SD大鼠(n=25)心肌细胞，以F1uo-3／AM负载，通过激光共聚焦显微镜测定细胞内游离钙浓度([Ca^2+],)；采用透射电镜和流式细胞仪观察细胞凋亡的变化。结果：PTH1-34 0．01μmol／L和0．1μmol／L刺激7d后，心肌细胞内钙荧光强度分别为186．0&;#177;43．6，217．9&;#177;22．2，、细胞凋亡率分别为(6．97&;#177;1．00)％和(12．58&;#177;1．75)％较对照组[(77．7&;#177;19．9)％，(0．12&;#177;0．11)％]显著增加，差异有显著性意义(F=158．52,54．19．P&;lt;0．01)。若以PTH1-34 0．1 μol／L刺激，并同时加入0．001μmol／L的钙三醇干预上述指标明显降低[分别为(114．3&;#177;29．9)％，(3．43&;#177;0．40)％]，差异有显著性意义(F=158．52，54．19，P&;lt;0．01)；但同时应用0．1μmol／L钙三醇干预，则无显著改善。结论：PTH1-34可以浓度依赖性增加心肌细胞内[Ca^2+]i，诱导细胞肥大和凋亡；适宜浓度的钙三醇干预，具有修复作用。     

糖尿病大鼠椎间盘组织中戊糖甙素与细胞凋亡的关系

背景：细胞凋亡可能是引起椎间盘细胞减少的一个主要因素。但是关于诱导椎间盘细胞凋亡的生物学因素还不清楚。目的：通过观察糖尿病大鼠椎间盘细胞凋亡情况，探讨可能与凋亡有关的因素。设计：随机对照的实验研究。地点和对象：实验地点在上海九院实验动物中心和上海第二医科大学生物物理教研室完成。36只雄性SD大鼠(4月龄)，购自中科院上海实验动物中心，平均体质量244go按随机数字表法分为2组，每组18只。千顶措施：处理组用腹腔单次注射链脲佐菌素溶液(streptozotocin，STZ，40mg／kg)造成糖尿病。正常对照组，仅给予等量的柠檬酸缓冲液。72h后测定大鼠的血糖，血糖在16．0mmol／L以上者确定为糖尿病。分别在第1，3，4个月时每组各取6只大鼠处死，取其腰椎间盘组织，进行测定。主要观察指标：用流式细胞术检测椎间盘细胞凋亡情况。用高效液相层析法测定椎间盘组织中戊糖甙素含量变化。结果：处理组大鼠在注射STZ溶液后，血糖水平均高于16．0mmol／L[(23．71&;#177;2．69)mmol／L]。在不同时期，糖尿病大鼠组椎间盘细胞凋亡率(％)分别是18．52&;#177;4．81，18．74&;#177;5．13，19．41&;#177;5．22，明显高于同期对照组4．59&;#177;2．24，9．38&;#177;2．37，10．78&;#177;3．86(P&;lt;0．05)，糖尿病大鼠椎间盘组织中戊糖甙素含量(nmol／g)分别是33．53&;#177;5．88，37．03&;#177;12．77，36．53&;#177;11．95，明显高于同期对照组13．87&;#177;3．30，13．60&;#177;2．56，15．33&;#177;4．04(P&;lt;0．05)。椎间盘组织中戊糖甙素含量与椎间盘细胞凋亡率之间呈正相关性(r=0．857-0．970，P&;lt;0．05)。结论：糖尿病大鼠椎间盘细胞凋亡明显增加。戊糖甙素等糖基化终末产物可能是促进椎间盘细胞凋亡的因素之一。     

姜黄素改善肺癌A549细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体抵抗的机制

目的：观察中药提取物姜黄素联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对肺癌细胞株A549生长抑制率和对细胞凋亡相关因子表达的影响，探索姜黄素改善肺癌A549细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体抵抗的机制。方法：实验于2003—10／2004-10在上海东方医院中心实验室完成。用购于中科院上海细胞所肺腺癌细胞株A549，将培养的A549细胞暴露于姜黄素、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及两者联合中，分4组，每组6孔，姜黄素组（40μmol／L姜黄素）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体组（25μg／L肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）、联合组（40μmol／L姜黄素与25μg／L肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体联合）、对照组（RPMI1640细胞培养液）。①用四氮唑蓝法测定姜黄素组、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体组以及联合组的吸光值，根据吸光度值计算肺癌细胞株A549细胞生长抑制率。②应用ApoAlert半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶系列比色法凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8表达。③反转录聚合酶链反应测定凋亡调控蛋白bel-2／bax的表达。结果：①抑制率：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对肺腺癌A549细胞的抑制明显低于姜黄素，25μg／L肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体作用24h细胞抑制率仅有（2．65&;#177;1．416）％；两药联合对肺腺癌A549细胞的抑制作用明显增加[高达（30．97&;#177;1．318）％，P〈0.011。②凋亡相关因子：联合组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8表达明显高于姜黄素组、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体组、对照组[联合组：（50．77&;#177;0．812），（73．31&;#177;0.730）μmol／L；姜黄素组：（23．61&;#177;0.398），（26．84&;#177;1．511）μmol／L；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体组：（9．63&;#177;1．024），（14．21&;#177;0．138）μmol／L；对照组：（3．69&;#177;0．486），（2．87&;#177;0．633）μmol／L，P〈0.011；联合组、姜黄素组的bel-2／bax明显高于肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体组（2．55&;#177;0．138，2．24&;#177;0．197，0．58&;#177;0．046，P〈0．01）。结论：肺癌A549细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞耐受，姜黄素可能通过调整bcl-2／bax的表达，进而激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族，增加肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的敏感性。     

胰岛素对大鼠脑缺血再灌注时神经元凋亡及其相应基因的调控

目的 观察胰岛素（insulin,RI)对缺血再灌注损伤后细胞凋亡及其相应基因的调控作用。评估RI对脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法 将健康wistar大鼠56只，随机分为对照组、缺血再灌注盐水组(NS)、缺血再灌注胰岛素组(RI)。采用pulsinelli4血管阻塞模型，观察RI、NS在4．24，48h海马CA1区存活神经元数目，TUNEL阳性细胞数目，Bcl-2蛋白的表达，以观察比较缺血再灌注阶段细胞凋亡的变化。结果 再灌注NS组CA1区神经元数目(36&;#177;6)个／mm^2较再灌注RI组(88&;#177;9)个／mm^2少(t=3．34，P&;lt;0．01)。再灌注后CA1区细胞凋亡数：4h时再灌注NS组(12&;#177;3)个／mm^2高于再灌注RI(8&;#177;1)个／mm^2和假手术组(2&;#177;1)个／mm^2：组间比较，F=127．66，P&;lt;0．001。Bcl-2对海马CA1细胞凋亡评估4h时。再灌注NS组43．0&;#177;9．8,高于再灌注RI组24．0&;#177;5．4和假手术组2．7&;#177;0．8。结论 全脑缺血再灌注时急用RI可减轻脑缺血再灌注神经元凋亡,对脑缺血再灌注损伤引起的神经元延迟性坏死有保护作用。     

牛磺酸对经单细胞凝胶电泳技术检测人视网膜色素上皮氧化损伤的保护特征

目的：观察过氧化氢对人视网膜色素上皮细胞的氧化作用，以及牛磺酸对人视网膜色素上皮细胞的抗氧化作用。 方法：实验于2005—01／09在哈尔滨医科大学公共卫生学院中心实验室完成。①人眼视网膜色素上皮细胞来源：实验眼来自20—35岁男性意外死亡后12h内捐给黑龙江省眼库作为角膜移植的供体眼5眼，家属签署知情同意书。取8-10代人眼视网膜色素上皮细胞用于实验. ②过氧化氢损伤实验：将培养的细胞按随机数字表法分为5组：过氧化氢各浓度组分别加入终浓度为10，25，50，100μmol／L的过氧化氢，阴性对照组只加入等量的磷酸盐缓冲液。③牛磺酸实验：将培养的细胞按随机数字表法分为5组：阴性对照组用不含血清的DMEM-F12培养液培养，牛磺酸各浓度组分别用含有终浓度为300和600μmol／L的牛磺酸培养液进行培养。将上述每个浓度组的细胞悬液分成2份，向其中1份加入终浓度为25μmol几的过氧化氢，另一份加入等量的磷酸盐缓冲液。④指标检测：15min后，用单细胞凝胶电泳法检测人视网膜色素上皮细胞的DNA损伤的程度，以拖尾率（彗星细胞数／总细胞数）和拖尾细胞DNA迁移距离[400倍显微镜下测量25个拖尾细胞的DNA迁移长度，整个核DNA直径和迁移DNA（即彗星尾）长度，其差值为DNA迁移距离]的变化表示。⑤统计学分析：用四格表x^2检验（确切概论法）比较组间彗星细胞拖尾率；用t检验进行组间DNA迁移距离比较。 结果：①过氧化氢损伤实验结果：阴性对照组DNA荧光图像为红色圆球形，过氧化氢各组出现彗星样，随着过氧化氢浓度（10，25，50，100μmol／L）的增加，人视网膜色素上皮细胞拖尾率和DNA迁移距离均明显高于或长于阴性对照组[拖尾率：4．6％，26．0％，43．3％，86．6％，96．0％；DNA迁移距离：（4．13&;#177;0．52），（10．54&;#177;2．03），（20．59&;#177;4．42），（39．56&;#177;10．28），（51．54&;#177;15．93）μm，P〈0．01]。②牛磺酸实验结果：300和600μmol／L牛磺酸组视网膜色素上皮细胞拖尾率和拖尾细胞DNA迁移距离与阴性对照组相近（P〉0．05）。300和600μmol／L牛磺酸＋25μmol／L的过氧化氢组均明显低于或短于25μmol／L过氧化氢组[拖尾率：22．6％，20．0％，43．3％；DNA迁移距离：（17．46&;#177;7．13），（13．56&;#177;2．52），（20．59&;#177;4．42）μm，P〈0．05]，且牛磺酸浓度越高，差异越大。 结论：10μmol／L过氧化氢就能对人视网膜色素上皮细胞直接造成DNA断裂损伤，该作用呈剂量依赖性。适量的牛磺酸（300和600μmol／L）对人视网膜色素上皮细胞DNA的氧化断裂损伤起保护作用，该作用也呈剂量依赖性     

实验性大鼠急性脑缺血细胞凋亡与相关蛋白表达的关系

目的：研究大鼠脑缺血再灌注后细胞凋亡及p53，Bcl-2蛋白家族表达的变化，并探讨它们在细胞凋亡中的作用。方法：实验在华北煤炭医学院形态实验室完成。54只大鼠用随机数字表法随机分成3组：脑缺血组(42只)、假手术组(6只)和正常组(6只)。脑缺血组又分为7组：即缺血2h再灌注1，3，6，12，24，48和72h组(n=6)。采用线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型，用TUNEL法检测细胞凋亡的变化，用免疫组化法检测p53，Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。结果：①缺血2h再灌注1h皮质区可见凋亡细胞[(7．83&;#177;1．72)个／高倍视野]，24～48h达高峰[(43．33&;#177;5．20)个／高倍视野，(48．50&;#177;6．25)个／高倍视野]，72h开始下降[(26．67&;#177;3．56)个／高倍视野](P&;lt;0．05，P&;lt;0．01)；缺血2h再灌注1h皮质区可见p53蛋白阳性细胞[(14．35&;#177;1．92)个／高倍视野]，24h达高峰[(48．00&;#177;6．42)个／高倍视野]，48h后开始下降[(31．00&;#177;6．60)个／高倍视野](P&;lt;0．05，P&;lt;0．01)；缺血2h再灌注1h皮质区可见Bcl-2蛋白阳性细胞[(28．62&;#177;6．80)个／高倍视野]，3h达高峰[(56．50&;#177;7．87)个／高倍视野]，6h后开始下降[(45．00&;#177;6．63)个／高倍视野](P&;lt;0．01)；缺血2h再灌注1h皮质区可见Bax蛋白阳性细胞[(45．83&;#177;4．07)个／高倍视野]，24h达高峰[(61．00&;#177;8．88)个／高倍视野]，48h开始逐渐下降[(45．83&;#177;6．49)个／高倍视野](P&;lt;0．05，P&;lt;0．01)。②缺血再灌注后不同时间点细胞凋亡数与p53及Bax蛋白的阳性表达数呈正相关(r=0．843，P&;lt;0．001；r=0．840，P&;lt;0．001)，与Bcl-2蛋白的阳性表达数呈负相关(r=-0．387，P&;lt;0．05)。结论：大鼠脑缺血再灌注后，缺血周边区发生明显的细胞凋亡，同时伴有p53及Bax蛋白表达增加及Bcl-2表达降低，p53及Bax蛋白表达对细胞凋亡起促进作用，而Bcl-2蛋白表达则对细胞凋亡起抑制作用。     

幼鼠持续惊厥状态脑损伤时托吡酯的神经保护作用

目的：研究托吡酯对惊厥性脑损伤是否具有保护作用。方法：制作毛果芸香碱惊厥持续状态动物模型，给予托毗酯干预，检测海马区神经元坏死、凋亡、凋亡蛋白表达和胶质细胞增生变化情况。结果：毛果芸香碱惊厥持续状态模型鼠病理损伤特点为神经元坏死、细胞凋亡、凋亡蛋白表达增多，胶质细胞增生。托吡酯可减少海马区细胞坏死：CA3区坏死细胞百分比由(72．1&;#177;13．4)％降至(20．6&;#177;7．2)％(P&;lt;0．05)；CA1区由(67．1&;#177;9．3)％降至(18．3&;#177;4．8)％(P&;lt;0．05)；减少细胞凋亡：CA1区单位面积凋亡细胞数由9．4&;#177;6．1降至1．7&;#177;0．8(P&;lt;0．05)；减少凋亡蛋白表达：单位面积caspase-3阳性面积由1．49&;#177;0．25降至0．71&;#177;0．12(P&;lt;0．05)；缓解胶质细胞增生：单位面积胶质细胞数由47．3&;#177;3．6降至19．5&;#177;3．9(P&;lt;0．05)。结论：托吡酯对幼鼠惊厥性神经变性，可减少神经的死亡和凋亡，缓解胶质细胞增生。     

促红细胞生成素对大鼠脑组织缺血再灌注海马CA1区神经元的作用

目的：观察促红细胞生成素对缺血再灌注大鼠脑组织海马CA1区神经元数量以及凋亡细胞数量变化、热休克蛋白70表达的影响。方法：实验于2003—03／2004-12在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成。选择健康清洁级Wistar大鼠66只，随机分为正常对照组6只、缺血再灌注生理盐水组30只(生理盐水对照组)、缺血再灌注促红细胞生成素组30只(促红细胞生成素治疗组)。线栓法制备大鼠大脑中动脉阻断局灶性脑缺血模型，缺血2h后再灌注，促红细胞生成素治疗组经腹腔按200U／b注入生理盐水稀释的重组人红细胞生成素(200U／mL)，生理盐水对照组经腹腔注入等量的生理盐水。再灌注后观察时相点为2，6，12，24，48h，应用苏木精-伊红染色观察脑海马CA1区细胞数量情况，应用末端脱氧核苷酸转移酶缺口标记法检测海马CA1区神经元凋亡情况，应用免疫组织化学法测定热休克蛋白70表达情况。结果：66只大鼠全部进入结果分析。①脑海马CA1区细胞的计数：生理盐水对照组再灌注后12，24，48h比正常对照组细胞数明显减少[(268．6&;#177;44．5)个／视野。(240．8&;#177;22．5)个／视野，(201．8&;#177;30．7)个／视野，(337．3&;#177;45．3)个／视野，t=2．845—5．587，P&;lt;0．01]，促红细胞生成素治疗组再灌注后12，24，48h比生理盐水对照组细胞数明显增加[(286．7&;#177;33．8)个／视野，(271．9&;#177;30．4)个／视野，(258．3&;#177;29．5)个／视野，t=3．189—5．589，P&;lt;0．01]。②脑海马CA1区凋亡细胞计数：生理盐水对照组再灌注后2，6，12，24、48h比正常对照组脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记阳性细胞数明显增多[(16．5&;#177;3．5)个／视野，(28．4&;#177;6．5)个／视野，(48．8&;#177;7．6)个／视野，(60．7&;#177;10．2)个／视野，(81．6&;#177;12．3)个／视野，(8．8&;#177;2．1)个／视野，t=2．985—6．324，P&;lt;0．01]，促红细胞生成素治疗组再灌注后2，6，12，24，48h比生理盐水对照组脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记阳性细胞数明显减少[(12．7&;#177;3．4)个／视野，(21．5&;#177;5．8)个／视野，(32．7&;#177;4．6)个／视野，(42．8&;#177;6．6)个／视野，(51．8&;#177;9．5)个／视野，t=3．457—6．347，P&;lt;0．01]。③脑海马CA1区热休克蛋白70表达水平：生理盐水对照组再灌注后2，6，12，24，48h比正常对照组热休克蛋白70表达明显增多(0．264&;#177;0．027，0．328&;#177;0．053，0．475&;#177;0．067，0．587&;#177;0．095，0．512&;#177;0．063，0．225&;#177;0．024，t=3．254—6．028，P&;lt;0．01)，促红细胞生成素治疗组再灌注后2，6，12h比生理盐水对照组热休克蛋白70表达明显增多(0．335&;#177;0．033，0．448&;#177;0．055，0．647&;#177;0．078，t=3．262—5．483．P&;lt;0．01)。结论：促红细胞生成素治疗可增加大鼠局灶性脑缺血再灌注组织海马CA1区细胞存活数量，对海马CA1区细胞凋亡具有阻抑作用，使热休克蛋白70表达上调，从而起到了对神经细胞的保护作用。