脐血树突状细胞介导的食管癌疫苗抗肿瘤实验研究

目的:用杂交瘤技术制备脐血树突状细胞(DC)和食管癌细胞的融合疫苗,观察其在体内外抗肿瘤的作用。方法:分离脐血CD34 干细胞并诱导扩增为成熟DC,并与EC109细胞经聚乙二醇法融合;免疫磁珠法筛选EC109-DC;MTT法测定瘤苗诱导淋巴细胞增殖能力及体外特异性免疫应答能力;重建SCID小鼠免疫功能;体内抗肿瘤免疫治疗实验。结果:(1)融合疫苗可体外生长,且同时高表达叶酸受体和CD80。(2)疫苗能有效刺激淋巴细胞增殖反应,体外诱导细胞毒T细胞(CTL)对EC109的杀伤活性显著高于对照组(P<0.05)。(3)在免疫治疗中,用融合瘤苗治疗的荷瘤小鼠,肿瘤大小和重量明显小于对照组(P<0.05)。结论:(1)EC109-DC能在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导特异性CTL杀伤作用;(2)融合瘤苗治疗荷瘤小鼠有一定的效应。     

脐血造血干细胞短期冻存效果的评价

为了探讨脐血造血干细胞在液氮中短期冻存复苏后的效果，分别将各自为8例冻存6个月、1年、2年的脐血千细胞进行复苏，观察造血干细胞活性。有核细胞(NC)计数采用自动血细胞分析仪测定，CD34^ 细胞采用流式细胞技术测定，用体外造血细胞培养技术分析粒一巨噬细胞集落生成单位(CFU-GM)产率，台盼蓝染色法判断造血细胞存活率。结果表明：脐血造血干细胞在液氮中冻存6个月、1年、2年后解冻，其有核细胞、CD34^ 细胞、细胞活率、CFU-GM产率在3个不同冻存时间的差异无显著性。结论：脐血干细胞于液氯中短期冻存，其干细胞数量和细胞活性没有明显的变化，冻存效果较好。     

冻融人脐血树突状细胞疫苗的抗肝癌活性

目的：观察人肝癌裂解抗原致敏的冻融人脐血树突状细胞(dendriti cells,DC)诱导的CTL抗肝癌活性,并观察与细胞因子联用的效应。方法：应用CD34^+干细胞试剂盒和免疫磁珠标记法分选人脐血CD34^+干细胞,细胞因子扩增培养为成熟DC,液氮冻存;人肝癌裂解抗原致敏冻融DC制备疫苗,进行DC疫苗及其与细胞因子联用的体外抗肿瘤实验,MTT检测各自诱导的CTL活性,并作统计学处理。结果：肝癌抗原致敏的人脐血冻融DC疫苗能诱导高效的CTL活性(P＜0．01),与新鲜DC疫苗差异无显著意义(P＞0．05)。冻融DC疫苗与1μg／mL GM-CSF联用,或与500U／mL TNF-a联用,诱导的CTL活性均明显增高(P＜0．05)。结论：肝癌抗原致敏的人脐血冻融DC疫苗能诱导具有高度针对靶细胞的特异性CTL活性,与细胞因子联用有一定的协同作用。     

不同来源人造血干/祖细胞在NOD/SCID小鼠体内归巢能力的差异

目的 比较不同来源的人造血干／祖细胞在NOD／SCID小鼠体内归巢能力的差异性，并探讨其体内归巢能力与膜表面归巢相关分子CXCR4表达水平的相关性。方法 采用流式细胞术（FACS）检测新鲜脐血、冻存脐血、动员后外周血（mPB）及骨髓来源的CD34^＋细胞表面CXCR4表达水平；将荧光染料CFSE标记的人CD34^＋细胞移植人接受照射的NOD／SCID小鼠，移植后20小时检测已归巢于NOD／SCID小鼠骨髓及脾脏中不同来源的人CD34^＋细胞，计算其相应的骨髓及脾脏归巢效率；并将小鼠股骨制成组织切片，荧光显微镜下观察人CD34^＋细胞在小鼠骨髓腔内的分布。结果 新鲜脐血、冻存脐血、mPB和骨髓CD34^＋细胞膜表面CXCR4表达阳性率分别为（49.52±1．12）％。（46．12±2．29）％，（48．50±2．48）％和（65．39±1．27）％，CD34^＋细胞在NOD／SCID小鼠骨髓的归巢效率分别为（3．00±0．44）％，（2．84±0．46）％，（4．06±0．70）％及（5．76±0．52）％；在脾脏的归巢率分别为（1．88±0．12）％，（1．80±0．15）％，（1．90±0．22）％，（2．16±0．34）％。归巢的CD34^＋细胞主要分布于小鼠股骨的骨内膜区域。结论 脐血CD34^＋细胞膜表面CXCR4水平低于mPB和骨髓。经冻存复苏后脐血CD34^＋细胞膜表面CXCR4水平略有下调。脐血CD34^＋细胞在照射NOD／SCID小鼠的骨髓归巢效率低于mPB和骨髓。     

三阴乳腺癌疫苗刺激T淋巴细胞增殖免疫效应观察

目的:利用细胞融合技术制备外周血来源树突状细胞(DC)和三阴乳腺癌细胞(MDA-MB-231)全抗原肿瘤疫苗,观察其刺激同源T淋巴细胞增殖作用。方法:从健康人的外周血中分离培养树突状细胞,利用电融合技术,将DC和三阴乳腺癌细胞融合;用荧光显微镜观察融合疫苗的形态;用流式细胞仪进行融合疫苗的表型鉴定;用CCK-8试剂盒测定融合疫苗刺激同源异体T淋巴细胞增殖效应。结果:成功分离培养DC,其表面高表达DC的分子标记CD11c、CD86、HLA-DR;融合疫苗的形态不规则,其表面共同表达DC和三阴乳腺癌的标记分子;T淋巴增殖实验证明融合疫苗具有很强的免疫刺激活性。结论:电融合技术成功诱导DC和三阴乳腺癌细胞融合,全抗原融合疫苗体外实验可显著增强同源T淋巴细胞增殖。     

深低温冻存不同时间对脐血细胞质量的影响

本研究旨在探讨不同冻存时间的脐血干细胞复苏后的回收率,并分析冷冻复苏的细胞对患者植入速度的影响。20份经-196℃液氮低温保存1-10年的脐血干细胞标本,比较冻存前（脐血库提供资料）和复苏后的细胞活率、总有核细胞数（TNC）、CD34＋细胞和粒-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）的数量,并分析复苏后的细胞回收对移植受者植入速度的影响。结果表明,不同冻存时间对复苏后干细胞的回收率没有影响。经冻存复苏后,细胞活存率为（92．75±2．55）％,TNC、CD34＋细胞数和CFU-GM的回收率分别为89．9％、84．8％和84．3％,与冻存前相比明显减少（P=0．000）,但细胞数量的下降对移植患者中性粒细胞和血小板的植入时间均无影响。冻存后TNC和CD34＋细胞数量与冻存前数量有很大的相关性（r=0．954;r=0．931,P=0．000）,而CFU-GM的相关性弱（r=0．285,P=0．223）。结论：冻存和复温过程会-定程度上损伤脐血干细胞,导致细胞丢失,但不会影响移植的效果。     

-80℃下不同冻存时间对脐血造血干细胞保存效果的影响

目的探讨-80℃下不同冻存时间对脐血造血干细胞保存效果的影响。方法对-80℃下分别冻存1、2、3、4、8、16、32 w的脐血细胞进行复苏,比较各组间有核细胞数、CD34^＋数和台盼蓝拒染率的差异。结果脐血细胞在-80℃下保存1、2、3、4、8 w后,各组的有核细胞数和CD34^＋数的差异无统计学意义,而在冻存16、32 w后较1 w的差异有统计学意义（P〈0.05）。台盼蓝拒染率在8、16、32 w较1 w的差异均有统计学意义（P〈0.05）,1、2、3、4 w各组间的差异无统计学意义。结论-80℃直接冻存对于短期（〈8 w）脐血细胞的活性（有核细胞数、CD34^＋数和台盼蓝拒染率）无明显影响,但对于需要长期保存的脐血细胞的效果有影响。     

热休克抗原致敏树突状细胞联合射频消融治疗荷瘤大鼠的免疫效应

目的将热休克抗原致敏后的树突状细胞（DC）应用于射频消融术（RFA）后治疗大鼠Walker 256实体瘤，探讨其对大鼠免疫机能的影响。方法将Walker 256肿瘤细胞经热休克冻融后致敏大鼠骨髓细胞衍化的DC以获得DC瘤苗；48只荷Walker 256实体瘤SD大鼠随机分成4组：对照组1（n=10）仅行RFA治疗；对照组2（n=10）仅行DC瘤苗治疗，对照组3（11=10）行RFA＋未致敏DC治疗，实验组（n=18）行RFA＋DC瘤苗治疗。治疗前及治疗后第4天分别测量各组大鼠外周血中CD4^＋T淋巴细胞、CD8^＋T淋巴细胞及CD4^＋／CD8^＋比值，超声评价各组肿瘤治疗前后体积变化，记录大鼠的荷瘤生存期。结果治疗后，与三组对照大鼠相比，实验组大鼠外周血中CD4^＋T细胞、CD4^＋／CD8^＋比值显著升高，CD8^＋T细胞显著下降（P〈0．05）；实验组实体瘤体积增大明显缓慢于各对照组（P〈0．05），且维持较长的荷瘤生存期（P〈0．05）。结论在RFA后应用冻融热休克抗原致敏DC治疗大鼠实体瘤可有效地改善其抗肿瘤免疫机能，并在延缓残存肿瘤生长，延长大鼠荷瘤生存期中发挥一定作用。     

负载HPV18E7基因脐带血树突状细胞的体外抗食管癌研究

目的制备人脐带血CD34^＋造血干细胞来源的负载HPV18E7基因的树突状细胞（DC）疫苗,并观察其在体外对人食管癌细胞的杀伤活性。方法采用微磁珠分选系统（MiniMACS）从脐带血单个核细胞中分离CD34干细胞,以重组人粒细胞．巨噬细胞集落刺激因子（rh—GM-CSF）和重组人肿瘤坏死因子-α（rhTNF-α）各200ng／ml和100U／ml诱导其向DC分化,采用阳离子脂质体DMRIE-C介导HPV18E7基因进入DC,制备DC疫苗。倒置相差显微镜下观察DC的生长情况和形态变化;流式细胞仪检测疫苗表面目的基因E7蛋白的表达情况;MTY法检测DC疫苗致敏的同种异体外周血T淋巴细胞在体外对表达HPV18E7的食管癌细胞EC-109的杀伤活性。结果脐带血CD34^＋干细胞在细胞因子诱导下,细胞体积增大,形状由圆形变得不规则形,细胞数量增多,形成细胞集落。经过14d的培养,大部分的细胞从集落上脱落下来成为成熟的DC,具有典型的树枝状突起。E7蛋白的阳性表达率为47．5％,说明基因转染成功。DC疫苗致敏的淋巴细胞在体外对EC-109细胞的杀伤活性明显强于未转基因DC致敏的淋巴细胞组、T淋巴细胞组和对照组（P〈0．01）,且随效靶比的增高而增强（P〈0．05）。结论人脐带血干细胞在细胞因子的诱导下能扩增分化为DC,经肿瘤相关病毒抗原基因转染获得的DC疫苗,高表达目的基因蛋白,并能显著增强淋巴细胞对相应人食管癌细胞的体外杀伤效应。     

树突状细胞外泌体免疫作用机制的初步研究

为了研究外泌体（exosome）作为肿瘤疫苗刺激免疫应答作用的机制，从正常人外周血单个核细胞诱导树突状细胞（DC）制备负载肿瘤抗原的DC外泌体（Dex），研究其在DC有无或DC成熟状态不同的情况下刺激T细胞增殖的能力；通过实验阻断DC外泌体上一些分子（CD11a、CD11b、CD11c、CD54、MFG-E8及CD83）后检测外泌体免疫学功能的改变；采用共聚焦显微镜检测DC对外泌体的吞噬作用，用流式细胞仪检测阻断外泌体表面分子对DC吞噬外泌体作用的影响。结果表明：在无DC存在或未成熟DC存在的情况下未成熟DC外泌体（imDex）和成熟DC外泌体（mDex）均不能有效地激活T细胞；不同的促成熟因子（LPS、TNF-α、CpG、CD40L）诱导成熟的DC所分泌的外泌体在数量上无明显差别，但在功能上有显著差异；Dex表面分子CD11a、CD11b、CD11c、CD54、MFG-E8及CD83与其功能有关，阻断这些分子均能不同程度地抑制Dex对T细胞刺激的作用；共聚焦显微镜和流式细胞仪检测表明阻断CD11a、cD54抑制了Dex靶向DC及被DC吞噬。结论：外泌体可以通过其表面分子靶向DC进而引起T细胞免疫应答。     

干细胞向卵母细胞样细胞分化研究进展

胚胎干细胞和成体干细胞如骨髓间充质干细胞等在特定的培养条件下可向卵母细胞样细胞分化,但形成的卵母细胞样细胞能否进行减数分裂并进一步生成有受精能力和发育潜能的配子尚不清楚。若能在体外将成体干细胞向有功能的卵母细胞样细胞诱导分化,并通过体外受精的方式生成健康的子代,将为卵子缺乏所致不育女性提供一条新的治疗途径。本文对近年发表的有关干细胞体外向卵母细胞样细胞分化的文献进行综述,以探讨其临床应用的可行性。     

Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus

The present study was performed to identify cells responsible for the elimination of T cells reactive with minor lymphocyte-stimulating (Mls) antigens during T cell development. Experiments were carried out in a fetal thymus organ culture (FTOC) system. To examine the tolerance-inducing activity, various populations of cells from adult CBA/J (Mls-1a) mice were injected into deoxyguanosine (dGuo)-treated FTOC of C3H/He (Mls-1b) mice with a microinjector, and 2 d later, the thymus lobes were injected with fetal thymus cells from C3H/He mice as T cell precursors. After 14 d of cultivation, cells were harvested and assayed for the expression of the T cell receptor V beta 6 element. The absence or marked reduction of T cells expressing V beta 6 at high levels (V beta 6high) was regarded as indicating the deletion of Mls-1a-reactive T cells. T cell-depleted populations of thymic as well as splenic cells from CBA/J mice were able to induce clonal deletion. Further characterization of the effector cells was carried out by fractionating the spleen cells before injecting them into dGuo-FTOC. None of the dish-adherent population, dish-nonadherent population, or purified B cells alone were able to induce clonal deletion, whereas the addition of purified B cells to adherent cells restored tolerance inducibility. It was further shown that a combination of CBA/J B cells and C3H/He dendritic cells was effective in eliminating Mls-reactive clones. These results indicate that for the deletion of clones reactive with Mls antigens during T cell development in the thymus, both DC and B cells are required.     

视网膜细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的探索乳鼠视网膜细胞体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的可行性。方法以大鼠BMSCs为研究对象，利用分层共培养的乳鼠视网膜细胞作诱导剂，进行增殖培养、分化诱导；免疫组化法进行细胞性质鉴定。结果加入乳鼠视网膜细胞共培养第7天有神经元样细胞形成，经nestin、NF鉴定为神经元样细胞。结论BMSCs在体外培养条件下，经过新生乳鼠视网膜细胞诱导，可以分化为神经元样细胞。     

NK 细胞上清液提高CTL 细胞对肝癌细胞杀伤力的研究

目的：研究用白细胞介素2（IL‐2）联合IL‐12、IL‐18以及三者共同活化NK细胞所提取的上清液与肝癌细胞共培养是否能提高AFP特异性的细胞毒性T细胞（CTL）对小鼠肝癌细胞的杀伤性。方法提取NK 细胞,分别用IL‐26000 IU／mL、IL‐26000 IU／mL＋ IL‐1210 ng／mL、IL‐26000 IU／mL＋IL‐l8100 ng／mL、IL‐26000 IU／mL＋IL‐1210 ng／mL＋IL‐18100 ng／mL活化NK细胞,3 d后提取上清液,ELISA检测上清液IFNγ表达量,然后将上清液与Hepa1‐6细胞培养过夜,流式细胞仪检测肿瘤细胞表面I类组织相容性抗原（M HC I）表达,以其为靶细胞检测AFP特异性的CTL细胞对 Hepa1‐6细胞杀伤率。结果NK＋IL‐2＋IL‐12、NK＋IL‐2＋IL‐18、NK＋IL‐2＋IL‐12＋IL‐18上清液的IFNγ含量高于NK＋IL‐2上清液的IFNγ含量（P＜0．05）,并且上述三组能有效提高小鼠 Hepa1‐6细胞表面M HC I的表达（P＜0．05）,从而显著提高了AFP特异性的CTL细胞对靶细胞的杀伤活性,然而阻断IFNγ分泌,AFP特异性的CTL细胞对靶细胞的杀伤活性降低。结论 NK 细胞上清液能够增强AFP特异性的CTL对肝癌细胞的杀伤作用。     

干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究与进展

学术背景:干细胞是一群较原始的细胞,它们具有自我更新和多向分化潜能,可以被诱导分化为胰岛素分泌细胞,理论上可提供丰富的胰岛细胞来源.目的:本文就近年来干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究进展做一综述.检索策略:应用计算机检索Pubmed和CNKI数据库1990-2007年期间相关文献,检索词为"干细胞,诱导分化,胰岛素分泌细胞,stem cell,differentiation,islet-producing cell".对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的研究进展.排除标准:重复研究.文献评价:共收集到相关文献162篇,选择其中49篇文献进行重点阅读和分析.49篇文献中,1篇涉及糖尿病及其并发症的治疗,1篇涉及胰岛细胞移植,1篇涉及干细胞在糖尿病治疗中的应用,13篇涉及胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究,4篇涉及脐血来源的干细胞体内分化为胰岛素分泌细胞的研究,10篇涉及骨髓来源的干细胞分化为胰岛素分泌细胞的研究,13篇涉及胰腺干细胞分化为胰岛素分泌细胞的研究,6篇涉及其它器官来源的干细胞分化为胰岛素分泌细胞的研究.资料综合:胰岛细胞移植可以用来治疗1型和部分2型糖尿病,但由于供体细胞来源匮乏,因而寻找新的细胞来源成了当务之急.近年来,干细胞研究为新型胰岛细胞的来源带来了希望.目前用于胰岛细胞来源研究的干细胞主要有胍胎干细胞和成体干细胞,后者根据细胞来源不同分为脐血来源干细胞、骨髓来源干细胞、胰腺干细胞及其他器官来源的干细胞.目前的研究显示,骨髓来源的干细胞可以在体内促进胰腺的再生,并且可以在体外被诱导分化为胰岛样细胞.结论:深入了解干细胞向胰岛β细胞诱导分化的分了调控机制,将会加快糖尿病细胞治疗的研究进展.     

骨髓间充质干细胞向早期神经元样细胞诱导分化的研究

背景骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)不仅能分化成间质细胞,而且能向实质细胞(如心肌细胞)转化.在体外定向诱导MSCs分化成神经细胞,是目前国内外研究热点,具有重大理论意义.目的探讨大鼠MSCs体外诱导分化成神经元的能力.设计随机空白对照实验的研究.地点、材料和干预实验在吉林大学公共卫生学院毒理教研室完成.实验动物采用Wistar大鼠(吉林大学实验动物中心),6周龄,雌雄不限.将2～4代的rMSCs接种在铺有盖玻片的24孔板中.分为3个实验组,一个对照组.实验组分别加入终浓度为0.25,0.50和1.00 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤(isobutylmethlxanthine,IBMX)诱导传代的rMSCs,待细胞分化后进行形态学观察,对照组中不加诱导剂,并用免疫细胞化学方法进行细胞鉴定.主要观察指标培养MSCs的生长情况,诱导后细胞的形态学变化及nestin(小鼠抗大鼠,单克隆),神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)抗体(兔抗鼠,多抗)、微管相关蛋白-2a,bmicrotubule-associated protein-2a,b,MAP-2a,b)的免疫细胞化学检测.结果加入IBMX后,0.25mmol/L组分化成神经元样细胞较少.1.0mmol/L组细胞加入IBMX第2天开始可见细胞陆续死亡.0.5 mmol/L组2 d即可见有神经元样细胞出现,细胞具有典型的神经元形态特征,0.5 mmol/LIBMX诱导细胞效果最好,2 d即可见有神经元样细胞出现,6 d神经元样细胞占细胞总数的(23.2±2.3)%,NSE染色阳性.对照组中未诱导细胞表达nestin,诱导后3 d阳性细胞增多,6 d减少.实验组和对照组均不表达MAP-2a,b.结论体外rMSC能扩增、传代,并被诱导分化成早期神经元样细胞.     

原子力显微镜对正常细胞、肿瘤细胞细胞膜表面形态结构的观察

目的 寻找原子力显微镜（AFM）观察培养细胞获得理想图像的样本制备方法；运用AFM探寻正常细胞膜与肿瘤细胞膜表面结构的异同。方法 摸索培养细胞制备成AFM扫描用标本的方法并进行扫描。结果 2％福尔马林溶液固定标本和枸橼酸盐缓冲液冲洗标本的细胞膜表面都很干净，5％葡萄糖溶液冲洗后标本图像模糊成比。正常Fb细胞膜由较规则的突起与凹陷构成。Ma-Fb细胞膜隆起结构大小相差悬殊，形态多样而且Z轴方向上高度明显高于Fb细胞。Hela细胞和Mcf7细胞均由形状不规则的突起与凹陷构成。结论 2％福尔马林溶液和枸橼酸盐缓冲液适用于AFM标本的制备：正常细胞膜表面隆起与凹陷结构的形态比肿瘤细胞膜规则，大小也较均匀；同种细胞恶变化细胞膜隆起结构形态多样而且体积明显增大；细胞种类不同，细胞膜表面结构也不同。