缺氧对视网膜Müller细胞水通道蛋白4表达的影响

目的 观察体外培养兔视网膜Müller细胞在缺氧条件下水通道蛋白4(AQP4)表达的变化.方法 本实验以体外培养的兔视网膜Müller细胞为研究对象,选定不同缺氧时间体外培养Müller,并采用AO/EB染色检测Müller细胞的凋亡情况,根据细胞凋亡情况选定最适缺氧时间进行检测,利用免疫细胞化学染色、流式细胞术及RT-PCR的方法 对实验组细胞AQP4的表达进行定性及定量测定.结果 Müller细胞缺氧24 h为缺氧最大耐受时间.缺氧组Müller细胞AQP4表达明显低于正常对照组;流式细胞仪检测中波峰位置明显提前,AQP4表达减少;RT-PCR半定量分析显示:AQP4 mRNA的表达比对照组明显降低(P<0.01).结论 缺氧使体外培养兔视网膜Müller细胞AQP4表达下调,缺氧可能影响细胞代谢变化,引起K+外流.     

醒脑静治疗大鼠重型颅脑损伤的作用机制

目的观察醒脑法与传统活血法对重型颅脑损伤大鼠脑组织水肿、凋亡及水通道蛋白4（AQP4）表达的影响,探讨其治疗颅脑损伤的疗效差异及作用机制。 方法SD大鼠72只,随机分为假手术组（12只）,模型组（20只）,醒脑静治疗组（20只）,传统活血治疗组（20只）。采用改良后Feeney方法建立大鼠重型颅脑损伤模型。分别在24 h,48 h,72 h,7 d 4个时间点,假手术组取3只、余各组取5只测定脑组织含水量、HE染色观察脑组织变化情况,免疫组化方法检测受损区域脑组织AQP4的表达并采用TUNEL法检测凋亡细胞,通过RT-PCR验证治疗后AQP4表达水平。 结果模型组各时间点脑组织含水量、损伤灶周围细胞凋亡数及AQP4的表达均高于假手术组,差异具有统计学意义（P<0.05）。醒脑静组及传统活血组各时间点脑组织含水量、AQP4表达水平、细胞凋亡水平均比模型组降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,RT-PCR支持AQP4变化结果。 结论醒脑静可改善重型颅脑损伤后引起的脑水肿及细胞凋亡,效果优于传统活血疗法。其作用机制可能与抑制AQP4在损伤脑组织中的表达、减轻脑细胞损害有关。     

培养星形胶质细胞缺氧/复氧时水通道蛋白4表达的变化

目的:探讨缺氧/复氧对体外培养星形胶质细胞水通道蛋白4(AQP4)表达的影响.方法:培养的大鼠脑皮层星形胶质细胞分成两组:正常对照组和缺氧/复氧组.缺氧8 h后复氧.根据复氧时间不同,又分为复氧0、4、6、8、12、24 h 6个亚组.于各时间点以检测细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)的漏出率,Western blot法检测AQP4的表达.结果:缺氧8 h后随着复氧时间的延长,细胞存活率逐渐降低,至复氧12 h时,达最低,仅有对照组的81.3%,至复氧24 h,又有轻度增加;LDH的漏出率逐渐增多,至复氧24 h达最高峰.AQP4表达随着复氧时间延长而逐步增多,至复氧12 h时达最高峰,为正常对照组的(2.52±0.35)倍,24 h时略有下降.结论:缺氧/复氧过程能对体外培养的星形胶质细胞产生损伤作用的同时,发生了AQP4的表达时程变化.     

缺氧对成牙骨质细胞增殖、凋亡及缺氧相关基因的影响

目的：探讨不同时间缺氧微环境对成牙骨质样细胞OCCM-30增殖、凋亡及缺氧相关基因的影响,了解缺氧在正畸导致的牙骨质吸收中所起的作用。方法利用三气培养箱构建细胞缺氧模型,以常氧条件培养为对照组,利用MTT法测定细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR检测HIF-1α、VEGF mRNA等相关基因的表达变化。结果缺氧可以抑制OCCM-30细胞的增殖,明显提高细胞的凋亡率,并能显著诱导HIF-1α和VEGF mRNA基因的表达,HIF-1αmRNA的表达水平在24 h达到顶峰后进入平台期;而VEGF mRNA的表达水平在36 h后开始逐步上调。结论缺氧微环境能抑制OCCM-30细胞增殖,促进调亡及缺氧相关基因的表达。     

红景天苷对阿糖胞苷诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的影响

本研究旨在探讨红景天苷（salidroside）对阿糖胞苷（Ara-C）诱导的人骨髓间充质干细胞（humanbonemes-enchymalstemcells,hBMMSCs）凋亡影响及其机制。体外分离培养hBMMSC,流式细胞术鉴定免疫表型,特异性染色鉴定hBMMSC体外向成骨、成脂诱导分化能力,MTT法检测细胞增殖情况。实验分4组：对照组、Ara-C组、sali-droside组、Ara-C＋salidroside组;流式细胞术检测细胞凋亡变化;RT-PCR法检测BCL-2、BAXmRNA表达。结果表明,体外成功分离培养hBMMSC;细胞表达CIM4、CD29和HLA-ABC,不表达CD34、CD45和HLA．DR;成骨、成脂诱导21d,茜素红染色可见钙化结节,油红0染色有质滴出现;Ara-C对红景天苷处理的hBMMSC的增殖抑制程度较未经红景天苷处理的hBMMSC明显减低（P〈0．05）;在凋亡方面,Ara-C作用48h后hBMMSC的凋亡率显著高于对照组（P〈0．05）,BCL-2基因表达下调,BAX表达上调;而中剂量红景天苷处理的细胞凋亡率较Ara-C组降低,BCL-2基因表达上调,BAX表达下调（P〈0．05）。结论：红景天苷可抑制Ara-C诱导的hBMMSC凋亡,其机制可能与BCL-2／BAX表达调控有关。     

缺氧诱导体外培养的心肌细胞凋亡及检测方法研究

为探讨缺氧诱导体外培养的心肌细胞凋亡情况，并用不同方法检测，将体外培养的不同方法检测，将体外培养的新生大鼠心肌细胞置于95%氮气及5%二氧化碳孵箱中一定时间造成缺氧损伤的心肌细胞模型，分别用HE染色，电镜，TUNEL法，流式细胞仪技术检测凋亡发生的情况，结果：均观察到缺氧诱导的心肌细胞凋亡，认为缺氧一定时间可以诱导体外培养的心肌细胞凋亡；检测心肌细胞凋亡的方法，需结合形态学及定量方法全面分析。     

Rubratoxin B 诱导人绒癌细胞株凋亡及Bcl-2 mRNA 表达的研究

目的:定量分析rubratoxin B(RB)在体外诱导人绒癌细胞株(BeWo)发生凋亡,并探讨其与抑制凋亡基因Bcl-2mRNA表达的关系。方法:利用MTT、HE染色、annexinV-FITC/PI流式细胞技术定性及定量分析经RB处理后BeWo细胞活细胞及凋亡细胞的变化情况;利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测抑制凋亡基因Bcl-2与RB诱导的BeWo细胞凋亡的关系。结果:RB诱导BeWo细胞凋亡的数量与药物浓度及用药时间明显相关。RT-PCR结果显示Bcl-2mRNA的表达随着凋亡细胞的增加而减少。结论:RB能够诱导BeWo细胞发生凋亡,Bcl-2mRNA表达的下调是RB诱导BeWo细胞凋亡的重要机制。     

藏红花素对缺氧环境下Wistar大鼠视网膜Muller细胞活性和胶质纤维酸性蛋白表达的影响

目的观察不同浓度藏红花素对缺氧条件下RMC活性和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的影响。方法改良Reichenbach等方法原代培养Muller细胞,并采用GFAP和Vimentin染色鉴定RMC。RMC培养基中加人终浓度10μmoL／L、50μmoL／L和100μmoL／L藏红花素,于1—7d计数细胞,于24h和48h台盼蓝染色测定细胞活性,对照组RMC培养基中未加入藏红花素。培养液中加入终浓度为200μmol/L的CoCl2建立化学缺氧模型。实验分4组：缺氧组（H组）、藏红花素处理组（C组）、缺氧＋藏红花素处理组（HC组）和正常对照组（NC组）,其中C和HC组培养液中加入10μmol／L藏红花素。处理24h,台盼蓝染色检测细胞活性,采用Westernblot法半定量检测GFAP的表达。结果含10μmoL／L和50μmol／L藏红花素的培养液中,细胞生长无抑制;100μmol/L藏红花素的培养液中细胞增生受到抑制,培养24h和48hRMC活性分别为（68±7）％、（59±9）％,与对照组相比,明显降低（t24h=3．723,P〈0．05;t48h=4．103,P〈0．05）。在缺氧条件下,正常细胞和10μmoL／L藏红花素的培养液中细胞活性受到明显抑制,藏红花素可减轻缺氧环境对细胞活性的抑制作用。在缺氧条件下,GFAP表达明显升高（t=2．945,P〈0．05）;藏红花素可部分抑制GFAP高表达（t=3．362,P〈0．05）。结论缺氧能诱导体外培养视网膜Muller细胞死亡,适合浓度藏红花素可抑制缺氧诱导的视网膜Muller细胞死亡。     

EGCG 对鼻咽癌CNE-2细胞增殖、凋亡及survivin、VEGF表达的影响

目的:探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对鼻咽癌细胞增殖、凋亡及生存素(survivin)和血管内皮生长因子(VEGF)的影响.方法:体外培养鼻咽癌细胞,以不同质量浓度EGCG处理,采用MTT法检测细胞增殖抑制作用,Hoechst33258染色观察凋亡细胞并计算细胞凋亡率,流式细胞仪检测细胞周期变化,RT-PCR检测survivin和VEGF的表达变化.结果:EGCG处理后,CNE-2细胞增殖明显受到抑制,呈时间和剂量依赖性;CNE-2细胞凋亡率显著升高;CNE-2细胞周期阻滞于G1/G0,表现为浓度依赖性;survivin和VEGF的表达明显下调,随EGCG浓度的增加有下降趋势.结论:EGCG能抑制鼻咽癌细胞增殖、促进其凋亡;机制可能与EGCG下调survivn和VEGF的表达有关.     

沉默ATF5对卵巢癌裸鼠成瘤的影响

目的研究沉默人转录激活因子5（ATF5）后对卵巢癌SKOV-3细胞体外增殖、凋亡及体内成瘤的影响,探讨人类卵巢癌基因治疗的新途径。方法将慢病毒携带的小干扰RNA感染卵巢癌SKOV-3细胞（实验组）,空载体转染的卵巢癌SKOV-3细胞（空载体对照组）和卵巢癌SKOV-3细胞（空白对照组）进行对照,对比观察细胞的生长状态;MTT法检测细胞的增殖生长情况;罗氏凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况;分别于裸鼠皮下接种3组卵巢癌SKOV-3细胞,观察各组裸鼠的存活状态、种植瘤生长情况;RT-PCR检测瘤组织中ATF5mRNA的表达;Western-Blot方法检测瘤组织中ATF5蛋白的表达;苏木素-伊红染色（HE染色）观察瘤组织生物学形态变化。结果经转染ATF5基因的小干扰RNA后,在相同培养时间内3组细胞的增殖和生物学形态没有明显差异,但实验组细胞凋亡数量较其他两组明显增多。皮下接种成瘤后,3组裸鼠的成瘤率没有明显区别,实验组与空载体对照组和空白对照组相比,肿瘤成瘤时间晚,生长缓慢;移植瘤ATF5mRNA表达及蛋白表达降低;细胞分裂象明显减少,凋亡现象明显。结论沉默ATF5对人上皮性卵巢癌裸鼠移植瘤生长有抑制作用,这可能成为卵巢癌基因治疗的新靶点。     

星形胶质细胞水通道蛋白-4在高渗液中的表达变化

目的研究高渗培养液对体外培养星形胶质细胞表达水通道蛋白-4(Aquaporin-4,AQP4)的影响及AQP4在高渗性脱水中的作用.方法取生后2 d的Wistar大鼠的大脑皮层进行星形胶质细胞纯培养,分别予不同程度的高渗培养液作用于星形胶质细胞,建立星形胶质细胞对高渗液反应的实验模型.通过形态学观察、PT-PCR、免疫细胞化学、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法及图像分析等方法,研究体外星形胶质细胞对高渗液的反应及AQP4 mRNA和蛋白的表达变化.结果高渗组各时相点吸光度A值均低于对照组(P＜0.05),星形胶质细胞表现出特征性的细胞脱水形态学变化,AQP4mRNA和蛋白的表达均显著高于对照组(P＜0.01),尤以作用12 h后最明显,而且AQP4 mRNA和蛋白的表达呈显著正相关(rs＞0.8485,Ps＜0.01).结论在高渗状态下,AQP4 mRNA和蛋白的表达增强,AQP4表达上调在高渗性脱水的早期(＜12 h)可能起到重要的代偿作用.     

高渗液对体外培养星形胶质细胞中水通道蛋白4 mRNA表达的影响

目的　研究体外培养星形胶质细胞高渗状态下水通道蛋白 4 (AQP4 ) m RNA表达的变化特点及其所起的作用。方法　取生后 2 d的新生 Wistar大鼠大脑皮质进行星形胶质细胞纯培养 ,分别用不同渗透压的高渗培养液作用于星形胶质细胞 ,建立星形胶质细胞对高渗反应的实验模型 ;采用原位杂交、乳酸脱氢酶(L DH)活性测定及图像分析等方法 ,研究体外培养星形胶质细胞对高渗液的反应和 AQP4 m RNA的表达规律。结果　 32 0、333和 345 m mol/ L的高渗培养液作用于星形胶质细胞 3、6、12和 2 4 h后 ,L DH活性测定的吸光度 A值在各时间点均显著高于对照组 (P均 <0 .0 5 ) ;原位杂交分析表明 ,AQP4 m RNA表达明显增高 ,与正常组相比有显著意义 ,尤以高渗液作用 12 h时最明显 ,而且与作用时间及渗透压相关。结论　在高渗状态下 ,细胞活性明显下降 ,AQP4 m RNA表达增强。 AQP4可能在高渗性脱水的早期起重要的调节作用。     

缺氧环境下子宫内膜腺上皮细胞中微RNA表达谱及细胞凋亡变化

  目的  探究缺氧环境下子宫内膜腺上皮细胞(endometrial glandular epithelial cell, EEC)中微RNA(micro-RNA,miRNA)表达谱变化及其对凋亡的影响。  方法  取对数生长期EEC,接种至六孔板(1×10⁵个细胞/孔)并随机分为缺氧组和对照组。缺氧组、对照组分别置于缺氧环境(O₂∶N₂∶CO₂体积比为1∶94∶5)和正常氧环境(O₂∶CO₂体积比为95∶5)中培养。培养4 h后收集细胞,加入Trizol并提取总RNA。采用高通量测序法测定两组EEC中miRNA表达谱变化,采用实时荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)法检测miR-7704、miR-7974基因表达水平,采用流式细胞术检测EEC凋亡情况,采用蛋白印迹法(Western blot)检测p53和凋亡相关蛋白表达变化。  结果  高通量测序对21种常见miRNA表达水平检测后发现,与对照组比较,缺氧组EEC中16种miRNA表达上调,5种miRNA表达下调;其中对照组表达丰度较高的miR-7704和miR-7974在缺氧组表达下降最为显著(P均＜0.05)。RT-PCR结果显示,与对照组比较,缺氧组EEC中miR-7704和miR-7974相对表达量分别降低20%、80%。流式细胞术检测结果显示,缺氧组早期凋亡率及晚期凋亡率均高于对照组(P均＜0.001)。Western blot检测结果显示,与对照组比较,缺氧组EEC中p53表达升高,抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2表达降低(P均＜0.05)。  结论  缺氧环境可诱导EEC中miRNA表达谱改变,其中以miR-7974表达下调最为显著。p53可能是miR-7974的靶蛋白,缺氧诱发的EEC凋亡可能通过下调miR-7974水平而促进p53表达实现。     

低渗液对AQP4蛋白在体外培养星形胶质细胞中的表达变化

目的　研究低渗培养液对星形胶质细胞AQP4蛋白的表达变化 ,并探讨其在脑水肿中的作用机制。方法　取出生后 2d的Wistar大鼠大脑皮层进行星形胶质细胞纯培养 ,分别予不同程度的低渗培养液作用于星形胶质细胞 ,建立星形胶质细胞对低渗压反应的实验模型。应用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法测定细胞活性 ,采用免疫细胞化学法检测AQP4蛋白的表达 ,通过光镜观察低渗液对星形胶质细胞形态学影响。结果　体外培养的星形胶质细胞在不同程度的低渗培养液作用 3、6、12、2 4h后 ,各时相点的AQP4蛋白表达水平均明显高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,而且与作用时间和低渗压的程度密切相关 ;在光镜下 ,星形胶质细胞出现典型的细胞水肿形态学改变 ,其活性明显下降。结论　低渗液可导致星形胶质细胞水肿 ,AQP4蛋白表达增强 ,而且AQP4表达上调与低渗压的程度和作用时间有关 ,抑制AQP4的表达可能为脑水肿的治疗提供新的理论依据。     

低渗液对星形胶质细胞水通道蛋白-9表达的影响

目的探讨体外培养星形胶质细胞在低渗状态下水通道蛋白-9(aquaporin-9,AQP9)表达的变化特点及其所起的作用。方法取生后2d的Wistar大鼠大脑皮层进行星形胶质细胞纯培养,随机分为对照组和低渗组(又分268、254、240mmol/L三个组),每组分为3、6、12、24h共4个时间点,每个时间点细胞孔数为6。对照组予正常培养液常规培养,低渗组分别予不同渗透压的低渗液作用于细胞,建立星形胶质细胞对低渗液反应的实验模型。通过采用原位杂交检测AQP9mRNA的表达,乳酸脱氢酶活性的测定及图像分析等方法研究星形胶质细胞对低渗液的反应及AQP9的表达变化。结果对照组在正常渗透压培养液中培养3、6、12、24h后,AQP9表达差异无统计学意义(P>0.05)。在相同的作用时间条件下,各低渗组细胞AQP9mRNA表达水平均明显高于对照组(P<0.05)。尤以作用12h后明显,而且与作用时间和低渗液的程度密切相关;同时细胞存活能力明显下降,其严重程度与低渗液的作用时间和渗透压有关。结论低渗液可导致细胞的生存能力下降、AQP9mRNA表达增强,提示星形胶质细胞AQP9的表达与渗透压可能直接相关,AQP9可能参与脑水肿的形成。     

水通道蛋白在肿瘤细胞中的表达及意义

目的探讨水通道蛋白AQP1-AQP9,AQP11及AQP12在多种肿瘤细胞系中的表达并探讨其意义。方法利用RT-PCR方法对小鼠乳腺癌细胞系4T1、mmt和lewis肺癌细胞系(LLC)表达水通道情况进行初步分析。结果4T1细胞表达AQP5、AQP7及AQP11,AQP5只有少量表达,后两者表达水平较高;在lewis肺癌(LLC)中有AQP7,AQP8及AQP11表达,其中AQP7和AQP11表达较高;在mmt细胞中AQP3、AQP4、AQP7及AQP11均被检出有表达,AQP7表达程度较高。结论肿瘤细胞表达水通道蛋白是一普遍现象,可能与肿瘤细胞易转移和高度增殖等特性有关。深入研究水通道蛋白在肿瘤细胞增殖及迁移中的作用,将为肿瘤的发生、发展及转移提供新的机理。     

大鼠弥散性血管内凝血时水通道蛋白1基因表达与肾脏损伤的关系

目的 研究对Wistar大鼠滴注脂多糖(LPS)造成弥散性血管内凝血(DIC)后,肾脏细胞表面水通道蛋白1(AQP1)mRNA表达变化与其损伤的关系.方法 清洁级,雄性Wistar大鼠50只随机分为5组(每组10只):对照组(经鼠尾静脉持续4 h滴注10 mL生理盐水后直接取血及组织);DIC组:滴注LPS(30 mg/kg,溶于10mL生理盐水持续4 h鼠尾静脉滴注)后4 h,6 h,8 h,10 h组,在滴注LPS后4 h,6 h,8 h及10 h取血及组织.检测各组血小板(PLT)计数、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、D-二聚体(D-D);各组.肾、肺组织苏木苏.伊红(HE)染色,观察肾、肺组织中微血栓形成情况及病理变化(结合血液学指标与病理变化判断DIC病程),提取各组大鼠肾组织总RNA,RT-PCR检测AQP1 mRNA水平的表达.采用SNK-q方法对结果进行统计学分析.结果 各实验组PLT计数、PT、APTT、FIB及D-D与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01);滴注LPS后4 h的AOP1 mRNA表达较对照组下调(P<0.01),6 h达最低;滴注LPS后6 h肾小管细胞浊肿,8h肾小管细胞变性坏死.结论 肾脏AQP1 mRNA表达下调先于肾小管细胞的损伤,表明AQP1参与了大鼠DIC时肾小管细胞的损伤.     

葡萄糖降解产物对内皮细胞AQP1及eNOS表达影响研究

目的研究腹膜透析液毒性成份之一-葡萄糖降解产物（GDPs）对内皮细胞水孔蛋白1（AQP1）及eNOS表达影响。方法选用两种相关的GDPs-2-糠醛（Fur）及甲基乙二醛（MGly）,采用与传统腹膜透析液浓度相当的GDPs刺激内皮细胞系tEnd.124h（Fur 0.8 uM;MGly 35 uM）,以培养液DMEM作为对照组,研究GDPs对内皮细胞AQP1及eNOS表达影响。并进一步通过时间依赖性及浓度依赖性分析研究GDPs对AQP1 mRNA表达影响。使用RT-PCR检测AQP1及eNOS基因表达。使用Western blot检测AQP1蛋白表达。结果内皮细胞系tEnd.1经GDPs（Fur 0.8 uM;MGly 35 uM）刺激24h后,Fur及MGly显著上调内皮细胞eNOS mRNA表达（P〈0.05）。GDPs对AQP1 mRNA表达有降低的趋势但无统计学意义。时间依赖性及浓度依赖性研究同样提示GDPs对AQP1 mRNA表达有下降的趋势。蛋白质印迹分析（Western blot）检测有相似的结果。结论GDPs促进内皮细胞eNOS的表达但并不促进AQP1的表达,GDPs的这种作用可能参与长期腹膜透析过程中腹膜血管新生及超滤衰竭的发生。