机械应力调控软骨细胞炎症反应中长链非编码RNA的机制研究

目的探讨机械应力调控软骨细胞炎症反应的作用机制。 方法体外分离培养新生SD大鼠软骨细胞,经白介素-1β（IL-1β）干预构建软骨细胞炎症模型,设置对照组（IL-1β）、2000μstrain组（2000μstrain应力+IL-1β）、5000μstrain组（5000μstrain应力+IL-1β）,IL-1β浓度为5ng/ml,以1Hz应力干预2h。采用Real-time PCR和Western Blot检测Ⅱ型胶原（Col-2）、基质金属蛋白酶13（MMP13）、自噬标记蛋白LC3、Beclin-1及m-TOR表达,同时检测MEG3表达,采用免疫荧光染色检测自噬小体形成;si-RNA沉默MEG3后,采用Real-time PCR检测LC3及Beclin-1表达。 结果2000μstrain组软骨细胞Col-2、LC3、Beclin-1基因及Beclin-1蛋白表达量均较对照组及5000μstrain组明显上调（P<0.05）;2000μstrain组软骨细胞MEG3基因表达量较对照组及5000μstrain组明显下调（P<0.05）;5000μstrain组m-TOR蛋白表达较对照组及2000μstrain组明显增加（P<0.05）;应力组自噬标记蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ相对表达量均较对照组明显减少（P<0.05）;免疫荧光染色显示2000μstrain组自噬小体形成较对照组及5000μstrain组明显增加,5000μstrain组自噬小体形成较对照组及2000μstrain组明显减少（P<0.05）;si-RNA沉默MEG3后,发现LC3及Beclin-1表达量均明显增加（P<0.05）。 结论机械应力可影响软骨细胞LncRNA-MEG3表达,从而调控炎症环境中软骨细胞自噬水平。     

双歧杆菌的脂磷壁酸对巨噬细胞MAPK的影响

目的探讨双歧杆菌的脂磷壁酸(LTA)对巨噬细胞丝裂源活化蛋白激酶(MAPK)活性的影响。方法选取6~8周龄巴比赛(BALB/c)小鼠90只,按随机数字表达法分为九组,每组10只,A组腹腔注射磷酸缓冲盐溶液(PBS);B组腹腔注射LTA;C组腹腔注射LTA+细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂;D组腹腔注射LTA+c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂;E组腹腔注射LTA+p38抑制剂;F组腹腔注射LTA+ERK及JNK抑制剂组;G组腹腔注射LTA+ERK及P38抑制剂组;H组腹腔注射LTA+JNK及P38抑制剂;I组腹腔注射LTA+3种抑制剂。九组小鼠注射5d,每天注射1次,饲养7d后,处死全部小鼠,采用免疫印迹法检测九组小鼠腹腔巨噬细胞MAPK家族中ERK1/2、p38MAPK和JNK蛋白的磷酸化水平。结果 (1)B组小鼠腹腔巨噬细胞ERK1/2蛋白磷酸化水平较A组明显升高,差异有统计学意义(P0.05);两组小鼠腹腔巨噬细胞p38MAPK和JNK平均荧光强度差异无统计学意义(P0.05);(2)向小鼠腹腔注射抑制剂的其他七个组别,其相应的蛋白表达水平几乎为零,且对其他蛋白表达无影响。结论 LTA可能是通过活化巨噬细胞MAPK家族中ERK1/2来激活巨噬细胞表达、合成和分泌细胞因子,抑制剂能够有效阻断蛋白表达通路,对其他蛋白表达无影响。     

血必净注射液减轻脓毒症诱导的小鼠急性肺损伤的作用及机制

目的 研究血必净注射液调控自噬对脓毒症诱导的小鼠急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的影响及机制.方法 将80只BALB/c雄性小鼠随机分为对照组、模型组、血必净组、血必净+3-甲基腺苷(3-methyladenosine,3-MA)组,每组各20只.对照组进行假手术,后3组采用盲肠穿孔术建立脓毒症ALI模型,血必净组给予10 mL/kg血必净注射液腹腔注射,血必净+3-MA组给予10 mL/kg血必净注射液及10 mg/kg自噬抑制剂3-MA腹腔注射.观察4组小鼠造模后72h的累积生存率并检测肺组织病理改变、肺湿重/干重比、炎症因子[肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18]含量、自噬小体数目、自噬基因[微管相关蛋白轻链3 (microtubule-associated protein light chain3,LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1]的蛋白表达水平.结果 对照组72 h累积生存率为100％,肺湿重/干重比为3.89±0.85,TNF-α、IL-1β、IL-18含量分别为(0.83±0.14) ng/mg、 (0.74±0.15) ng/mg、 (84.51±13.25) pg/mg,自噬小体数目为(0.41±0.09)个/视野,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1分别为0.20±0.04、0.17±0.03.模型组小鼠肺组织出现典型的ALI病理改变,72 h累积生存率(50％)低于对照组(P＜0.0S),肺湿重/干重比(6.77±0.94),TNF-α、IL-1β、IL-18含量[(3.15±0.76)ng/mg、(2.88±0.62) ng/mg、 (274.62±45.58) pg/mg],自噬小体数目[(3.14±0.55)个/视野],以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表达水平(0.69±0.09、0.35±0.06)均高于对照组(P＜0.05).血必净组小鼠肺组织ALI病理改变减轻,72 h累积生存率(75％)高于模型组(P＜0.05),自噬小体数目[(5.77±0.75)个/视野]及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表达水平(0.98±0.13、0.62±0.08)高于模型组(P＜0.05),肺湿重/干重比(4.23±0.76)及TNF-α、IL-1β、IL-18含量[(1.52±0.32) ng/mg、 (1.29±0.30) ng/mg、 (121.36±26.51) pg/mg]低于模型组(P＜0.05).血必净+3-MA组小鼠肺组织ALI病理改变加重,72 h累积生存率(55％)低于血必净组(P＜0.05),自噬小体数目[(0.78±0.16)个/视野]及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表达水平(0.37±0.05、0.32±0.05)低于血必净组(P＜0.05),肺湿重/干重比(6.31±0.91)及TNF-α、IL-1β、IL-18含量[(2.88±0.56) ng/mg、 (2.41±0.58) ng/mg、 (252.35±37.65) pg/mg]高于血必净组(P＜0.05).结论 血必净注射液能够减轻脓毒症诱导的小鼠ALI,激活自噬是与之相关的分子机制.     

MAPK/FOXA2介导香烟烟雾提取物对支气管上皮细胞分化的影响

目的:探讨吸烟对支气管上皮细胞分化的影响及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/叉头框转录因子A2(FOXA2)信号通路在此过程中发挥的作用。方法:培养BEAS-2B细胞,分为空白对照组、香烟烟雾提取物(CSE)处理组、CSE+ERK抑制剂U0126处理组、CSE+JNK抑制剂SP600125处理组、CSE+p38抑制剂SB203580处理组。ELISA测定各组磷酸化的ERK1/2、JNK、p38蛋白的水平;实时荧光定量PCR检测FOXA2、E-cadherin、CD44、ZO-1的mRNA水平;用Western印迹检测FOXA2、E-cadherin、CD44、ZO-1的蛋白水平。结果:与空白对照组相比,用CSE的细胞中磷酸化的ERK1/2、JNK、p38蛋白水平明显升高(P0.05),而FOXA2、E-cadherin、CD44、ZO-1的mRNA及蛋白表达水平均明显降低(P0.05);CSE处理同时采用ERK、JNK或p38抑制剂处理显著改善上述基因及蛋白表达的变化(P0.05)。结论:吸烟可影响支气管上皮细胞分化,而MAPK/FOXA2信号通路在此过程中发挥重要调节作用。     

姜黄素调控自噬在抑制HPV阳性宫颈癌细胞的体外研究

目的研究姜黄素在体外应用于诱导HPV阳性宫颈癌细胞凋亡与自噬的影响。方法采用MTT检测法和流式细胞仪检测姜黄素(10,20,30,40μmol/L)对HPV阳性宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响;采用自噬抑制剂3-MA与姜黄素联用,观察自噬对姜黄素抑制HPV阳性宫颈癌细胞增殖和诱导细胞凋亡的影响;分光光度法检测SiHa细胞Caspase-3活性;应用ELISA检测姜黄素和(或)自噬抑制剂3-MA对宫颈癌SiHa细胞内Bcl-2、Bax和Beclin-1表达的影响。结果姜黄素对HPV阳性的宫颈癌SiHa细胞的生长具有抑制作用,而且这种抑制作用呈浓度依赖性和时间依赖性;而姜黄素与3-MA联用后,对HPV阳性宫颈癌SiHa细胞诱导凋亡的作用明显下降;与对照组相比,姜黄素组细胞Caspase-3活性明显提高(P0.01)、Bax和Beclin-1的表达均明显升高(P0.01),而Bcl-2的表达明显降低(P0.01);与单独应用姜黄素组相比,姜黄素与3-MA联用组细胞Caspase-3活性和Bax表达均明显下降(P0.01),而Bcl-2的表达明显增加(P0.01)。结论姜黄素能有效抑制HPV阳性宫颈癌SiHa细胞的增殖,可以提高细胞Caspase-3活性、促进促凋亡因子Bax的表达升高和抑制凋亡因子Bcl-2表达下调,同时促进自噬相关蛋白Beclin 1的表达上调,从而诱导HPV阳性宫颈癌SiHa细胞发生凋亡和自噬性细胞死亡。     

白藜芦醇通过激活mTOR/自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12细胞损伤及凋亡

目的:白藜芦醇对缺氧缺糖/复氧复糖(OGD/R)诱导的PC12细胞损伤及凋亡的影响及作用机制。方法:以PC12细胞建立OGD/R自噬性损伤模型,设置空白对照组、模型组、不同浓度(5、10μmol/L)白藜芦醇组,自噬抑制剂(3-MA)组。使用CCK-8试剂盒检测PC12的增殖能力;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;ELISA检测各组细胞培养液中TNF-α和IL-6的浓度变化;DHE荧光探针检测ROS的变化;特定试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH-PX)含量;Westernblot法检测各组mTOR的磷酸化情况及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达。结果:与空白对照组相比模型组能够显著降低PC12的增殖能力,增加细胞中ROS的含量和凋亡率,诱导TNF-α和IL-6分泌,LDH、MDA含量显著增加,SOD、GSH-PX活性显著下降,而P-mTOR/mTOR、LC3-Ⅱ、Beclin-1表达增加(P<0.01)。与模型组比较,不同浓度白藜芦醇作用PC12时,细胞存活率逐渐上升,ROS含量及凋亡率逐渐下降,LDH、MDA含量减少,SOD、GSH-PX活性随之上升,TNF-α和IL-6分泌显著下降,P-mTOR/mTOR、LC3-Ⅱ、Beclin-1表达进一步增加(P<0.01)。自噬抑制剂(3-MA)组上述指标的检测结果与白藜芦醇组相反。结论:白藜芦醇可能部分通过激活mTOR/自噬通路对神经细胞发挥保护作用。     

ADMA可以通过自噬引起内皮细胞死亡

目的探讨非对称性二甲基精氨酸(ADMA)在体外培养的条件下,是否可以通过自噬引起脐静脉内皮细胞死亡。方法首先,将细胞分为阴性对照组,ADMA(25μmol/L),ADMA(50μmol/L),ADMA(100μmol/L)及阳性对照组雷帕霉素(RAPA,自噬的激动剂,20 nmol/L)刺激人脐静脉内皮细胞24 h。然后应用ADMA(100μmol/L)分别刺激人脐静脉内皮细胞0 h,12 h,24 h,36 h,48 h。最后引入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA,5 mmol/L),分为阴性对照组,ADMA(100μmol/L),3-MA(5 mmol/L)和ADMA+3-MA(100μmol/L ADMA+5 mmol/L 3-MA)。免疫印迹方法检测微管相关蛋白Ⅰ轻链3(LC3Ⅱ/Ⅰ)和酵母自噬相关基因Atg6的哺乳动物同源基因beclin-1的表达水平;实时荧光定量方法检测beclin-1的mRNA表达水平;应用流式细胞仪检测细胞死亡。结果随着ADMA浓度的增加,脐静脉内皮细胞内的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和beclin-1的表达增加(P0.05),细胞死亡的百分比也逐渐增加(P0.05)。在ADMA浓度为100μmol/L时,随着时间的延长,脐静脉内皮细胞内的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和beclin-1的表达增加(P0.05),细胞死亡的百分比也逐渐增加(P0.05)。在ADMA(100μmol/L)的基础上应用自噬抑制剂3-MA后,脐静脉内皮细胞内的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和beclin-1的表达较ADMA组减低(P0.05),同时加入3-MA后细胞死亡的百分比较ADMA组减低(P0.05)。结论 ADMA可以引起人脐静脉内皮细胞发生自噬,自噬的强度具有浓度及时间的依赖性,并可以通过自噬引起人脐静脉内皮细胞的死亡,当应用自噬抑制剂后可以减少这种由于ADMA所致细胞自噬引起的细胞死亡,这说明ADMA可以通过自噬引起内皮细胞死亡,从而引起内皮损伤,这可能是引起内皮功能不全的机制之一。     

细胞自噬对高三尖杉酯碱作用K562细胞的影响

目的:探讨高三尖杉酯碱(HHT)单用或与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联用对K562细胞凋亡及自噬的影响。方法:K562细胞在HHT(10 ng/ml)作用下1-8 d,采用流式细胞术检测细胞凋亡;采用RT-PCR法、Western blot法和透射电子显微镜检测细胞自噬。结果:在HHT作用前期K562细胞凋亡率逐渐升高,而在后期则下降。HHT作用后,K562细胞的Beclin1表达及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值先下降后升高。HHT单用时,激活型caspase-3蛋白表达前期逐渐上升,而在后期下降。与自噬抑制剂3-MA联用组的K562细胞的Beclin1表达和LC3Ⅱ/Ⅰ的比值持续下降,而激活型caspase-3蛋白表达则逐渐升高。结论:HHT可诱导K562细胞凋亡,但HHT持续作用可诱导K562细胞发生自噬,与3-MA联用则增强HHT的细胞毒作用。     

儿童免疫性血小板减少症中自噬上调抑制前血小板形成

目的:研究儿童免疫性血小板减少症(ITP)中巨核细胞自噬水平上调对前血小板生成的影响。方法:通过吉姆萨染色和免疫荧光染色法分别观察巨核细胞形态及前血小板的生成,Western blot法检测细胞骨架蛋白和自噬相关蛋白的表达,自噬调节药物(自噬诱导剂Rap,自噬抑制剂3-MA)调控小鼠巨核细胞的自噬。结果:ITP患儿巨核细胞内存在空泡状结构,自噬相关蛋白LC3-II/I和复合物Atg12-Atg5的表达量均显著高于对照组(LC3-II/I:ITP 1.32±0.18 vs Ctrl 0.49±0.16,P0.05; Atg12-Atg5:ITP 0.69±0.17 vs Ctrl 0.12±0.08,P0.05);免疫荧光染色显示,ITP患儿巨核细胞细胞微丝排布异常,同时肌球蛋白磷酸化显著增强((ITP 0.74±0.09; Ctrl 0.05±0.02,P0.05);自噬诱导剂和抑制剂能调控小鼠巨核细胞生成前血小板并改变细胞周期蛋白的表达,Cyclin D1(Veh 1.08±0.12; Rap 0.46±0.04; Rap+3-MA 0.70±0.03),Cyclin D2(Veh 0.47±0.04; Rap 0.27±0.04; Rap+3-MA 0.41±0.03),P21(Veh 0.15±0.01; Rap 0.04±0.01; Rap+3-MA 0.05±0.01)。结论:ITP患儿巨核细胞自噬上调是前血小板形成障碍的关键因素。     

β-榄香烯注射液联合甲磺酸阿帕替尼 对乳腺癌细胞生长抑制作用的研究

目的探究β-榄香烯注射液(ELE)联合甲磺酸阿帕替尼(APA)对乳腺癌细胞生长的抑制作用。方法正常培养乳腺癌细胞MB-468作空白对照组,用0. 05 mg/ml ELE单独或联合1μmol/L APA处理MB-468细胞,分别作ELE组、APA组和ELE+APA组。采用MTT法检测各组细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blot检测Ki67、PCNA、Caspase-3、Bax、Bcl-2、Beclin1、p62、LC3的表达;用自噬抑制剂3-MA处理MB-468细胞,并进行ELE单独或联合APA干预,细胞分组为:对照组,3-MA组,ELE+APA组和3-MA+ELE+APA组,采用Western blot检测LC3的表达。结果与对照组相比,ELE组、APA组和ELE+APA组细胞增殖活性、Ki67、PCNA、p62的表达显著下调,凋亡率、Caspase-3、Bax/Bcl-2、Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达显著上调;加入自噬抑制剂3-MA后,3-MA+ELE+APA组Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达显著下调,p62的表达显著上调。结论 ELE联合APA对乳腺癌细胞MB-468生长有明显的抑制作用,可能与降低MB-468细胞增殖活性、促进其凋亡和自噬有关。     

TDP-43介导信号通路对骨关节炎大鼠作用机制分析

目的 探讨TDP-43基因表达干预炎症因子和缺血缺氧应激依赖的JNK和p38MAPK信号通路的机制。方法 选取60只SD大鼠,分为正常对照组(正常SD大鼠,不进行任何处理)、骨关节炎(OA)模型组和TDP-43-m MSCs+OA组,每组20只。OA模型组和TDP-43-m MSCs+OA组,采用胶原酶注射建立大鼠OA模型。对TDP-43-m MSCs+OA组大鼠进行TDP-43-m MSCs移植。采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定大鼠血清中炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)的水平;采用Western blot法检测各组大鼠软骨组织中TDP-43、RACK1、MTK1、MAPKKK磷酸化的表达、应激颗粒(SGs)的形成及JNK和p38 MAPK信号通路的蛋白变化。结果 OA模型组大鼠软骨组织中TDP-43的蛋白表达显著低于正常对照组,TDP-43-m MSCs+OA组显著高于正常对照组和OA模型组,TDP-43-m MSCs移植成功。与正常对照组相比,OA模型组大鼠软骨组织中胞质SGs的形成量显著降低,TDP-43-m MSCs+OA组显著高于模型组;与正常对照组相比,OA模型组大鼠软骨组织中RACK1、JNK和p38 MAPK的蛋白表达、MTK1、MAPKKK磷酸化的表达量,大鼠血清中TNF-α和IL-1β的分泌量均显著高于正常对照组,而TDP-43-m MSCs+OA组以上指标均显著低于模型组。结论 TDP-43基因的过表达,可以干预炎症因子的分泌,抑制缺血缺氧应激依赖的JNK和p38 MAPK信号通路的激活,从而逆转软骨细胞病变的分子机制。上述结论为OA的治疗提供新的理论依据。     

麝香通心滴丸对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的探讨麝香通心滴丸（STDP）对心肌细胞缺氧/复氧的保护作用。 方法建立心肌缺氧/复氧模型。将H9c2细胞分为5组：对照组（细胞正常培养,不做任何处理）、模型组、STDP组（在复氧前40 min给予STDP 50 mg / L）、3-甲基腺嘌呤（3-MA）组（在复氧前40 min给予3-MA 5 mmol / L）及STDP + 3-MA组（在复氧前40 min分别给予STDP 50 mg / L及3-MA 5 mmol / L）。采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测各组细胞存活率,并测定各组细胞乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛及肌酸激酶水平。采用流式细胞仪检测各组细胞的细胞凋亡率,实时荧光定量PCR检测信使RNA（mRNA）自噬相关基因Beclin-1、Atg5的表达水平,并通过Western-blotting检测各组细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ / LC3Ⅰ、低氧诱导因子1α（HIF-1α）、Bcl-2 /腺病毒E1B 19 kDa相互作用蛋白3（BNIP3）、Beclin-1、Atg5的表达水平。 结果各组细胞存活率比较,差异有统计学意义（F = 85.893,P = 0.028）,且STDP组细胞存活率较模型组、3-MA组及STDP + 3-MA组细胞存活率均显著升高[（90 ± 7）%、（63 ± 5）%、（80 ± 5）%、（81 ± 6）%,P均< 0.05]。各组细胞LDH、丙二醛、肌酸激酶水平,细胞凋亡率,Beclin-1 mRNA、Atg5 mRNA以及LC3Ⅱ / LC3Ⅰ、HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、Atg5蛋白表达水平的比较,差异均有统计学意义（F = 78.381、23.519、48.376、22.726、6.315、5.294、75.219、116.546、21.125、39.724、65.247,P均< 0.05）。进一步两两比较发现,在STDP组细胞中,LDH[（92 ± 6）、（194 ± 13）、（195 ± 11）、（192 ± 10）μmol / L,P均< 0.05]、丙二醛[（12.5 ± 0.7）、（17.2 ± 1.2）、（18.5 ± 1.6）、（17.9 ± 1.0）μmol / L,P均< 0.05]、肌酸激酶[（19.9 ± 1.0）、（34.3 ± 2.2）、（35.3 ± 2.2）、（34.8 ± 2.5）μmol / L,P均< 0.05]水平,细胞凋亡率[（5.8 ± 0.8）%、（8.8 ± 0.9）%、（7.6 ± 0.7）%、（7.3 ± 0.5）%,P均< 0.05]较模型组、3-MA组及STDP + 3-MA组均明显降低;Beclin-1 mRNA、Atg5 mRNA、LC3Ⅱ / LC3Ⅰ、BNIP3、Beclin-1、Atg5蛋白表达水平较模型组均明显降低,而较3-MA组及STDP + 3-MA组均显著升高（P均< 0.05）;HIF-1α蛋白表达水平较模型组、3-MA组及STDP + 3-MA组均明显升高（P均< 0.05）。 结论STDP可通过调控HIF-1α / BNIP3信号通路发挥对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。     

低强度脉冲超声波对兔膝骨性关节炎软骨整合素-FAK-MAPKs信号通路蛋白表达的影响

目的:观察低强度脉冲超声波(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)对兔膝骨性关节炎(osteoarthritis,OA)软骨中整合素-FAK-MAPKs力化学细胞信号转导通路相关蛋白表达的影响。方法:18只成年新西兰大白兔随机平均分成3组,分为正常对照组(normal control,NC),OA模型组(OA group,OA),OA模型照射组(O+L)。OA组接受右侧后肢前交叉韧带切断(ACLT)处理术后4周接受LIPUS假辐射,O+L组同样手术处理,术后4周接受LIPUS辐射,NC组仅切开关节囊。LIPUS作用6周后,处死实验动物,取右后肢,采用HE染色行改良Mankin评分比较各组胫骨平台关节表面病理学改变。同时,采用Western blot技术检测Ⅱ型胶原,MMP-13,整合素β1的蛋白表达水平以及FAK、MAPKs家族蛋白(p38、ERK1/2、JNK)磷酸化水平。结果:1组织学观察及Mankin评分:LIPUS干预后,OA软骨表层轻微不平整,染色轻度缺失,可见软骨细胞增殖;Mankin评分,NC组:4.67±0.57;OA组:10.57±2.55;O+L组:7.66±1.74。与NC组相比,OA组、O+L组Mankin评分明显增高,但OA组增高更为明显(P0.05);与OA组相比,O+L组Mankin评分明显降低(P0.05)。2Ⅱ型胶原、MMP-13含量:LIPUS干预后,II型胶原含量较NC组升高,MMP-13含量有明显下降。3整合素β1-FAK-MAPKs信号通路相关蛋白表达:LIPUS干预使整合素β1、磷酸化FAK表达增高;同时MAPKs信号通路相关蛋白ERK1/2、p38磷酸化水平明显下降,而JNK磷酸化水平无明显变化。结论:LIPUS可以减轻骨性关节炎软骨ECM损伤程度,与LIPUS产生机械应力使关节软骨中细胞表面应力受体之一整合素β1及其下游分子黏着斑激酶FAK磷酸化表达增高,进一步下游的磷酸化p38,ERK1/2表达下调有关。LIPUS的机械效应可经力化学转导途径作用于OA关节软骨,为治疗骨性关节炎提供一种新的思路。     

犀角地黄汤对缺血性脑卒中再灌注大鼠模型自噬水平的调节机制分析

目的探讨犀角地黄汤对缺血性脑卒中(AIS)再灌注大鼠模型自噬水平的调节机制。方法无特定病原级雄性大鼠60只,随机分为假手术组(A组,只分离颈总动脉不插入线栓)、AIS再灌注组(B组,构建AIS再灌注模型)、AIS再灌注+犀角地黄汤组(C组,于构建AIS再灌注模型前30 min经腹腔注射10 mg/kg犀角地黄汤)、AIS再灌注+犀角地黄汤+JNK抑制剂组(D组,于构建AIS再灌注模型前30 min经腹腔注射10 mg/kg犀角地黄汤和JNK抑制剂),每组各15只。于建模后24 h麻醉大鼠取脑组织做切片,分别进行神经功能评分、自噬超微结构观察、Western Blot检测自噬蛋白Beclin 1和微管相关蛋白轻链3(LC3)表达、TTC测定大鼠脑梗死体积、TUNEL染色法检测细胞凋亡率。结果构建AIS再灌注模型后,与A组大鼠比较,其余组大鼠神经功能均出现异常,自噬泡增加,Beclin 1、LC3蛋白表达增加。与B组比较,C组大鼠神经功能评分、自噬水平、脑梗死体积、Beclin 1、LC3蛋白表达、神经细胞凋亡率降低(P <0. 05);与C组比较,D组大鼠自噬水平显著降低,神经功能进一步改善(P <0. 05)。结论 AIS再灌注后神经细胞损伤严重、自噬水平升高,犀角地黄汤可通过激活JNK通路显著降低自噬水平而降低神经功能损伤,这可能为AIS再灌注后神经损伤提供新的治疗靶点。     

重复异丙酚麻醉通过mTOR通路诱导新生大鼠海马细胞凋亡及自噬的研究

目的 研究重复异丙酚麻醉对新生大鼠海马细胞凋亡及自噬的影响及分子机制。方法 选择7日龄的雄性SD大鼠,以随机数字表法随机分为对照组(0. 9%氯化钠溶液7. 5 m L/kg腹腔注射)、异丙酚组(异丙酚75 mg/kg腹腔注射)、异丙酚+雷帕霉素组(异丙酚75 mg/kg及雷帕霉素3. 0 mg/kg腹腔注射),均每天1次、连续给药7 d。分离海马组织,检测细胞凋亡率及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)通路分子、凋亡基因、自噬基因的表达水平。结果 对照组、异丙酚组、异丙酚+雷帕霉素组海马组织中的细胞凋亡率分别为(3. 27±0. 93)%、(14. 27±3. 12)%、(6. 58±1. 21)%,磷酸化-m TOR/总-m TOR水平分别为0. 42±0. 09、0. 89±0. 15、0. 61±0. 12,磷酸化-S6K/总-S6K水平分别为0. 34±0. 07、0. 83±0. 15、0. 49±0. 09,含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)的mRNA表达量分别为0. 73±0. 14、1. 94±0. 31、1. 05±0. 20,Beclin-1的mRNA表达量分别为0. 91±0. 12、0. 47±0. 09、1. 83±0. 15。异丙酚组海马组织中的细胞凋亡率、磷酸化-m TOR/总-m TOR、磷酸化-S6K/总-S6K、Caspase-3的mRNA表达量分均明显高于对照组,Beclin-1的mRNA表达量均明显低于对照组,差异均有统计学意义(P 0. 05);异丙酚+雷帕霉素组海马组织中的细胞凋亡率、磷酸化-m TOR/总-m TOR、磷酸化-S6K/总-S6K、Caspase-3的mRNA表达量均明显低于对照组,Beclin-1的mRNA表达量均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P 0. 05)。结论 重复异丙酚麻醉能够通过增强m TOR通路使新生大鼠海马细胞的凋亡加剧、自噬受阻。     

联合自噬抑制剂增加PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235诱导的结肠癌细胞凋亡

目的探讨自噬对I3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235诱导的人结肠腺癌DLD1细胞凋亡的影响。方法PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235和(或)自噬抑制剂3-MA处理人结肠腺癌DLD1细胞,MTT法检测细胞生存率,流式细胞术检测细胞凋亡率的变化,Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达。结果不同浓度的NVP-BEZ235作用于人结肠腺癌DLD1细胞24h后,MTT及流式细胞术结果显示,明显地抑制了细胞增殖,并增加了细胞凋亡率,同时观测到凋亡相关蛋白Caspase-3表达升高;采用3-MA特异性抑制自噬活性后,明显地增加了NVP-BEZ235诱导的细胞凋亡率;同时,检测到凋亡相关蛋白Caspase-3的表达上调。结论自噬在NVP-BEZ235诱导的人结肠腺癌DLD1细胞凋亡的过程中起保护作用,3-MA抑制自噬后,促进了NVP-BEZ235诱导人结肠腺癌DLD1细胞凋亡,联合应用PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235和自噬抑制剂3-MA有望成为人结肠癌的新治疗策略。     

低强度脉冲超声对兔膝骨性关节炎软骨细胞整合素-局部粘着斑激酶-促分裂原活化蛋白激酶力化学转导通路相关蛋白表达的影响

目的观察低强度脉冲超声（LIPUS）对兔膝骨性关节炎（OA）软骨细胞中整合素-局部粘着斑激酶（FAK）-促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）力化学信号转导通路相关蛋白表达的影响。 方法共选取18只新西兰大白兔,其中12只进行膝OA造模,其余6只作为正常对照。于制模后第4周处死实验兔,提取软骨细胞进行体外培养并鉴定。将所培养细胞分为正常对照组、OA模型组及OA超声组。待细胞传至第2代时,正常对照组及OA模型组细胞不给予任何处理,OA超声组细胞则给予LIPUS辐射。于LIPUS持续作用1周后收集各组细胞,应用Western blot技术检测各组细胞中Ⅱ型胶原、蛋白多糖、基质金属蛋白酶(MMPs)-13、整合素β1、FAK、MAPK（如p38、ERK1/2、JNK）蛋白表达以及磷酸化蛋白表达情况。 结果①OA模型组及OA超声组Ⅱ型胶原、蛋白多糖含量均较正常对照组明显降低（P<0.05）,并以OA模型组下降幅度较显著,与OA超声组间差异具有统计学意义（P<0.05）。②OA模型组及OA超声组MMP-13含量均较正常对照组明显增高（P<0.05）,并以OA模型组增高幅度较显著,与OA超声组间差异具有统计学意义（P<0.05）。③OA模型组及OA超声组整合素β1、磷酸化FAK含量均较正常对照组明显增高,且以OA超声组增高幅度较显著,与OA模型组间差异具有统计学意义（P<0.05）。④OA模型组磷酸化p38、ERK1/2及JNK含量均较正常对照组明显增加（P<0.05）,OA超声组上述指标则较OA模型组显著降低（P<0.05）。 结论LIPUS体外辐射可抑制OA软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖降解及MMP-13表达,同时还能促进整合素β1表达以及FAK磷酸化,抑制p38、ERK1/2、JNK磷酸化,提示LIPUS辐射可能通过启动整合素-FAK-MAPK力学信号转导通路诱导软骨细胞外基质发生改变。     

二十二碳六烯酸联合5-氟尿嘧啶对人肝癌细胞HepG2耐药相关蛋白表达的影响

目的研究二十二碳六烯酸（DHA）联合5氟尿嘧啶（5-FU）对人肝癌细胞HepG2耐药相关蛋白ERK、JNK及p38的表达。方法Westernblot检测5．Fu5μg／mL,或5-Fu5μg／mL联合DHA30μg／mL作用HepG2细胞48h后ERK、JNK及p38蛋白表达。结果与单用5-FU组比较,5-FU联合DHA组对耐药相关蛋白的影响,P-ERK明显受到抑制,而P-JNK表达显著增加,p-p38表达无差别。结论DHA对肝癌细胞耐药相关蛋白的调控可能通过抑制ERK、激活JNK信号通路来增强5-Fu的细胞毒活动,发挥增敏化疗药物的作用。     

细胞外调节蛋白激酶信号通路对蛛网膜下腔出血大鼠神经元自噬及早期脑损伤的影响

目的探讨细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路在蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑损伤及海马区神经细胞自噬中的作用。方法成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只,随机数字表法分为假手术组(Sham组)、SAH组、SAH+二甲基亚砜(DMSO)组和SAH+U0126组,每组各12只。采用血管内穿刺法制作SAH模型。造模前30 min,SAH+U0126组经尾静脉注射U0126 0.05 mg/kg,Sham组和SAH组注射等体积生理盐水,SAH+DMSO组注射等体积DMSO,24 h后处死。干湿重法测量脑组织水含量,HE染色观察海马CA1区神经细胞形态结构,免疫组化及Western blotting检测海马区磷酸化ERK(p-ERK)及Beclin-1和LC3-Ⅱ表达水平。结果与Sham组比较,SAH组脑组织含水量增加(P0.05),大鼠海马CA1区神经元数量明显减少(P0.05),p-ERK及Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达升高(P0.05)。与SAH组相比较,SAH+U0126组脑组织含水量升高(P0.05),海马CA1区神经元数量减少(P0.05),p-ERK及Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达降低(P0.05);SAH+DMSO组各项无显著性差异(P0.05)。结论 ERK信号通路的激活可能通过对自噬的调控减轻SAH后的早期脑损伤。     

高压氧修复缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障的自噬机制

目的 观察高压氧舱治疗对缺血再灌注损伤大鼠脑血管内皮细胞微管相关蛋白1轻链3 (LC3)和Beclin-1表达的影响,探究高压氧修复缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障的机制。方法 54只成年雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组(n=12)、缺血再灌注损伤模型组(n=18)、高压氧组(n=12)和抑制剂组(n=12)。模型组、高压氧组和抑制剂组采用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血2 h再灌注损伤模型。高压氧组和抑制剂组建模后予高压氧舱治疗;抑制剂组治疗前侧脑室注射3-甲基腺嘌呤。损伤后72 h,各组进行伊文思蓝染色,观察梗死区伊文思蓝含量;模型组采用免疫荧光双标法观察LC3在CD₃₁⁺血管内皮细胞的表达;采用Western blotting检测各组梗死区皮质微血管段LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达水平。结果 与假手术组相比,模型组梗死区伊文思蓝含量明显升高(P < 0.01);与模型组相比,高压氧组梗死区伊文思蓝含量明显降低(P < 0.01);与高压氧组相比,抑制剂组梗死区伊文思蓝含量增高(P<0.05)。模型组损伤区CD₃₁⁺血管内皮细胞可见LC3表达;模型组梗死区微血管段Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达水平均明显高于假手术组(P < 0.01);高压氧组的LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达水平较模型组均升高(P<0.05);抑制剂组较高压氧组和模型组均明显下降(P<0.01)。结论 缺血再灌注损伤大鼠损伤区的血管内皮细胞存在自噬现象,高压氧舱治疗能够上调梗死区血管内皮细胞自噬蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达,从而促进血脑屏障修复。