microRNA-136基于Wnt信号通路在黑素瘤EMT中的作用

目的探讨microRNA-136(miR-136)基于Wnt信号通路在黑素瘤上皮-间充质细胞转化(EMT)中的调控作用。方法常规培养正常小鼠A9细胞(阴性对照组)和小鼠黑素瘤B16细胞,采用脂质体转染法将B16细胞分为空白组(只转染试剂,无转染序列)、NC组(转染miR-136 nc)、miR-136模拟组(转染miR-136模拟物)、miR-136抑制组(转染miR-136抑制剂)。通过qRT-PCR法检测各组细胞中miR-136的表达,qRT-PCR及Western blot实验分别检测各组细胞Wnt3a、β-catenin、Ecadherin及N-cadherin mRNA及蛋白表达的差距。结果与阴性对照组相比,其他各组miR-136表达均显著降低,空白组与NC组比较差异无统计学意义(P0. 05)。相对于空白组与NC组,miR-136模拟组miR-136表达显著增加(P 0. 05); miR-136抑制组miR-136的表达明显降低(P 0. 05)。与对照组相比,其他各组E-cadherin mRNA及蛋白表达显著降低(P均0. 05)。β-catenin、Wnt3a、N-cadherin的mRNA及蛋白表达显著增加(P均0. 05)。空白组与NC组比较差异无统计学意义(P 0. 05)。与空白组和NC组相比,miR-136模拟组E-cadherin的mRNA及蛋白表达显著增加(P 0. 05);β-catenin、Wnt3a和N-cadherin的mRNA及蛋白表达均显著降低(P均0. 05)。miR-136抑制组E-cadherin的mRNA及蛋白表达显著降低(P均0. 05),而β-catenin、wnt3a和N-cadherin的mRNA及蛋白表达显著升高(P均0. 05),组间差距均具有统计学意义。结论黑素瘤细胞中miR-136水平较正常细胞降低,过度表达的miR-136通过下调Wnt信号传导途径,抑制黑素瘤细胞的EMT。     

Beclin1过表达对黑素瘤SK-MEL-2细胞生物学行为的影响

【摘要】 目的 探讨自噬标志基因Beclin1过表达对黑素瘤SK-MEL-2细胞生物学行为的影响。方法 Western印迹技术检测黑素瘤细胞A375、SK-MEL-2中Beclin1的蛋白表达水平，选取低表达 Beclin1蛋白的SK-MEL-2细胞株作为研究对象，将细胞分为空白组、阴性对照组、实验组，空白组不作处理，阴性对照组转染pcDNA.3.1/myc-His（-）A，实验组转染pcDNA3.1-Beclin1质粒。培养一定时间后，采用CCK8法分析Beclin1对细胞增殖的影响；Transwell实验和细胞划痕实验观察Beclin1过表达对SK-MEL-2细胞侵袭和迁移能力的影响。采用重复测量方差分析和完全随机设计方差分析检验各组间的指标差异，组间比较采用LSD-t检验。结果 SK-MEL-2细胞Beclin1蛋白相对表达水平（0.037 ± 0.010）显著低于A375细胞（0.670 ± 0.150），F = 46.62，P＜0.05。实验组Beclin1蛋白相对表达水平（0.32 ± 0.04）显著高于阴性对照组（0.06 ± 0.02）和空白组（0.07 ± 0.02），均P＜0.05。CCK8实验结果显示，不同组间、不同时间细胞增殖率差异均有统计学意义（F组间 = 1 077.36，F时间 = 4 903.04，均P＜0.05），组别和时间之间有交互作用（F交互 = 205.20，P＜0.05）。Transwell实验显示，24 h后实验组高倍（× 200）视野下穿过小室的细胞数（18.67 ± 1.19）明显低于阴性对照组（87.89 ± 6.05）和空白组（86.78 ± 5.93），均P＜0.05；划痕实验中24、48 h时实验组细胞迁移距离均显著低于空白组和阴性对照组（P＜0.05）。结论 Beclin1过表达可显著抑制SK-MEL-2细胞的增殖、侵袭和迁移。     

丹参酮ⅡA对雷帕霉素诱导自噬M2巨噬细胞共培养的皮肤黑素瘤A375细胞EMT的影响

 

目的 通过建立肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）自噬水平改变对与之共培养的A375细胞的体系,进一步明确TAMs自噬在调控A375细胞上皮间质转化（EMT）及迁移侵袭过程中的作用。 方法 用PMA和IL-4相继作用于人单核细胞THP-1 72 h诱导其成M2型,流式细胞术及免疫荧光检测鉴定M2表面CD68、CD204、CD206等标志性分子表达情况,鉴定TAMs极化效率。用自噬调节剂雷帕霉素干预TAMs（M2） 24 h,去除自噬调节药物的干预48 h后,通过蛋白免疫印迹方法以及免疫荧光检测各组细胞LC3-Ⅱ和Beclin-1表达,确定药物干预后的TAMs自噬水平。将雷帕霉素干预后的TAMs与人黑素瘤A375细胞进行非接触共培养,48 h后加入不同浓度TanⅡA 1 mg/L（低浓度）组、4 mg/L(高浓度）组,继续培养48 h后,Western blot检测A375细胞EMT相关因子的表达,并通过transwell检测A375细胞的侵袭和迁移能力。 结果 人单核细胞THP-1经PMA和IL-4先后作用共72 h后,细胞状态由半悬浮变为贴壁,经流式细胞术、免疫荧光检测发现M2表面CD68、CD204、CD206的表达较M0组明显增强,差异具有统计学意义(均P<0.05)。用自噬调节剂雷帕霉素干预TAMs 24 h后,免疫荧光、Western blot检测显示,LC3-Ⅱ及Beclin-1的表达明显上调,差异具有统计学意义(均P<0.05)。TAMs和A375细胞非接触共培养48 h后,不同浓度的TanⅡA作用于细胞,Western Blot检测显示,相对于空白组,TanⅡA低浓度组和高浓度组Beclin1、LC3-Ⅱ和E-cadherin蛋白表达均显著升高,N-cadherin蛋白表达均显著降低,组间差异均具有统计学意义（均P<0.05）。transwell实验显示,TanⅡA低浓度组和TanⅡA高浓度组处理后的A375细胞,其迁移、侵袭能力均有所下降,组间差异具有统计学意义(均P<0.05)。结论 雷帕霉素可以诱导TAMs发生自噬,TanⅡA可以抑制自噬TAMs与之共培养的黑素瘤A375细胞的EMT过程,从而抑制其侵袭和转移。

     

早老蛋白增强子2基因沉默对HaCaT细胞增殖及γ分泌酶表达的影响

【摘要】 目的 构建早老蛋白增强子2（PSENEN）基因沉默的人永生化角质形成细胞（HaCaT）模型,探究PSENEN基因表达下调对HaCaT细胞增殖以及γ分泌酶表达的影响。方法 设计3组靶向PSENEN基因的shRNA序列,与线性化的LV3-pGLV-h1-GFP-puro载体构建慢病毒重组表达质粒,经酶切及测序鉴定后,进行慢病毒的包装、纯化和滴度测定。将HaCaT细胞分为5组进行转染：shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组分别加入含沉默PSENEN基因的shRNA1、shRNA2、shRNA3慢病毒原液,NC组加入含阴性对照shNC慢病毒原液,空白组不加病毒液。转染完成后,荧光显微镜下观察荧光表达,流式细胞仪检测转染效率。CCK8法测定HaCaT细胞增殖活性,实时荧光定量PCR（qPCR）、Western印迹法分别检测PSENEN、呆蛋白（NCT）、早老蛋白1（PS1）、前咽缺陷蛋白1a（APH1a）mRNA、蛋白的相对表达量。统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 倒置荧光显微镜下观察到shRNA1 ~ shRNA3组、NC组均有荧光表达,流式细胞仪示转染效率均达98%以上。qPCR、Western印迹法显示,与NC组（1.054 ± 0.272、1.076 ± 0.075）相比,shRNA1、shRNA2、shRNA3组PSENEN mRNA（0.187 ± 0.010、0.163 ± 0.022、0.174 ± 0.009）、蛋白（0.219 ± 0.097、0.208 ± 0.014、0.185 ± 0.062）表达均显著降低（均P < 0.001）。CCK8法显示,与NC组相比,shRNA1组细胞增殖活性在0、12、36、48 h均显著增高（均P < 0.05）,24和60 h差异无统计学意义（均P > 0.05）;shRNA2、shRNA3组在0、12、24、36、48、60 h细胞增殖水平均显著高于NC组（均P < 0.05）。shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组、NC组、空白组间NCT、PS1、APH1a基因mRNA表达差异无统计学意义（F值分别为8.168、4.644、1.981,均P > 0.05）,mNCT、imNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白相对表达差异有统计学意义（F值分别为39.268、5.929、27.842、20.663,均P ≤ 0.01）。与NC组相比,shRNA1、shRNA2、shRNA3组mNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白表达均显著降低（均P < 0.01）,imNCT蛋白表达变化无统计学意义（均P > 0.05）。结论 成功构建了PSENEN基因沉默的HaCaT细胞模型,PSENEN基因沉默会引起HaCaT细胞增殖活性增强,γ分泌酶其他亚基蛋白含量下降。     

过表达NF-E2相关因子2对白癜风黑素细胞PIG3V线粒体生物合成和功能的影响

目的 探讨过表达NF-E2相关因子2（Nrf2）对黑素细胞线粒体合成和功能的影响。 方法 构建含有人Nrf2基因全长的过表达质粒Nrf2-pEX-1,用该质粒瞬时转染白癜风患者表皮黑素细胞系（PIG3V）。实验分为空白组（不含质粒）、对照组（转染pEX-1空质粒）、过表达组（转染pEX-1-Nrf2过表达质粒）。过表达Nrf2后,RT-PCR和Western印迹法检测PIG3V线粒体生物合成相关的Nrf2、核呼吸因子1（NRF1）、线粒体转录因子A（TFAM）mRNA和蛋白水平的变化;RT-PCR检测线粒体DNA（mtDNA）拷贝数。流式细胞仪检测线粒体膜电位（MMP）;荧光素酶报告系统检测细胞ATP含量。采用两样本t检验进行统计学分析。 结果 Nrf2过表达质粒转染PIG3V细胞后24 h,Nrf2 mRNA、NRF1 mRNA水平较对照组明显升高,差异有统计学意义（均P < 0.001）,而TFAM mRNA水平与对照组比较差异无统计学意义;48 h后Nrf2 mRNA、TFAM mRNA水平较对照组升高,差异均有统计学意义（P < 0.05）,而NRF1 mRNA水平与对照组差异无统计学意义。Western印迹法显示,转染后24 h,过表达组Nrf2、NRF1、TFAM蛋白表达与对照组比较差异均无统计学意义,48 h后过表达组Nrf2、NRF1、TFAM蛋白表达升高（P < 0.05）。过表达组MMP在转染24 h后较对照组升高2.313%（t = 5.546,P = 0.005）,48 h后升高14.872%（t = 8.537,P = 0.001）。线粒体合成指标相对mtDNA拷贝数,在转染24 h后两组间差异无统计学意义（P > 0.05）,48 h后过表达组明显高于对照组（t = 5.760,P = 0.005）;细胞ATP含量在转染后24 h两组间差异无统计学意义（P > 0.05）,48 h后过表达组ATP含量较对照组明显升高（t = 22.040,P = 0.008）。 结论 过表达Nrf2可以促进黑素细胞线粒体生物合成相关基因和蛋白的表达,进而促进线粒体生物合成,上调线粒体功能相关的指标。     

Rap1b在子宫内膜癌组织中的表达及介导自噬调控人子宫内膜癌细胞化疗敏感性的研究

目的检测子宫内膜癌(EC)组织中Ras相关蛋白1b(Rap1b)表达,观察其对EC细胞Ishikawa化疗敏感性的影响及机制。方法选取2016年9月至2019年1月江门市中心医院诊治的60例EC患者作为研究对象。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测EC组织与癌旁组织中Rap1b mRNA表达,免疫组化染色检测组织中Rap1b与自噬相关蛋白Beclin1、LC3表达。建立Ishikawa/DDP耐药细胞株,脂质体介导细胞转染法构建Rap1b低表达的Ishikawa/DDP细胞,以转染NC-siRNA的Ishikawa/DDP细胞作为阴性转染组,未转染的Ishikawa/DDP细胞作为对照组;qRT-PCR和Western blot检测细胞中Rap1b的表达;CCK-8实验检测DDP处理后细胞存活率,并计算IC50值;流式细胞术检测细胞凋亡;免疫荧光染色检测LC3表达;Western blot检测自噬相关蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1及P62蛋白表达。结果与癌旁组织比较,EC组织中Rap1b mRNA与蛋白表达均升高,Beclin1、LC3表达也升高(P0.05);与对照组和NC-siRNA组相比,Rap1b-siRNA组细胞中Rap1b mRNA和蛋白相对表达量均下降,25、50、100μmol/L DDP处理后细胞存活率下降,IC50值降低,细胞凋亡率升高,LC3荧光染色强度减弱,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率下降,Beclin1蛋白表达水平下降而P62蛋白表达水平升高(P0.05)。结论 Rap1b在EC组织中表达水平较高,降低Rap1b表达可提高Ishikawa细胞的化疗敏感性,其机制可能与抑制自噬相关。     

全反式维A酸对恶性黑素瘤A375细胞上皮-间质转化相关分子表达的影响

【摘要】 目的 研究全反式维A酸（ATRA）对人恶性黑素瘤A375细胞中上皮-间质转化（EMT）相关分子表达的影响。方法 用含10 μmol/L ATRA的DMEM培养基和DMEM培养基分别处理A375细胞24和48 h作为ATRA-1组和ATRA-2组、对照1组和对照2组,采用实时定量PCR法检测EMT相关基因上皮钙黏着蛋白、神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白mRNA的表达。Western印迹法检测ATRA-1组、ATRA-2组、对照1组中上述蛋白的相对表达量,直接免疫荧光法检测上皮钙黏着蛋白和波形蛋白的荧光强度。统计分析采用两因素方差分析、单因素方差分析及LSD-t检验。结果 ATRA-1组和ATRA-2组分别与对照1组和对照2组相比,上皮钙黏着蛋白mRNA的表达均显著增加（F = 13.148、31.529,P < 0.05）,而神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白mRNA的表达均显著降低（均P < 0.05）;ATRA-2组上皮钙黏着蛋白mRNA的表达显著高于ATRA-1组（F = 13.148,P < 0.05）,而其他3种蛋白mRNA的表达显著低于ATRA-1组（均P < 0.05）;对照1组与对照2组上述蛋白的mRNA表达差异无统计学意义（均P > 0.05）。Western印迹法显示,与对照1组相比,ATRA-1组和ATRA-2组上皮钙黏着蛋白表达上调,而神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达均下调（均P < 0.05）;与ATRA-1组相比,ATRA-2组上皮钙黏着蛋白表达上调（P < 0.05）,神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达下调（均P < 0.05）。直接免疫荧光显示,ATRA-1组、ATRA-2组上皮钙黏着蛋白的荧光强度（6.23 ± 0.08、10.37 ± 0.13）显著高于对照1组（2.37 ± 0.14,均P < 0.05）,而波形蛋白的荧光强度（15.17 ± 0.18、10.29 ± 0.03）显著低于对照1组（50.16 ± 0.26,均P < 0.05）,抑制上皮向间质转化。结论 ATRA可上调A375细胞中上皮钙黏着蛋白的表达,降低神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白的表达,可能抑制A375细胞发生EMT现象。     

GDF11调控NLRP3-焦亡途径抑制宫颈癌增殖和转移的作用机制研究

目的探讨生长分化因子11(GDF11)对宫颈癌细胞增殖、转移的影响及其作用机制分析。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测人正常宫颈上皮细胞End1/E6E7和宫颈癌细胞系HeLa、C33A、SiHa、Caski中GDF11、NOD样受体家族蛋白3(NLRP3)表达情况,构建GDF11过表达慢病毒载体、NLRP3过表达慢病毒载体,转染/共转染HeLa细胞系,分别记为oe-GDF11组和oe-GDF11/oe-NLRP3组,同时设置Control组和vector组。采用qRT-PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测HeLa细胞中白介素(IL)-1β、IL-18 mRNA水平和含量,采用CCK8法、克隆形成试验、划痕试验、Transwell试验分别检测HeLa细胞活性、增殖、迁移、侵袭情况,WB法检测基质金属蛋白酶(MMPs)和上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达水平。结果HeLa、C33A、SiHa、Caski细胞中GDF11 mRNA水平均低于End1/E6E7细胞(P<0.05),而NLRP3 mRNA水平均高于End1/E6E7细胞(P<0.05)。oe-GDF11组NLRP3 mRNA水平(0.41±0.05)低于Control组(1.03±0.05)(P<0.05)。e-GDF11组细胞IL-1β、IL-18 mRNA水平和含量、细胞活力、克隆形成率、划痕闭合率、单个视野细胞侵袭数,以及MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimentin蛋白表达均低于Control组(P<0.05),E-cadherin蛋白表达高于Control组(P<0.05)。oe-GDF11/oe-NLRP3组细胞IL-1β、IL-18 mRNA水平和含量、细胞活力、克隆形成率、划痕闭合率、单个视野细胞侵袭数,以及MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimentin蛋白表达均高于oe-GDF11组(P<0.05),E-cadherin蛋白表达低于oe-GDF11组(P<0.05)。结论GDF11过表达可抑制宫颈癌细胞增殖和转移,可能与抑制NLRP3-焦亡途径有关。     

低氧对恶性黑素瘤A375细胞中Nodal及细胞迁移相关蛋白表达的影响

目的：明确低氧对恶性黑素瘤A375细胞中Nodal及细胞迁移相关蛋白表达的影响。方法：体外培养A375细胞，CoCl₂构建细胞内低氧模型。细胞分为空白对照组，CoCl₂组，SB-431542（Nodal抑制剂）组和CoCl₂ +SB-431542组。通过Western Blot技术检测Nodal、类激活素激酶4/7（ALK4/7）、与恶性肿瘤进展相关的上皮钙黏附蛋白（E-cadherin）、基质金属蛋白酶-2（MMP 2)和波形蛋白(Vimentin)的表达水平。结果：CoCl₂组细胞内Nodal及ALK7蛋白浓度，高于其他组（P<0.05）。各处理组均没有检测到ALK4蛋白；CoCl₂组细胞中Vimentin和MMP2蛋白的浓度高于其他组（P<0.05）；各处理组E-cadherin蛋白水平差异不具统计学意义。结论：低氧环境可诱导A375细胞中Nodal和细胞迁移相关蛋白MMP2和Vimentin的高表达。     

抑癌基因DKK3过表达抑制人皮肤黑素瘤细胞迁移和侵袭的机制探讨

目的 探讨DKK3 在人皮肤恶性黑素瘤细胞及组织中的表达及转染DKK3对人黑素瘤细胞A375迁移与侵袭的影响。方法 通过Western印迹法分析DKK3在人黑素瘤细胞系（HM、A375、WM451、SK?MEL?1、Hs?695T、MDA?MB?435s、WM35）及色素痣细胞中的表达,实时荧光定量PCR检测2014 年8月至2017年6月在重庆市中医院皮肤科收集的58例恶性黑素瘤（包括原发性黑素瘤与转移性黑素瘤）和30例色素痣组织中DKK3 mRNA的相对表达水平。分别转染pcDNA3.1（+）?Flag?Vector质粒（对照组）和pcDNA3.1（+）?Flag?DKK3 质粒（转染组）至恶性黑素瘤 A375 细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western印迹法验证 DKK3 的过表达,及DKK3过表达对黑素瘤细胞迁移和侵袭相关的分子表达水平的影响;通过细胞平板划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验分析DKK3对A375细胞迁移及侵袭的影响。采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,两独立样本间的比较采用t检验;多组数据的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD?t检验。结果 DKK3蛋白在人黑素瘤细胞系中表达缺失或低表达,在色素痣组织中高表达。原发性黑素瘤、转移性黑素瘤与色素痣中DKK3 mRNA表达水平（2?ΔΔCt）分别为（0. 325 ± 0.150） × 10?3、（0. 142 ± 0.210） × 10?3、（0. 634 ± 0.120） × 10?3,差异有统计学意义（F = 46.57,P < 0.05）,转移性黑素瘤表达水平低于原发性黑素瘤和色素痣 （LSD?t分别为2.48、3.12,均P < 0.05）。A375 细胞转染DKK3后,细胞划痕迁移率（22.11% ± 5.11%）低于对照组（54.36% ± 23.22%）（t = 2.36,P < 0.001）;迁移及侵袭实验中,转染组穿出小室细胞数（265 ± 33、76 ± 18）低于对照组（429 ± 41、135 ± 21）,差异有统计学意义（t值分别为1.24、1.35,均P < 0.001）。转染组A375细胞过表达DKK3后,上皮钙黏着蛋白和mRNA表达上升,神经钙黏着蛋白、波形蛋白、基质金属蛋白酶2（MMP2）、MMP7、MMP11蛋白和mRNA的表达下降。结论 DKK3在黑素瘤细胞系和组织中表达下调,DKK3过表达后A375 细胞的迁移和侵袭受到明显抑制,DKK3可能是抑制皮肤恶性黑素瘤转移的靶点。     

依巴斯汀通过抑制AKT/mTOR通路诱导人黑素瘤细胞自噬

目的：研究依巴斯汀对人黑素瘤细胞自噬的影响及机制。方法：体外培养人黑素瘤细胞A375和M14,采用CCK-8增殖实验检测细胞活力,并计算IC50;利用mCherry-EGFP-LC3B双荧光指示系统检测自噬流;采用Western blot验证自噬相关蛋白LC3,Beclin1及信号通路蛋白的表达。结果：依巴斯汀可显著抑制人黑素瘤细胞的活力;依巴斯汀明显诱导人黑素瘤细胞中自噬小体和自噬溶酶体的产生;依巴斯汀显著上调人黑素瘤细胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值以及Beclin1的表达,同时抑制AKT/mTOR信号通路的活化,降低p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR。结论：依巴斯汀通过抑制AKT/mTOR通路诱导人黑素瘤细胞自噬的发生。     

丹参酮ⅡA体外促进黑素瘤A375细胞自噬及信号通路的实验研究

目的：探讨丹参酮ⅡA体外对黑素瘤细胞A375细胞自噬的影响及其信号通路研究。方法0.5、1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA作用黑素瘤A375细胞24、48、72 h后，噻唑蓝（MTT）比色法检测A375细胞的增殖活性。1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA作用黑素瘤A375细胞48 h，采用流式细胞仪检测细胞自噬小体的数量，Western印迹检测自噬相关蛋白Beclin?1和微管相关蛋白1轻链3（LC3）?Ⅱ蛋白及磷酸肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p70S6激酶1（p70S6K1）蛋白的表达水平。结果 MTT分析显示，0.5、1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA分别作用黑素瘤A375细胞24、48、72 h，均能抑制A375细胞的增殖能力，且抑制作用呈剂量和时间依赖性（F=2564.12、1235.25，均P<0.05）。流式细胞仪显示，1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA作用A375细胞48 h后，细胞内自噬小体比例分别为6.91%±0.35%、13.11%±0.73%、25.51%±0.83%，均明显高于对照组（0.41%±0.02%），各组间差异有统计学意义（均P<0.05）。Western印迹显示，1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA作用A375细胞48 h后，细胞自噬相关蛋白Beclin?1和LC3?Ⅱ表达水平随丹参酮ⅡA浓度增加而升高，各丹参酮ⅡA组间差异有统计学意义，且高于对照组（均P<0.05）。而PI3K?Akt?mTOR?p70S6K1信号通路中PI3K、p?Akt、p?mTOR和p?p70S6K1蛋白表达随丹参酮ⅡA浓度增加而下降，各丹参酮ⅡA组间差异有统计学意义，且低于对照组（均P<0.05）。结论丹参酮ⅡA可通过抑制P13K?Akt?mTOR?p70S6K1信号通路，促进黑素瘤细胞发生自噬。     

富氢液通过自噬途径下调中波紫外线诱导的HaCaT细胞炎症因子的表达

目的 探讨氢气是否能通过自噬途径调节中波紫外线（UVB）诱导的HaCaT细胞炎症因子的表达。 方法 将培养的HaCaT细胞分为空白对照组（不做任何处理）,氢气组（仅用富氢培养液培养）,1、10、50 mJ/cm2 UVB组,1、10、50 mJ/cm2 UVB + 氢气组,50 mJ/cm2 UVB + 3甲基腺嘌呤（3MA）组,50 mJ/cm2 UVB + 雷帕霉素组,50 mJ/cm2 UVB + 3MA + 氢气组,50 mJ/cm2 UVB + 雷帕霉素 + 氢气组。细胞经过不同处理培养12 h后,噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖,LDH试剂盒检测乳酸脱氢酶（LDH）,细胞提取蛋白检测自噬蛋白LC3和Beclin1的表达,上清液用ELISA检测炎症因子肿瘤坏死因子（TNF）α、白细胞介素（IL）-1β、HMGB1和IL-6的水平。 结果 与空白对照组相比,UVB诱导的HaCaT细胞LDH释放增多,细胞活力下降,自噬蛋白LC3和Beclin1表达增加,炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6释放增加（均P < 0.05）。与UVB组相比,氢气可减少LDH释放,提高细胞活力,自噬蛋白LC3和Beclin1表达进一步增加,炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6表达减少（均P < 0.05）。与50 mJ/cm2 UVB组相比,50 mJ/cm2 UVB + 3MA组炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6表达进一步增加（P < 0.05）,而50 mJ/cm2 UVB + 雷帕霉素组炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6表达减少（P < 0.05）。与50 mJ/cm2 UVB + 氢气组相比,50 mJ/cm2 UVB + 氢气 + 3MA组炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6表达增加（P < 0.05）。 结论 UVB照射可以诱发自噬蛋白表达增加 ;富氢液可以下调UVB诱导的HaCaT细胞炎症因子的表达,而这一过程是通过激活自噬途径实现的。     

长链非编码RNA 068在黑素瘤细胞迁移中的功能研究

目的:探索长链非编码RNA（lncRNA）068对黑素瘤细胞系A375迁移的影响及潜在机制。方法:2015年12月至2020年11月在南通大学附属医院皮肤科门诊收集经病理确诊的皮肤黑素瘤患者21例,采用定量PCR（qPCR）检测其黑素瘤组织与相邻癌旁组织中lncRNA 068的表达。通过慢病毒转染在A375细胞中过表达...     

卵巢滤泡激素在干扰素γ介导的黑素细胞凋亡以及趋化因子分泌中的作用研究

【摘要】 目的 研究卵巢滤泡激素（FLCN）在干扰素γ（IFN-γ）介导的黑素细胞凋亡及趋化因子分泌中发挥的作用。方法 从正常人包皮环切组织及白癜风移植患者正常部位的吸疱表皮分离正常原代黑素细胞及白癜风原代黑素细胞。采用Western印迹检测正常原代黑素细胞、白癜风原代黑素细胞及人原代黑素细胞系PIG1细胞中FLCN蛋白的表达。以10 ng/ml IFN-γ刺激48 h的PIG1细胞为诱导组,未经处理的PIG1细胞为对照组,采用qRT-PCR检测两组细胞FLCN及自噬相关微管相关蛋白1轻链3（LC3）Ⅱ、Beclin基因mRNA表达,Western印迹检测FLCN、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ水平及腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的磷酸化水平。进一步对采用10 ng/ml IFN-γ刺激的黑素细胞感染FLCN抑制病毒进行不同的处理,分为阴性对照组、FLCN抑制组、抑制FLCN及添加mTOR抑制剂的自噬增强组和抑制FLCN及添加AMPK抑制剂的自噬抑制组。采用流式细胞仪检测各组PIG1细胞凋亡,酶联免疫吸附实验检测各组细胞上清液中趋化因子CXCL10和CCL20的浓度。多组间计量资料比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD-t检验。结果 正常原代黑素细胞（0.850 ± 0.120）、白癜风原代黑素细胞（1.507 ± 0.170）和PIG1细胞（0.697 ± 0.130）FLCN蛋白的相对表达差异有统计学意义（F = 50.09,P < 0.001）,白癜风原代黑素细胞高于正常原代黑素细胞和PIG1细胞（t = 4.06、5.89,均P < 0.01）。诱导组FLCN mRNA及蛋白相对表达均高于对照组（均P < 0.01）,LC3Ⅱ、Beclin mRNA及蛋白相对表达均低于对照组（均P < 0.01）;诱导组PIG1细胞LC3Ⅱ/Ⅰ水平（0.72 ± 0.02）、AMPK磷酸化水平（0.714 ± 0.023）低于对照组（1.13 ± 0.02、1.176 ± 0.002,t = 7.34、6.67,均P < 0.01）,mTOR磷酸化水平（1.051 ± 0.023）高于对照组（0.451 ± 0.016,t = 3.81,P = 0.009）。对照组、诱导组及各处理组PIG1细胞凋亡率及CXCL10、CCL20浓度差异均有统计学意义（均P < 0.001）,诱导组高于对照组,FLCN抑制组低于阴性对照组,自噬增强组低于FLCN抑制组,自噬抑制组高于FLCN抑制组（均P < 0.05）。结论 白癜风黑素细胞中高表达FLCN,FLCN表达以及下游信号通路受IFN-γ调控,FLCN可通过调节自噬参与IFN-γ介导的黑素细胞凋亡和趋化因子分泌。     

皮肤黑素瘤中miRNA-34c的表达对促血管新生因子VEGF-A、VEGFR-1的影响

目的探讨皮肤黑素瘤中miRNA-34c的表达以及其对促血管新生因子VEGF-A和VEGFR-1的影响。方法 Northern blotting检测原代人黑素瘤细胞、黑素瘤细胞株A375和原代人表皮黑素细胞miRNA-34c表达。构建miRNA-34c基因过表达与基因敲低的黑素瘤细胞株A375细胞系即高表达miRNA-34c组和低表达miRNA-34c组,以空载体转染黑素瘤细胞株A375作为空载体对照组。CCK-8法检测各组细胞增殖活性。qRT-PCR和Western blotting分别检测各组VEGF-A、VEGFR-1 mRNA和蛋白表达。结果与原代人表皮黑素细胞相比,黑素瘤细胞株A375和原代人黑素瘤细胞中miRNA-34c的表达降低(P<0.05)。高表达miRNA-34c组、低表达miRNA-34c组和空载体对照组细胞增殖活性无明显差异(P>0.05)。高表达miRNA-34c组VEGF-A、VEGFR-1的mRNA和蛋白表达较空载体对照组降低(P<0.05)。低表达miRNA-34c组VEGF-A、VEGFR-1的mRNA和蛋白表达较空载体组升高(P<0.05)。结论 miRNA-34c在皮肤黑素瘤中呈现特异性下调,miRNA-34c可能通过对促血管新生因子VEGF-A、VEGFR-1的下调参与皮肤黑素瘤的发生与发展。