表达人HER2/neu及荧光素酶的小鼠乳腺癌模型的建立

目的建立表达HER2/neu表皮生长因子受体及萤火虫荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞模型。方法将重组人HER2/neu原癌基因真核表达载体与荧光素酶报告基因依次转染小鼠乳腺癌4T1细胞系,用G418与潮霉素加压筛选阳性克隆,Western印迹及活体成像技术鉴定HER2/neu和荧光素酶在4T1细胞中的表达。在BALB/c小鼠前肢乳腺皮下注射该细胞1.5×106个,活体成像观察肿瘤的生长及转移。结果与结论经过两步转染获得抗G418及潮霉素4T1细胞,Western印迹结果显示,该细胞高表达HER2/neu。流式细胞术检测结果提示几乎所有细胞均有GFP的表达。用该细胞株接种小鼠后具有与野生型4T1细胞相似的成瘤性和转移能力。实验结果提示,我们已建立可表达HER2/neu表皮生长因子受体及荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞株,为乳腺癌的研究提供一个良好的模型。     

用α-半乳糖苷酶制备可供输注的人通用型O型红细胞

研究的目的是将人群中28％的B型血改造成通用O型血,提高O型血的储存和使用比例,以缓解战争、恐怖袭击、突发事件等紧急状态下对O型血的大量需求用α-1.3半乳糖苷酶作为B→O血型改造的工具酶,摸索改造一个使用单位B型血红细胞(100m1)的最佳条件,结果实现了在密闭、无菌条件下使用50U／ml工具酶．pH5．6,26℃ 2小时,进行B→O的血型改造。结论：改造后的通用型O型血红细胞符合生物制品检定规程的要求．并可在4℃存放21天     

ABO血型改造制备通用型红细胞

血型改造的理论基础、研究意义及国外研究进展ABO血型系统是临床输血最重要的血型系统,在所有的输血死亡事故中,每年因ABO血型不相合而导致的输血死亡事故居首位,约为69.7%[1].     

ABO基因启动子CpG岛甲基化与白血病的相关性

近年来研究发现ABO血型与许多疾病的发生发展相关，某些肿瘤导致A、B血型物质减少的现象已日益引起关注。本研究探讨ABO基因启动子CpG岛甲基化与白血病的相关性。采用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测了不同血型的健康人群和各种血液病患者外周血红细胞表面ABH抗原的相对含量，用PCR和MSP—PCR分别检测血液病患者和健康人ABO基因启动子DNA序列和CpG岛甲基化，以及ABO基因启动子-102位点的甲基化。结果发现，白血病患者均出现不同程度的A、B抗原减少；通过对比检测健康人和患者的ABO基因启动子序列，未发现有序列的不同，说明启动子序列高度保守；利用重亚硫酸盐对DNA样本进行修饰后，通过对健康人和患者的ABO基因启动子序列进行扩增和测序，发现健康人和再生障碍性贫血患者在ABO基因启动子的CpG岛区没有甲基化的位点，而急性髓性白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性粒细胞白血病（CML）和部分骨髓增生异常综合征（MDS）患者在位置为-102、-101、-100、-99和-97位置的C碱基均有甲基化的现象。结论：甲基化是造成白血病患者AB抗原下降的原因；-102、-101、-100、-99和-97这几个甲基化位点有可能是白血病的特异性表现；针对-102住点检测结果提示-102位点是否甲基化有可能作为白血病鉴别诊断中一个有意义的分子标识物。     

a-N-乙酰半乳糖胺酶多克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的制备a-N-乙酰半乳糖胺酶(NAGA)的高效价高特异性的兔多克隆抗体。方法利用pET22b-NA-GA/BL21(DE3)工程菌株表达NAGA,经Ni2+Sepharose 6 FF亲合层析,Phenyl Sepharose 6 FF疏水层析两步纯化,得到纯度95%的NAGA作为抗原免疫新西兰白兔,获得NAGA的兔抗血清,并经HiTrap rProtein A柱纯化获得高效价高特异性的抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,用Western blotting评价抗体特异性。结果制备得到的NAGA兔多克隆抗体血清效价为1×106,经过rProtein A柱纯化后抗体蛋白纯度95%,效价为1×105;Western blotting显示:该NAGA兔多克隆抗体只与NAGA发生特异性反应。结论获得了NAGA的高效价高特异性的兔多克隆抗体。     

重组血型改造工具酶稳定性的研究

目的研究血型改造工具酶,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在不同保存条件下的稳定性。方法以酶解B型红细胞的活性和纯度作为主要检测指标,考察重组α-半乳糖苷酶的热稳定性。重组α-半乳糖苷酶在70℃条件下保存1d,37℃保存60d,室温、4、-20、-70℃分别保存6个月,定期取样观察样品的外观,检测样品的pH值、纯度、酶活性,并进行无菌试验;为确保临床使用中的安全性和有效性,我们对4℃保存的样品进行了长达3年的观察。结果重组α-半乳糖苷酶在70℃保存1d后失活,37℃保存2个月后活性降低了11.5%,室温保存6个月后活性降低了19%,-70℃保存6个月后活性降低了13%,4℃、-20℃保存的样品6个月内各项指标均正常,均未见蛋白明显降解,蛋白活性保持稳定。4℃保存3年的样品酶活性保持稳定,可按原剂量在26℃,2h内成功地将B型红细胞改造成O型红细胞。结论重组α-半乳糖苷酶对热不稳定,应保存4℃或-20℃,在此条件下,有效期至少2年,能满足常规临床要求。     

离体与在体实验探讨集束电极射频消融肾组织

目的:探讨集束电极射频对在体与离体两种状态下正常肾脏组织的消融作用及评价超声测量肾组织消融灶的准确性. 方法:在体实验应用6只大白兔麻醉后暴露肾脏,离体实验采用新鲜离体肾10只,使用不同的起始功率和电极直径进行消融,记录消融时间,超声观测消融灶并与实体标本进行对比. 结果:①毁损区与正常组织之间分炭化区、凝固性坏死区、充血水肿带三层结构;②相同条件下在体状态达到峰值阻抗所需时间较离体状态下要长,消融灶更大. ③离体状态下解剖测值与超声测值差异无显著性意义(P>0.05),在体状态下解剖测值与超声测值差异具有显著性意义(P<0.05). 结论:集束电极射频消融肾组织的形态及消融时间与肾脏的血流状态有关,对于血流丰富的肾组织射频即刻超声测量易于低估或高估消融灶的大小.     

基因重组α-半乳糖苷酶的生化性质研究

目的:在成功构建咖啡豆α半乳糖苷酶毕赤酵母工程菌株及完成基因重组α半乳糖苷酶发酵与纯化研究的基础上,对基因重组α半乳糖苷酶的生物化学性质进行研究。方法:测定了基因重组α半乳糖苷酶的N端序列、相对分子质量、氨基酸组成、三批发酵产物的紫外吸收光谱和肽图以及Vmax、Km、最适反应温度、最适反应pH值等酶的生化性质。结果与结论:基因重组α半乳糖苷酶的N端序列与理论序列完全一致;氨基酸组成与理论值相符;相对分子质量为39.4×103。三批发酵产物的紫外光谱吸收和肽图基本一致,表明发酵纯化后的产物稳定;Km=0.275mmol/L,最大酶促反应速度Vmax=0.014mmol/min;最适反应温度为37℃,最适反应pH值为5.6。     

MGMT与肿瘤的预见性化疗

O^6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O^6-methylguanine DNA-transferase，MGMT），是细胞修复DNA损伤的一种酶，这种酶又被称为O^6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶（AGAT）。顾名思义。此酶可以修复由各种烷化剂（alkylating agents）造成的细胞DNA烷基化损伤，特别是DNA分子中鸟嘌呤第6位氧原子上的甲基乃至烷基化损伤。根据MGMT基因及其表达水平的不同，将细胞特别是肿瘤细胞分成Mer^＋和Mer^-两种类型：Mer^＋对烷化剂耐药，Mer^-对烷化剂敏感，即细胞中的MGMT水平决定了细胞对烷化剂的耐药程度；接着科学家集中精力研究如何克服Mer^＋细胞耐药性的问题，发现O^6-BG可以有效克服Mer^＋细胞对烷化剂耐药性。这些研究为开展甲基转移酶MGMT与肿瘤预见性、个体化治疗奠定了基础。     

老化小鼠模型与年青小鼠肺脏蛋白表达谱的差异分析

目的:寻找在肺脏衰老过程中起作用的关键蛋白。 方法:利用双向电泳(2DE)和质谱技术对老化小鼠肺脏蛋白进行了蛋白质组学的研究。 结果:老化小鼠肺脏的蛋白表达谱与年青小鼠的肺脏相比较在11个点上有明显变化。进而对这11个差异蛋白进行肽质量指纹分析并检索相应蛋白,得到3个有意义的蛋白质,分别是kit ligand precursor,Carbonic anhydrase Ⅱ(CA Ⅱ)和Heat shock cognate 7l kDa protein(HSC 71)。 这3个在衰老与年青小鼠肺脏中的表达差异的蛋白可能有利于衰老过程中肺功能衰退的研究,同时也可能成为防治老年呼吸功能衰竭的关注点。