不同产地壳聚糖纳米粒体外抗肿瘤作用的比较

目的:由于不同产地、来源的壳聚糖产品,其化学结构可能不同,因而生物学效应也会不同。将纳米技术引入壳聚糖研究,通过体外抗肿瘤细胞增殖抑制试验,比较不同来源壳聚糖纳米粒制剂的体外抗肿瘤活性。方法:实验于2006-10/2007-06在浙江省医学科学院生物工程研究所完成。①实验材料:肝癌SMMC-7721、胃癌BGC-823、宫颈癌Hela和乳腺癌MCF-7细胞株从中国科学院上海细胞所引入,由本研究所液氮保存。A壳聚糖由浙江金壳生物化学有限公司提供(批号:YK060329131);B壳聚糖由浙江奥兴生物科技有限公司提供(批号:200603200);C壳聚糖由青岛利中甲壳原公司提供(批号:020622)。②细胞培养:4种肿瘤细胞株均用含10%新生牛血清的DMEM培养基,在体积分数为0.05的CO2的37℃培养箱中培养,2.0～3.0d传代1次。③壳聚糖纳米粒制备:A,B,C壳聚糖应用离子交联法制备相应壳聚糖纳米粒,其纳米粒径分别为228,228和218nm。④MTT法测定壳聚糖纳米粒体外抗肿瘤活性:按3种壳聚糖纳米粒类别和4个质量浓度梯度设壳聚糖纳米粒组(62.5,125,250,500mg/L)、阳性对照组(氟尿嘧啶500mg/L)和阴性对照组(DMEM培养液),按常规方法进行MTT实验。结果:不同产地壳聚糖制备的A,B,C纳米粒分别作用于SMMC-772细胞,其500mg/L剂量组的生长抑制率分别为9.93%,7.91%和25.76%;作用于BGC-823细胞,其生长抑制率分别为8.96%,6.68%和29.94%;作用于Hela细胞,其生长抑制率分别为9.50%,9.23%和27.16%;作用于MCF-7细胞,其生长抑制率分别为7.56%,8.64%和52.86%。而抗肿瘤药物氟尿嘧啶500mg/L对SMMC-7721、BGC-823、Hela和MCF-7细胞生长抑制率分别为79.36%,78.83%、78.70%和82.20%。结果显示,A,B壳聚糖纳米粒对体外培养的SMMC-772、BGC-823、Hela、MCF-7细胞的抑制作用较弱,而C壳聚糖纳米粒对上述4种肿瘤细胞均具有较强的抑制作用,尤其对MCF-7细胞生长抑制作用最强。结论:体外实验条件下,壳聚糖纳米粒均显示一定的抗肿瘤活性。不同产地壳聚糖制备的纳米粒,其抗肿瘤活性存在明显的差异,并且壳聚糖纳米粒抗肿瘤活性具有一定的肿瘤细胞选择性。     

聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒的表面修饰和转染

背景:聚氰基丙烯酸烷基酯在人体内极易生物降解,且对许多组织具有生物相容性,近年来一直受到国内外医药界的广泛关注.目的:比较不同表面修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒的物理化学性质,并考察它们体外基因转染活性.设计、时间及地点:对比观察实验,于2007-09/12在中南大学卫生部纳米生物技术重点实验室完成.材料:采用乳化聚合的方法制备表面分别修饰壳聚糖、葡聚糖和氨基化的聚乙二醇的聚氰基丙烯酸正,‘酯纳米颗粒.方法:透射电镜观察粒径大小、纳米粒形态;Zetasizer Nano system电位分析仪测定Zeta电位;MTT法检测纳米粒的细胞毒性;用流式细胞仪考察纳米粒的体外转染效率.主要观察指标:纳米粒的表面电位、粒径、细胞毒性及其转染效率.结果:成功制备了粒径约200 nm左右,表面电位分别为25.53,-17.42和0.293 5 mV的壳聚糖、葡聚糖和氨基化的聚乙二醇修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒,且0.1 g/L的质量浓度对HepG2细胞无明显毒性,带正电的壳聚糖修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒的转染效率明显高于葡聚糖和氨基化的聚乙二醇修饰的纳米粒.结论:聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒经表面修饰不同物质后可以带上正电、负电及中性电荷,而壳聚糖修饰的纳米粒能有效地将基因递送到细胞内,并且报告基因能在细胞内表达.因此,可用做基因递送的载体.     

负载紫杉醇壳聚糖纳米粒的制备、表征与释药性能

背景:紫杉醇是一种天然抗肿瘤药物,但其水溶性极低.壳聚精经接枝改性,生成的共聚物可在液相中生成纳米粒,可用于药物的缓释和控释.目的:对制备的负载紫杉醇的壳聚糖纳米粒进行表征,分析其体外药物释放能力.设计、时间及地点:重复测餐设计,于2008-01/07在华北煤炭医学院医学系实验室完成.材料:壳聚糖,平均相对分子质量为2.0X 105,脱乙酰度为92%,为浙江省玉环海洋生物化学有限公司产品.紫杉醇,批号082329802,为中国药品生物制品检定所产品.方法:采用引发接枝效率高、引发反应条件温和的二羟基二过碘酸合镍钾为引发剂,在壳聚糖上接枝醋酸乙烯酯,该聚合物在水溶液中直接生成具有疏水核心、亲水表面的纳米粒,即壳聚糖纳米粒,再利用超声振荡技术将0.5～5.0 mg紫杉醇与上述纳米粒混合制成负载紫杉醇的壳聚糖纳米粒.主要观察指标:激光粒度分析仪测定纳米颗粒的粒径大小、粒径分布及Zeta电位,透射电镜观察纳米颗粒的外观形态,高效液相色谱法分析负载紫杉醇的壳聚糖纳米粒的包封率、载药量和释药性能.结果:壳聚糖纳米粒和负载紫杉醇的壳聚糖纳米粒,其粒径分别为196.2 nm和320.8 nm,粒径分布较窄,纳米粒表面均带正电荷,Zeta电位比较差异无显著件意义(F=0.818,F=-3.38,P均0.05).稳定的纳米粒呈球形,粒径均匀.紫杉醇的加入量可影响纳米粒的包封率,紫杉醇的加入量为纳米粒的量2%时,达到最大包封率93.6%.体外模拟释药结粜表明药物释放曲线分为两个阶段,突释阶段微球释药量在24 h内达48.3%,缓释阶段微球释药持续时间长,在175 h时释药量达75.9%.载药纳米粒的药物释放速率持续稳定.结论:接枝共聚法制备壳聚糖纳米粒简便可靠,负载紫杉醇后纳米粒径明显变大,表面带有正电荷,且纳米粒对紫杉醇有很高的包封率.体外释药具有明显的缓释作用.     

壳聚糖-DNA纳米粒对肿瘤细胞的转染效率

背景非病毒载体具有低毒,低免疫反应,靶向性和易于组装等优点已成为目前研究基因转染的热点.目的评价壳聚糖-DNA纳米粒对肿瘤细胞的转染效率和细胞毒性.设计观察对比实验.单位华中科技大学同济医学院环境医学研究所.材料Zeta电位/粒度分析仪;荧光分光光度计;Hoechst 33258;PLPS-3'EGFP质粒;肺癌细胞A549和人肝癌细胞HepG2.方法实验于2004-12/2005-12在华中科技大学同济医学院环境医学研究所完成.用绿色荧光蛋白基因做报告基因,复凝聚方法制备壳聚糖绿色荧光蛋白质粒纳米粒.②采用扫描电镜观察制备的纳米粒形态;Zeta电位/粒度分析仪测量纳米粒的粒径和表面电位;酶保护试验检测纳米粒的抗DNA酶降解性能.③体外转染人肝癌细胞Hep G2和肺癌细胞A549.分别在24,48和72 h后在倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况.④纳米粒细胞毒性分析采用四甲基偶氮唑盐试验.主要观察指标①纳米粒的包封率与理化特征.②纳米粒的细胞转染效率.③纳米粒的细胞毒性.结果①纳米粒的包封率与理化特征壳聚糖纳米粒的核酸包封率为91.7%,纳米粒多呈球形,平均粒径149 nm,表面电位+20.5 mV.壳聚糖纳米粒能保护DNA不受DNA酶Ⅰ降解.②纳米粒的细胞转染效率48 h后转染率达到高峰,A549转染率为95%;而HepG2只有10%左右.③纳米粒的细胞毒性纳米粒和壳聚糖溶液均能抑制HepG2和A549生长,壳聚糖溶液对细胞生长的抑制作用强于纳米粒.结论壳聚糖质粒纳米粒能转染HepG2和A549两种肿瘤细胞,且对两种肿瘤细胞的生长有抑制作用,提示壳聚糖纳米粒能作为DNA的载体,用于肿瘤细胞的转染.     

构建新型液态氟碳壳聚糖纳米超声造影微粒

目的 构建一种新型天然高分子聚合物纳米超声造影微粒,表征其理化特征、体外显像效果及其对肿瘤细胞的结合能力和毒性。 方法 采用超声乳化法制备包裹液态氟碳PFOB的壳聚糖(CTS)纳米粒和FITC标记的壳聚糖纳米粒(FITC-CTS),表征其表面形态、粒径、Zeta电位和稳定性;评价纳米粒的体外超声显像效果,以激光共聚焦观察FITC-CTS与细胞的结合作用,流式细胞仪检测FITC-CTS对细胞的黏附比例。 结果 制备的纳米粒形态圆整,CTS纳米粒平均粒径为(248.52±7.96)nm,Zeta电位为+(29.91±0.64)mV,FITC-CTS纳米粒平均粒径为(244.83±2.72)nm,Zeta电位为+(22.21±0.53)mV。纳米粒性质稳定,在体外能增强超声显影,激光共聚焦观察到纳米粒聚集在细胞膜周围,流式细胞仪测得纳米粒对细胞的黏附比例为(45.15±8.35)%。 结论 构建的CTS纳米粒性质稳定,体外能与肿瘤细胞MCF-7紧密结合,增强超声回声。     

改良自乳化溶剂扩散法制备MePEG-PLA纳米粒对成骨细胞的毒性

背景:两亲性嵌段聚合物由于其较强的载药能力强、纳米级大小、血液中长循环等优点在载药系统中得到广泛的应用。目的:评估改良自乳化溶剂扩散法制备的甲氧基封端的聚乙二醇-聚乳酸(MePEG-PLA)纳米粒对人骨肉瘤细胞MG63的毒性。方法:通过改良自乳化溶剂扩散法制备MePEG-PLA纳米粒,MTS法测定纳米粒培养1,2,3d后对MG63的毒性。激光粒度分析仪测定纳米颗粒的粒径大小、粒径分布及Zeta电位;透射电镜表征纳米胶束外观形态;酶标仪检测培养1,2,3d细胞吸光度值。结果与结论:MePEG-PLA纳米粒的平均粒径为25.7nm,分布均匀,呈球形,Zeta电位为-8.06mV,MePEG-PLA毒性为0级。提示改良自乳化溶剂扩散法制备纳米粒简单易行,制备的纳米粒无毒,具有良好的应用前景。     

壳聚糖-DNA纳米粒对肿瘤细胞的转染效率

背景：非病毒载体具有低毒，低免疫反应，靶向性和易于组装等优点已成为目前研究基因转染的热点。目的：评价壳聚糖-DNA纳米粒对肿瘤细胞的转染效率和细胞毒性。设计：观察对比实验。单位：华中科技大学同济医学院环境医学研究所。材料：Zeta电位／粒度分析仪；荧光分光光度计；Hoechst 33258；PLPS-3’EGFP质粒；肺癌细胞A549和人肝癌细胞HepG2。方法：实验于2004—12／2005—12在华中科技大学同济医学院环境医学研究所完成。用绿色荧光蛋白基因做报告基因，复凝聚方法制备壳聚糖绿色荧光蛋白质粒纳米粒。②采用扫描电镜观察制备的纳米粒形态；Zeta电位／粒度分析仪测量纳米粒的粒径和表面电位；酶保护试验检测纳米粒的抗DNA酶降解性能。③体外转染人肝癌细胞HepG2和肺癌细胞A549。分别在24，48和72h后在倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况。④纳米粒细胞毒性分析采用四甲基偶氮唑盐试验。主要观察指标：①纳米粒的包封率与理化特征。②纳米粒的细胞转染效率。③纳米粒的细胞毒性。结果：①纳米粒的包封率与理化特征：壳聚糖纳米粒的核酸包封率为91．7％，纳米粒多呈球形，平均粒径149nm，表面电位＋20．5mV。壳聚糖纳米粒能保护DNA不受DNA酶Ⅰ降解。②纳米粒的细胞转染效率：48h后转染率达到高峰，A549转染率为95％；而HepG2只有10％左右。③纳米粒的细胞毒性：纳米粒和壳聚糖溶液均能抑制HepG2和A549生长，壳聚糖溶液对细胞生长的抑制作用强于纳米粒。结论：壳聚糖质粒纳米粒能转染HepG2和A549两种肿瘤细胞，且对两种肿瘤细胞的生长有抑制作用，提示壳聚糖纳米粒能作为DNA的载体．用于肿瘤细胞的转染。     

改良自乳化溶剂扩散法制备MePEG-PLA纳米粒对成骨细胞的毒性

背景：两亲性嵌段聚合物由于其较强的载药能力强、纳米级大小、血液中长循环等优点在载药系统中得到广泛的应用。目的：评估改良自乳化溶剂扩散法制备的甲氧基封端的聚乙二醇-聚乳酸（MePEG-PLA）纳米粒对人骨肉瘤细胞MG63的毒性。方法：通过改良自乳化溶剂扩散法制备MePEG-PLA纳米粒,MTS法测定纳米粒培养1,2,3d后对MG63的毒性。激光粒度分析仪测定纳米颗粒的粒径大小、粒径分布及Zeta电位;透射电镜表征纳米胶束外观形态;酶标仪检测培养1,2,3d细胞吸光度值。结果与结论：MePEG-PLA纳米粒的平均粒径为25.7nm,分布均匀,呈球形,Zeta电位为-8.06mV,MePEG-PLA毒性为0级。提示改良自乳化溶剂扩散法制备纳米粒简单易行,制备的纳米粒无毒,具有良好的应用前景。     

壳聚糖转运针对TNFα siRNA的可行性及其对于炎症因子抑制效应的初步研究

目的:初步探索壳聚糖/si RNA纳米颗粒应用于炎症性肠病的可行性。方法:应用直接混合法将壳聚糖溶液与si RNA按照N/P比为60混合形成壳聚糖/si RNA纳米颗粒,采用Zetasizer粒度仪对纳米颗粒直径进行检测,扫描电镜观察其形态以及透射电镜观察其结构;将纳米粒与RNA酶孵育后采用2%琼脂糖凝胶电泳分析其保护作用;采用细菌脂多糖(lipopolysacchar ides,LPS)对小鼠巨噬细胞系RAW264.7进行炎症因子诱导后进行体外实验,荧光显微镜观察其转染效率,采用针对TNFα的si RNA进行转染,Taq Man荧光定量PCR和ELISA对TNFα的表达进行定量分析;利用MTT方法对转染后的细胞进行活力测试。结果:壳聚糖/si RNA纳米粒形态较为均一,粒径在200 nm左右;壳聚糖能够与si RNA形成可逆性结合,保护si RNA不被酶降解长达120 min以上;该纳米粒能够高效率的实现对巨噬细胞的转染;纳米粒转染后对LPS诱导巨噬细胞分泌大量的TNFα起到显著的抑制作用,效率高达50%以上,且细胞活性没有明显改变。结论:壳聚糖/si RNA纳米粒系统能够有效的转染巨噬细胞,实现对炎症因子TNFα的抑制作用,为炎症性肠病的分子治疗提供了一定的参考价值。     

包裹pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒的制备及其特性

背景:裸质粒DNA在基因治疗中因带负电荷,易被体内核酸酶降解,故无法实现有效转染,壳聚糖是自然界存在的可降解性阳离子多聚糖,能有效防止DNA被核酸酶降解,提高转染效率.目的:采用复凝聚法制备包裹pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒,观察其相关特性.设计、时间及地点:对比观察实验,于2009-02/08在国家卫生部纳米生物技术重点实验室完成.材料:pCDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70由国家卫生部纳米生物技术重点实验室构建,壳聚糖(批号060306,脱乙酰度>90.0%,黏度<100 mPa·s)由上海伯奧生物科技有限公司提供,B16细胞由中南大学肿瘤研究所惠赠.方法:采用复凝聚法制备包裹pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒,将壳聚糖基因纳米粒转染B16细胞,利用反转录-聚合酶链反应检测体外转染效果;应用噻唑蓝评价壳聚糖基因纳米粒子的体外细胞毒性.主要观察指标:激光粒度仪测定壳聚糖基因纳米粒径、Zeta电位;紫外分光光度计检测包封率;凝胶阻滞实验观察壳聚糖和质粒DNA的聚合;DNase I的保护试验分析壳聚糖基因纳米粒抗核酸酶降解能力.结果:壳聚糖基因纳米粒的平均粒径约为223 nm,Zeta电位为16 mV;DNA包封率为92.3%,B16细胞转染实验显示其效率与Lipofectamine 2000相近,而其毒性远低于Lipofectamine 2000.结论:壳聚糖纳米粒子可高效装载质粒DNA转染B16细胞,而且对细胞基本无毒.