慢病毒介导shRNA沉默Nicastrin基因的人永生化角质形成细胞模型构建

目的 构建Nicastrin(NCT)基因的RNA干扰慢病毒表达载体,并在人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)上鉴定其沉默效率,构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型,为后续研究NCT基因下调对角质形成细胞的生物学行为影响奠定实验基础.方法 设计3个靶向NCT基因特异性短发卡RNA(shRNA)表达序列并连接到慢病毒表达质粒pGLV3/H 1/GFP+ Puro中,成功构建慢病毒重组表达质粒,并通过测序鉴定.将构建的重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞,产生慢病毒颗粒,并测其滴度.将HaCaT细胞分为空白组(未感染病毒)、阴性对照组(NC组,感染空载病毒LV3-shNC)和干扰组(感染NCT-shRNA1、2、3慢病毒).流式细胞仪检测慢病毒转染效率,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western印迹检测靶基因的沉默效率,筛选出沉默效果最佳的干扰序列.结果 测序表明,NCT-shRNA慢病毒重组表达质粒构建成功.重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生的慢病毒颗粒滴度为109 TU/ml.慢病毒感染HaCaT细胞后,流式细胞仪检测,慢病毒转染效率大于95％.qRT-PCR结果,与NC组相比,干扰组NCT mRNA表达量明显下降,其中NCT-shRNA1组NCT基因沉默效果最佳,干扰效率达到75％.Western印迹结果,与NC组相比,shRNA1组NCT蛋白表达抑制率为71.7％.结论 成功筛选出高效NCT-shRNA干扰序列,构建NCT-shRNA慢病毒重组表达载体,并构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型.     

阿维A治疗不全型毛囊闭锁四联征一例北大核心CSCD

患者男,19岁,以双腋窝、腹股沟、肛周皮疹1年余,加重3个月伴疼痛来我院就诊.患者1年余前无明显诱因肛周出现散在丘疹、硬结,皮疹逐渐扩展至腹股沟及双腋窝,自觉轻度疼痛.近3个月皮疹加重,双腋窝出现散在脓肿、窦道,部分破溃,自觉明显疼痛,遂于2013年3月16日来我院就诊,诊断为聚合性痤疮,门诊予异维A酸胶囊10 mg每日2次、罗红霉素胶囊150mg每日2次口服,2个月后双腋窝、腹股沟、肛周皮疹无明显好转.既往面部、躯干有寻常痤疮病史5年,此次在我院门诊治疗后,面部及躯干的寻常痤疮皮损改善,余无特殊.     

Notch信号通路在皮肤病的研究进展

Notch信号通路是一条进化上十分保守的信号转导系统.Notch受体与相邻细胞的配体相互作用转导细胞信号,从而影响细胞的增殖、分化和凋亡.较多文献表明,Notch信号通路在维持皮肤正常生理功能以及炎症性皮肤病、自身免疫性皮肤病、皮肤肿瘤、色素性皮肤病等多种皮肤病中发挥重要作用.尽管目前临床应用尚不成熟,Notch信号抑制剂和激活剂有希望为皮肤病的治疗提供新思路.     

系统应用糖皮质激素治疗白癜风

白癜风是一种常见的色素脱失性皮肤病,发病机制复杂且不完全清楚,治疗方式多样但疗效欠佳。研究表明,系统应用糖皮质激素通过其抗炎、免疫抑制等作用可以控制白癜风的进展、促进皮损复色,其治疗方法包括低剂量每日口服疗法、间歇疗法、冲击疗法,以及联合外用药、光疗、外科治疗等。系统应用糖皮质激素需根据白癜风类型、发展时期选择适宜的治疗方法,才能达到最佳疗效、减少不良反应。     

nicastrin基因沉默的斑马鱼模型构建及其色素异常机制的初步研究

【摘要】 目的 探讨nicastrin（nct）基因对斑马鱼黑素细胞生物学功能的影响。方法 利用吗啉代寡核苷酸（MO）技术针对斑马鱼nct基因mRNA设计nct-MO序列,同时设计对照MO序列（ctrl-MO）,并构建5′端为MO靶序列的增强绿色荧光蛋白（EGFP）mRNA,通过显微注射的方式将nct-MO或ctrl-MO与EGFP mRNA共注射入斑马鱼胚胎中,验证nct-MO的沉默效率,观察其表型变化。以野生型斑马鱼作为空白对照组,实时荧光定量PCR检测黑素合成notch信号通路相关基因mitfa、tyr、tyrp1a、tyrp1b、dct、pmela、notch1a、notch1b、hey1 mRNA表达水平的变化。多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 斑马鱼受精后8 h,ctrl-MO + EGFP mRNA组斑马鱼胚胎中均有绿色荧光表达,而nct-MO + EGFP mRNA组及空白对照组胚胎均未见绿色荧光。受精后48 h,nct-MO组幼鱼尾部色素沉着区面积占比（0.169 ± 0.083）低于ctrl-MO组（0.258 ± 0.042,t = 3.202,P = 0.005）,且nct-MO组色素分布紊乱。实时荧光定量PCR显示,nct-MO组、ctrl-MO组、空白对照组间pmela、tyrp1a、hey1 基因mRNA 相对表达量差异有统计学意义（均P < 0.05）,mitfa、tyr、tyrp1b、dct、notch1a、notch1b mRNA相对表达差异无统计学意义（均P > 0.05）;nct-MO组pmela、tyrp1a相对表达水平（0.708 ± 0.028、0.558 ± 0.136）低于ctrl-MO组（1.023 ± 0.142、1.016 ± 0.134,均P < 0.05）。结论 nct基因可能通过调控斑马鱼黑素合成影响黑素细胞生物学功能。     

化脓性汗腺炎的生物制剂治疗进展

化脓性汗腺炎是一种发生在腋窝、腹股沟、臀部、肛周等皮肤褶皱部位的慢性复发性炎症性皮肤病。该病好发于年轻女性,主要的临床表现为疼痛性炎性结节、脓肿、破溃以及窦道和瘢痕形成。该病病程长且反复发作,严重影响患者的生活质量。化脓性汗腺炎还可与其他代谢性疾病或心血管疾病并发,缩短患者的寿命。化脓性汗腺炎的确切发病机制目前仍不清楚,学术界认为包括遗传因素在内的多种因素起综合的致病作用。目前化脓性汗腺炎的治疗手段限于抗感染以及其他对症治疗措施,故而治疗效果有限。现主流观点认为异常激活的免疫系统,包括异常升高的TNF-α、IL-17、IL-12、IL-23等细胞因子,可能在其发病过程中发挥着重要作用。随着对化脓性汗腺炎病理生理过程的了解,以及对于并发其他炎症性疾病的患者进行生物治疗有效性的观察,对化脓性汗腺炎的生物治疗获得了广泛的关注。基于多项临床试验的结果,美国FDA批准了抗TNF-α单克隆抗体阿达木单抗作为治疗化脓性汗腺炎的唯一生物制剂。同时,以上述炎症细胞因子为靶标的其他生物制剂也在中重度化脓性汗腺炎的治疗中显示了良好的疗效和安全性。本文在简单介绍化脓性汗腺炎的基础上,主要对化脓性汗腺炎所涉及的免疫因子的靶向生物治疗进展作一综述。      

蒙古斑并发白癜风1例

<正>患儿男,2岁9个月。因腰骶部和臀部灰青色斑片2年余,臀部白斑1年余,于2017年1月16日来我院就诊。患儿出生时腰骶部及臀部即有片状灰青色斑片,随年龄增长无明显变化。1年余前无明显诱因左侧臀部出现指腹大白色斑片,面积逐渐扩大至手掌大,白斑上逐渐出现岛屿状肤色斑片,无痛痒等不适。患儿足月顺产,既     

中外白癜风诊疗指南及共识比较

本文从白癜风分型、分期、病情评估、药物治疗及非药物治疗等方面比较了欧洲、美国、日本、韩国、中国等地区和国家的白癜风诊疗指南或共识, 概要分析各指南及共识中推荐的白癜风疗法和强调理念的异同, 以帮助临床医生为白癜风患者提供合适的个体化治疗方案。     

CRISPR-Cas9诱导KRT5基因突变的HaCaT细胞对共培养人黑素细胞的影响研究

【摘要】 目的 探究敲减角质形成细胞KRT5基因对共培养黑素细胞黑素含量的影响,以解释屈侧网状色素沉着症（DDD）的色素增加性皮损形成的机制。方法 通过成簇的规律间隔的短回文重复序列-相关蛋白9（CRISPR-Cas9）技术获得KRT5基因杂合突变的HaCaT细胞,将转染非靶向单向导RNA：Cas9蛋白复合物的HaCaT细胞设为对照组,分别与人原代黑素细胞HEMn体外共培养。免疫荧光观察共培养细胞中细胞角蛋白及黑素小体表达;差异胰酶消化获得不同共培养组中黑素细胞,检测细胞内黑素含量。免疫组化检测1例KRT5突变DDD患者皮损和正常对照皮肤中黑素细胞特异性前黑素小体蛋白17（Pmel17）的表达改变。结果 Sanger测序显示,实验组HaCaT细胞KRT5基因第1外显子起始密码子发生杂合突变（c.1delA）,对照组HaCaT细胞KRT5基因未发生突变。Western印迹显示,实验组HaCaT细胞KRT5蛋白表达水平（0.60 ± 0.05）显著低于对照组（1.00 ± 0.00,t = 32.38,P = 0.001）。HEMn细胞与实验组HaCaT细胞共培养体系中Pmel17标记的黑素小体较与对照组共培养体系增多,且细胞内黑素含量增加52.5%,差异具有统计学意义（t = -3.48,P = 0.025）。KRT5突变DDD患者皮损组织中Pmel17表达量较正常对照皮肤增加。结论 本研究通过CRISPR-Cas9诱导KRT5基因突变的HaCaT细胞,与黑素细胞在体外建立共培养细胞模型,验证了其对共培养黑素细胞的影响,为进一步研究角质形成细胞与黑素细胞相互作用机制以及皮肤色素异常的发病机制提供了初级研究模型。     

早老蛋白增强子2基因沉默对HaCaT细胞增殖及γ分泌酶表达的影响

【摘要】 目的 构建早老蛋白增强子2（PSENEN）基因沉默的人永生化角质形成细胞（HaCaT）模型,探究PSENEN基因表达下调对HaCaT细胞增殖以及γ分泌酶表达的影响。方法 设计3组靶向PSENEN基因的shRNA序列,与线性化的LV3-pGLV-h1-GFP-puro载体构建慢病毒重组表达质粒,经酶切及测序鉴定后,进行慢病毒的包装、纯化和滴度测定。将HaCaT细胞分为5组进行转染：shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组分别加入含沉默PSENEN基因的shRNA1、shRNA2、shRNA3慢病毒原液,NC组加入含阴性对照shNC慢病毒原液,空白组不加病毒液。转染完成后,荧光显微镜下观察荧光表达,流式细胞仪检测转染效率。CCK8法测定HaCaT细胞增殖活性,实时荧光定量PCR（qPCR）、Western印迹法分别检测PSENEN、呆蛋白（NCT）、早老蛋白1（PS1）、前咽缺陷蛋白1a（APH1a）mRNA、蛋白的相对表达量。统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 倒置荧光显微镜下观察到shRNA1 ~ shRNA3组、NC组均有荧光表达,流式细胞仪示转染效率均达98%以上。qPCR、Western印迹法显示,与NC组（1.054 ± 0.272、1.076 ± 0.075）相比,shRNA1、shRNA2、shRNA3组PSENEN mRNA（0.187 ± 0.010、0.163 ± 0.022、0.174 ± 0.009）、蛋白（0.219 ± 0.097、0.208 ± 0.014、0.185 ± 0.062）表达均显著降低（均P < 0.001）。CCK8法显示,与NC组相比,shRNA1组细胞增殖活性在0、12、36、48 h均显著增高（均P < 0.05）,24和60 h差异无统计学意义（均P > 0.05）;shRNA2、shRNA3组在0、12、24、36、48、60 h细胞增殖水平均显著高于NC组（均P < 0.05）。shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组、NC组、空白组间NCT、PS1、APH1a基因mRNA表达差异无统计学意义（F值分别为8.168、4.644、1.981,均P > 0.05）,mNCT、imNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白相对表达差异有统计学意义（F值分别为39.268、5.929、27.842、20.663,均P ≤ 0.01）。与NC组相比,shRNA1、shRNA2、shRNA3组mNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白表达均显著降低（均P < 0.01）,imNCT蛋白表达变化无统计学意义（均P > 0.05）。结论 成功构建了PSENEN基因沉默的HaCaT细胞模型,PSENEN基因沉默会引起HaCaT细胞增殖活性增强,γ分泌酶其他亚基蛋白含量下降。