HPV6感染的尖锐湿疣患者血清抗体反应研究

目的　探讨我国HPV 6感染的尖锐湿疣患者血清抗体反应 ,以评价我国HPV感染的血清学诊断方法 ,并为疫苗研制提供理论依据。方法　采用重组杆状病毒 昆虫细胞系统制备HPV病毒样颗粒 ,通过ELISA法检测 3组共136份标本的血清抗体。结果　尖锐湿疣组血清抗体最高 (阳性率 75 .0 % ,OD平均值为 0 .111± 0 .0 94) ,较健康对照组(阳性率 2 .8% ,OD平均值 0 .0 12± 0 .0 2 4)和宫颈癌组 (阳性率 14 .3 % ,OD平均值 0 .0 2 9± 0 .0 2 2 )差异均有显著性 (P <0 .0 1)。结论　尖锐湿疣患者体内可检测到型特异性抗体 ,尤以女性和复发患者为显著 ,HPV 11感染与HPV 6b血清抗体相关 ,提示HPV病毒样颗粒可用作HPV感染的血清学诊断。     

HPV6型E7在尖锐湿疣初发与复发组织中的表达

目的本研究旨在分析HPV6型早期蛋白E7在尖锐湿疣初发、复发与正常组织中的表达情况,以探讨早期蛋白E7在尖锐湿疣病情转归中的生物学意义。方法采用u ltrasensitiveTM s-p免疫组化法对56例初发尖锐湿疣患者的活检组织,35例复发尖锐湿疣患者的活检组织及27例正常宫颈上皮组织中的HPV6型E7蛋白的表达情况进行测定。结果56例初发尖锐湿疣患者HPV6型E7蛋白的阳性表达率为69.5%,35例复发性尖锐湿疣患者的活检组织中HPV6型E7蛋白的阳性表达率为71.4%,27例正常宫颈上皮组织中HPV6型E7蛋白的阳性表达率为0。尖锐湿疣患者初发与复发组织的HPV6型E7蛋白表达和正常宫颈上皮组织相比均有显著性差异(P<0.001)。结论HPV6型早期蛋白E7与尖锐湿疣的发生密切相关,在尖锐湿疣的发展中也起着重要的作用,与其复发存在一定的关系,但没有统计学意义。HPV6型早期蛋白E7与尖锐湿疣的病情转归的联系尚需进一步研究。     

自行制备的HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗体检测尖锐湿疣皮损的研究

目的 采用自行制备的HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗体检测外生殖器尖锐湿疣皮损组织中HPV6b和11型E7蛋白的表达,探讨该抗体在临床检验中的应用价值。 方法 55例经临床和病理确诊的尖锐湿疣皮损石蜡标本,用自行制备的HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗体进行免疫组化检测,其中18例皮损冰冻标本用RT-PCR法测定HPV6b和11型E7蛋白mRNA表达,分析与免疫组化结果的符合率。 结果 55例尖锐湿疣皮损的免疫组化染色显示,HPV6b和11型E7蛋白为胞核染色,且皮损全层表皮细胞均有阳性表达,但基底层阳性细胞较多。HPV6b和11型E7蛋白阳性表达率分别为76.36%（42/55）和58.18%（32/55）,总阳性表达率为94.55%（52/55）,两蛋白双阳性率为40.00%（22/55）,两蛋白均阴性表达为3例（5.45%）。18例尖锐湿疣冰冻标本经RT-PCR法检测,HPV6b和11型E7 mRNA阳性表达分别为15例和10例,双阳性表达7例,其阳性表达型别与免疫组化结果完全一致,符合率均为100%。 结论 该自行制备的HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗体免疫组化法检测尖锐湿疣皮损,检测结果直观,可以观察到HPV6b和11型感染细胞在病损中的分布位置。     

热休克蛋白在尖锐湿疣组织中的检测及其与HPV感染相关性

目的　探讨热休克蛋白 70(HSP70)在尖锐湿疣(CA)组织中的检测及其与人乳头瘤病毒 (HPV)感染的关系。方法　采用免疫组化法检测了 24例CA、46例宫颈癌和 28例正常宫颈组织HSP70,用PCR技术对各组织标本的HPV-DNA进行检测和 6, 1 1, 1 6, 1 8分型。结果　HSP7 0在CA和宫颈癌组的阳性率显著高于正常宫颈对照组 (P<0. 01)。CA组HPV6, 11型DNA阳性者HSP70的检出率显著高于阴性者(P<0. 05),宫颈癌组HPV16, 18型DNA阳性者与阴性者HSP70的检出率差异无显著性(P>0. 05)。结论　HSP70的表达与尖锐湿疣的发病有关,HSP70在尖锐湿疣组织中的表达与HPV的感染明显相关。     

HPV16型E7抗原表位的研究进展

人乳头瘤病毒(HPV)常见型别中,良性型HPV6、11型和恶性型HPV16、18型等感染可以导致尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤和宫颈癌等疾病^[1,2]。HPV16基因组中E7基因主要与细胞转化功能及致癌有关,由于HPV感染局部抗原呈递障碍^[3,4]、HPV抗原对局部免疫反应的负性调节^[5,6]和细胞毒性T淋巴细胞(cyto-toxic Tlymphocyte,CTL)难与HPV感染的角质形成细胞相互作用^[7]等原因,从感染早期到肿瘤形成期均可持续检测到E7蛋白的表达。该蛋白作为一种理想的免疫治疗靶抗原在研究中倍受重视。筛选和鉴定E7抗原CTL表位并进行特异性免疫治疗具有重要的临床应用价值。     

应用组织芯片技术观察HPV16/18相关外阴尖锐湿疣DNA倍体类型及cyclin D1、P53、P21WAF1蛋白的表达

目的探讨HPV16/18阳性的尖锐湿疣DNA倍体和cyclin D1、P53、P21WAF1蛋白表达的改变.方法使用组织芯片技术和DNA计算机图像分析方法观察227例外阴尖锐湿疣和21例外阴鳞状细胞癌的DNA倍体类型,并进行cyclin D1、P53、P21WAF1免疫组化研究.结果HPV 16/18阳性外阴尖锐湿疣2C细胞占(44.36±6.66)%,3C～4C占(37.72±8.43)%,5C占(15.21±6.33)%,＞5C占(2.71±1.04)%.98例HPV16/18阳性尖锐湿疣中,cyclin D1、P53、P21WAF1阳性者分别为39例(39.80%)、52例(53.06%)、47例(47.96%).HPV 16/18阳性外阴尖锐湿疣与阴性者差异有显著性(P＜0.01).结论HPV16/18阳性外阴尖锐湿疣DNA倍体图像分析显示高度增殖活性,cyclin D1、P53高表达,P21WAF1低表达.     

P53,Fas,Bcl-2蛋白在尖锐湿疣组织中的检出及其与HPV感染的相关性

目的　探讨P5 3 ,Fas ,Bcl 2蛋白在尖锐湿疣 (CA)组织中的检出情况及其与人乳头瘤病毒 (HPV)感染的关系。方法　采用标准免疫组化法检测了 2 4例CA、46例宫颈癌和 2 8例正常宫颈组织P5 3 ,Fas ,Bcl 2蛋白 ,用PCR技术对各组织标本的HPV DNA进行检测和 6,11,16,18分型。结果　P5 3 ,Fas ,Bcl 2蛋白在CA组的阳性率显著高于正常对照组 (P <0 .0 0 1) ;CA组和宫颈癌组之间差异无显著性 (P >0 .0 5 )。综合分析 ,蛋白阳性率与HPV感染率密切相关 (P <0 .0 5 ) ,但CA组或宫颈癌组的蛋白阳性率与HPV 6/11型或 16/18型的检出与否无统计学意义 (P >0 .0 5 )。结论　P5 3 ,Fas ,Bcl 2蛋白与尖锐湿疣的发病有密切关系 ,凋亡基因的表达可能抑制HPV的增殖     

HPV、CA125、CA153、CA199联合检测对宫颈癌的诊断价值

目的探讨人乳头状瘤病毒(HPV)、癌抗原125(CA125)、CA153、CA199联合检测用于诊断宫颈癌的价值。方法选取2014年2月至2018年2月秦皇岛市第一医院诊治的50例经手术病理诊断确诊为宫颈癌的患者作为研究对象。采用分层整群抽样回顾性分析的方法,抽取本院经病理诊断确诊为宫颈癌患者为宫颈癌组,宫颈良性肿瘤患者为良性肿瘤组,抽取同期在本院接受常规体检的健康女性为健康对照组,每组各50例。检测并对比各组血清肿瘤标志物表达及阳性检出率,对比各组HPV各亚型阳性检出率,分析各标志物单独与联合检测用于诊断宫颈癌的价值。结果三组一般资料比较,差异无统计学意义(P0.05);宫颈癌组HPV16、HPV18、联合检测阳性检出率最高,其次为良性肿瘤组、健康对照组,组间比较,差异具有统计学意义(P0.05);三组HPV31、HPV58阳性检出率比较,差异均无统计学意义(P0.05);宫颈癌组患者CA125、CA153、CA199表达最高,其次为良性肿瘤组、健康对照组,组间比较,差异具有统计学意义(P0.05);宫颈癌组各血清肿瘤标志物阳性检出率最高,其次为良性肿瘤组、健康对照组,组间比较,差异具有统计学意义(P0.05);HPV16与各血清肿瘤标志物联合检测诊断宫颈癌、良性肿瘤的阳性率分别为94.00%、18.00%;特异度方面,联合检测低于CA199;灵敏度与准确度方面,联合检测明显高于各指标单独检测;差异具有统计学意义(P0.05)。各指标单独检测与联合检测阳性预测值比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论 HPV与血清肿瘤标志物联合检测用于宫颈癌诊断具有很高的应用价值,联合检测具有一定的临床应用优势,较单独检测灵敏度、准确性更好,值得推广应用。     

尖锐湿疣患者外周血及经体外诱生的HPV16抗原特异性CD8+细胞毒性T细胞检测

目的 研究尖锐湿疣患者外周血HPV16抗原特异性CD8⁺细胞毒性T细胞(CTL)表型变化及正常人T细胞对病毒抗原肽体外刺激的细胞免疫应答反应在尖锐湿疣发病机制中的作用。方法 采用免疫荧光标染重组MHCⅠ类分子-多肽五聚体技术,流式细胞仪定量检测10例尖锐湿疣患者外周血HPV16E7_11-20(HLA-A^*0201/YMLDLQPETF)抗原特异性CTL(Pent⁺CD8⁺)、活化CTL(Pent⁺CD8⁺CD69⁺)及记忆性CTL(Pent⁺D8⁺CD45RO⁺)数量。同时,用HPV16E7_11-20合成多肽、重组人白介素7、白介素2体外刺激13例正常人外周血单一核细胞产生抗原特异性CTL,并对其进行表型分析,以无关肽HBVcore_18-27作为阴性对照。结果 尖锐湿疣患者外周血CD8⁺T细胞中HPV16抗原特异性CTL、活化CTL及记忆性CTL百分数分别为0.76%±0.43%.0.36%±0.20%及0.33%±0.15%,对照组分别为0.24%±0.07%,0.17%±0.05%及0.15%±0.06%。两组比较,P值分别<0.01,<0.05及<0.01。病毒多肽体外刺激T细胞7d后,抗原特异性CTL、活化CTL及记忆性CTL百分数分别为0.75%±0.16%,0.35%±0.15%及0.33%±0.18%,均比非刺激组的0.24%±0.06%,0.16%±0.03%及0.13%±0.04%明显增多,P值均<0.01。结论 HPV感染诱导CD8⁺T细胞克隆性增殖,产生抗原特异性CD8⁺CTL,高效、特异性直接杀伤病毒感染的靶细胞,在抗病毒T细胞免疫应答过程中发挥作用。     

HPV6型E6与结核杆菌HSP70融合基因的构建及原核表达

目的构建HPV6型E6抗原与结核杆菌HSP70的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序正确后,再通过PCR方法扩增HPV6型E6基因片段,测序后插入HSP70基因的5′端,构建HPV6E6与结核杆菌HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-E6-HSP70;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α,进行诱导表达和分离纯化。结果成功地构建了pGEX-E6-HSP70原核表达质粒,诱导表达产物与抗GST抗体在113 kD处有很强的交叉反应;大肠杆菌超声破碎后的上清液用SDS-PAGE检测到表达的蛋白多为可溶性融合蛋白;经GST融合蛋白表达系统纯化,得到了E6与结核杆菌HSP70的可溶性融合蛋白。结论成功获得HPV6型E6与结核杆菌HSP70的融合蛋白,为研究HPV6型E6与结核杆菌HSP70融合蛋白疫苗在尖锐湿疣治疗中的作用提供了材料。     

人乳头瘤病毒11型E6的原核表达

目的　构建、克隆人乳头瘤病毒 11型 (HPV11)E6蛋白基因 ,并进行表达、纯化和鉴定。方法　用PCR法 ,从尖锐湿疣 (CA)标本中扩增出HPV 11型E6蛋白基因 ,与 pET3 2a载体连接成重组表达质粒pET3 2a/E6;重组质粒转入BL2 1大肠杆菌 ,经诱导表达硫氧还蛋白E6融合蛋白 (Trx E6) ;该蛋白经 3SNTAResin纯化柱纯化 ,SDS PAGE和WesternBlotting检测鉴定。 结果　经酶切及序列分析鉴定 ,重组质粒 pET3 2a/E6成功构建 ,诱导后高表达Trx E6融合蛋白 ,WesternBlotting鉴定证实表达蛋白分子量为 3 60 0 0D的Trx E6融合蛋白。结论　获得高表达、高纯度的HPV11E6蛋白 ,为该蛋白的功能及免疫学分析及CA的疫苗研究打下了基础。     

梅毒螺旋体重组蛋白Tp0136的表达、纯化及免疫活性分析

【摘要】 目的 克隆并表达梅毒螺旋体Tp0136基因,对其表达产物进行纯化以及免疫活性分析。方法 全基因合成Tp0136基因,构建E.coli表达载体;诱导表达并纯化重组蛋白,用SDS-PAGE和Western印迹鉴定。用纯化的重组蛋白Tp0136免疫新西兰兔,并以重组Tp0136作为包被抗原建立间接酶联免疫吸附试验（ELISA）以鉴定其免疫原性,Western印迹检测梅毒阳性血清鉴定其免疫反应性。结果 成功构建E.coli表达载体pET28a-Tp0136,并表达和纯化出膜蛋白Tp0136,相对分子质量为50 000,纯度 > 95%。用重组蛋白Tp0136免疫新西兰兔,能刺激其产生高滴度抗体,具有较强的免疫原性。Western印迹显示其能与梅毒阳性血清发生特异性反应,具有较好的免疫反应性。结论 成功表达具有Tp0136全基因和较强免疫活性的膜蛋白,Ｔp０１３６可能在梅毒螺旋体的免疫致病机制中起到重要作用。     

人乳头瘤病毒18型E6E7反义RNA表达重组体的构建

目的　为了探讨人乳头瘤病毒 (HPV)的致病机理和寻找由HPV所致疾病的治疗途径 ,研究了HPV1 8型E6E7反义RNA表达重组体的构建。方法　以HPV1 8型全基因质粒为模板 ,聚合酶链反应扩增出HPV 1 8型E6E7区 81 6bp片段 ,以逆转录病毒pLNSX为载体 ,构建HPV 1 8型E6E7逆转录病毒重组体 ,并以限制性内切酶酶切和Southern杂交分别鉴定插入方向和特异性检测。结果和结论　筛选出可表达HPV1 8型E6E7逆转录病毒重组体。该反义RNA表达重组体的构建为进一步研究E6E7基因的作用 ,以及探索是否能通过反义技术调控E6E7基因的表达打下基础。     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的 建立稳定表达人乳头瘤病毒（HPV）16E7蛋白的HaCaT细胞株。方法 利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1（+）中,构建真核表达质粒pcDNA3.1（+）-HPV16E7。将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定。结果 经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1（+）-HPV16E7成功。RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达。结论 成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株。     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

人乳头瘤病毒6型L1蛋白在原核表达体系中的表达

目的：比较人乳头瘤病毒6型(HPV6)L1序列的变异，并筛选有代表性的分离标本进行重组HPV6 L1蛋白的表达和抗原性检测。方法：根据不同临床特征选择主要致病型HPV6型8个分离标本，扩增L1基因，构建重组测序质粒。分析L1区的氮基酸序列变异状况，选择L1序列变异较大的临床分离标本，通过对HPV6 L1基因的起始和终止端进行基因定点改造，连于表达载体质粒pET32a，在原核表达体系表达重组HPV6 L1蛋白，并进行L1蛋白的抗原性检测结果：HPV6型8个分离标本中有6个分离标本L1区的蛋白质一级结构中分别有1～3个氨基酸发生变异，原核表达重组L1蛋白可与HPV6L1抗体发生特异反应。说明HPV6 L1序列的变异并未影响L1蛋白的抗原性。结论：本临床分离标本可提供发展HPV6 L1蛋白和病毒样颗粒(VLP)疫苗的候选目的基因，并可通过原核表达体系表达重组HPV L1蛋白进行L1蛋白的免疫学分析，以及L1蛋白疫苗的研究。     

GST-HPV18 E7融合蛋白纯化及相互作用蛋白的检测

目的筛选人类乳头瘤病毒(HPV)18E7相互作用蛋白质,为进一步研究HPV18E7的功能及致癌机理提供线索。方法通过基因工程技术体外构建表达载体,诱导可溶性GST-HPV18E7融合蛋白的高效表达,glutathione Sepharose4B亲和层析纯化,利用GST-pulldown方法初步筛选与HPV18E7结合的蛋白质,并经双向电泳分离,质谱分析,用Mascot软件在蛋白质数据库中进行检索并鉴定。结果纯化的GST-HPV18E7融合蛋白与CHO细胞相互作用后,捕获到与HPV18E7作用的蛋白质,经双向电泳分离得到分辨率较好的图谱,并对其中的26个蛋白质点进行分析,初步鉴定出19个涉及参与细胞的增殖、分化、细胞周期调控、免疫调节及物质代谢等方面的蛋白质。结论所鉴定出的与HPV18E7相互作用的蛋白质,有望成为今后研究HPV致癌机理及抗病毒治疗的候选靶蛋白。