重组猪戊型肝炎病毒ORF2区主要抗原域的原核表达及鉴定

目的：在大肠杆菌中表达猪戊型肝炎病毒ORF2区主要结构蛋白,并对其进行血清学鉴定。方法：通过RT-PCR技术从一份猪粪中扩增并克隆戊型肝炎病毒主要的结构基因片段,将该片段插入pET-32a表达载体,在原核系统中融合表达蛋白,Western blot和间接ELISA方法分析该蛋白的抗原性。结果：SDS-PAGE分析结果表明,获得45kD的目的蛋白,该重组蛋白可以与HEV阳性血清反应,而不与阴性血清反应,表明该蛋白具有良好的抗原性。结论：本研究获得了猪戊型肝炎病毒重组抗原,可与HEV阳性血清产生特异性的结合反应,可以作为诊断用的重组蛋白,为研制敏感、特异的HEV诊断试剂盒,行之有效的HEV基因工程疫苗及为HEV感染的预防和临床治疗提供资料。     

重组杆状病毒表达HEV ORF2抗原片段

目的：用重组杆状病毒表达戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV)ORF2基因片段,并对其免疫学特性进行研究。方法：与中间转染载体pVL1393相连构建重组质粒,在Lipofectin介导下将其与杆状病毒线性DNA（BaculoGold^TM)共转染Sf9昆虫细胞得到重组病毒,用免疫荧光,Western blot等方法对表达产物进行免疫学特性初步研究,并进行动物免疫试验。结果：含ORF2结构基因片段的重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中获得了高效表达,经免疫荧光,Western blot,动物免疫试验证实该重组蛋白为HEV特异性蛋白,可刺激机体产生相应抗体。结论：重组杆状病毒能有效表达HEV抗原基因,所表达的ORF2重组蛋白具有HEV抗体识别的抗原表位,具有较好的抗原性和免疫原性。     

诊断用丁肝抗原的基因优化及其蛋白表达、纯化和鉴定

目的 获取有生物活性的丁肝抗原蛋白,探讨其作为诊断试剂的应用价值.方法 经密码子优化,合成人工编码的丁肝抗原基因序列;以M48作为表达载体,构建带有硫氧还蛋白的重组表达质粒;在大肠埃希氏菌中经IPTG诱导表达;以亲和层析纯化并以ELISA鉴定该蛋白.结果 酶切鉴定构建的质粒正确;SDS-PAGE结果显示表达和纯化的外源蛋白与预期相对分子质量大小一致;ELISA鉴定该蛋白有与丁肝抗体特异性结合的活性.结论 成功获得有生物活性的可供诊断用的丁肝抗原蛋白,为丁肝诊断试剂的研发奠定了基础.     

戊型肝炎病毒ORF2 C端抗原片段的表达及其免疫学特性研究

目的　表达戊型肝炎病毒 (hepatitisEvirus ,HEV)ORF2C端 12 8个氨基酸残基的抗原片段ORF2 3 ,并进行其免疫学特性的研究。方法　用pBV2 2 0载体进行抗原的非融合表达 ,包涵体经变性凝胶过滤层析及离子交换层析纯化后透析复性 ,以Westernblot、ELISA、动物免疫与抗原捕获RT nPCR等方法研究其免疫学特性。结果　获得了ORF2 3的高效表达 ,表达量占菌体总蛋白 5 0 %左右 ,纯化后纯度达 98%以上 ,Westernblot表明表达抗原可与戊肝患者阳性血清特异性结合 ;在HEV感染恒河猴实验中用于IgG抗体的检测 ,具有较好灵敏度与特异性 ;用其免疫豚鼠 ,抗体经ELISA法测定效价为 1∶80 0 0 ;用制备的豚鼠抗血清捕获戊型肝炎病毒颗粒 ,经RT nPCR扩增出特异性片段。结论　ORF2 3抗原片段具有HEV抗体识别的抗原表位 ,能够刺激机体产生抗体 ,抗血清具有一定的识别与结合戊型肝炎病毒颗粒的能力     

趋化因子MIP-3α的克隆与表达

目的 克隆人趋化因子MIP-3α基因，表达并初步纯化MIP-3α融合蛋白。方法从扁桃体中提取总RNA，再进行RT-PCR，扩增MIP-3a成熟蛋白基因，并在5’和3’分别添加NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点，通过这两个酶切位点重组于pET32a( )载体上，转化E．coli．DH5α，筛选阳性克隆，酶切鉴定，DNA测序检测插入序列的正确性，缺失突变获得MIP-3α天然蛋白表达载体pET32a( )／MIP-3α，SDS-PAGE分析其表达，Westernblot验证融合蛋白。大量表达并初步纯化MIP-3α融合蛋白。结果 成功克隆了MIP-3α基因，表达并初步纯化得到MIP-3α融合蛋白。结论构建的MIP-3α硫氧还蛋白融合表达载体以可溶性蛋白的方式表达MIP-3α硫氧还蛋白。     

酵母表达的重组戊型肝炎病毒结构区ORF2蛋白的抗原性鉴定

目的 对应用巴氏毕赤酵母表达系统制备的重组戊型肝炎病毒(HEV)结构区ORF2蛋白的抗原性进行鉴定。方法 以原核细胞表达的重组HEV ORF2抗原作为对照，应用间接ELISA方法鉴定重组HEV ORF2蛋白在HEV IgM和IgG抗体检测中的特异性和敏感性；并测定不同保存时间对抗原稳定性的影响。同时，比较了两种重组抗原与国外5株HEV ORF2单克隆抗体的反应特性。结果 应用酵母抗原可检测到HEV抗体的最低包被量为12．5ng／ml，可检测到HEV IgM、IgG抗体的血清最大稀释度皆为l：51200重组蛋白与其他类型肝炎患者血清无交叉反应，37℃加速试验证实重组蛋白4℃保存12个月可保持良好的抗原性。各株单克隆抗体与酵母表达的HEV ORF2蛋白有更好的反应性，其中4B2、2E2与酵母表达的HEV ORF2蛋白的反应性比与原核表达抗原的反应性分别高出125倍和25倍。结论 应用巴氏毕赤酵母表达系统制备的重组HEV ORF2蛋白可能包含了更为广泛的构象依赖性抗原表位，具有良好抗原性、特异性和稳定性。提示其可作为开发戊型肝炎诊断试剂的一个独具优势的候选抗原。     

PC12细胞硫氧还蛋白cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

硫氧还蛋白（Thioredoxin,TRX)是广泛存在于原核和真核细胞中的低分子量蛋白质，它含有保守的Cys-Gly-Pro-Cys活性位点，作为多效性细胞因子而具有重要的生物学功能，从PC12细胞中提取总RNA，经逆转录PCR（RT-PCR)扩增出硫氧还蛋白cDNA并克隆到PUC18质粒上，序列分析表明，克隆所得序列与GenBank中大鼠硫氧还蛋白cDNA序列完全一致。将该基因亚克隆到表达质粒pQE30上，质粒pQE30-TRX在大鼠杆菌M15中获得高效表达，带6His的融合蛋白约占总菌体蛋白的30％。分析鉴定表明，纯化的融合蛋白质分子量是14kD，且具有二硫键还原酶活性。     

猪链球菌2型四川人源分离株ZYH24细胞外蛋白因子的原核表达及活性分析

目的：克隆、表达猪链球菌2型四川人源分离株ZYH24细胞外蛋白因子基因片段，分析蛋白活性。方法：根据GenBank S.suis 2 epf基因序列设计引物，克隆ZYH24株epf基因片段并进行序列分析；构建原核表达质粒pGEX4T-2-epf，在大肠杆菌中诱导带有谷胱苷肽转移酶（GST）标签的融合蛋白EF-GST的表达；亲和层析法纯化融合蛋白EF-GST，用凝血酶切除重组蛋白中的GST，获得纯化的EF抗原；SDS-PAGE和Western blot分析诱导表达及纯化的重组蛋白。结果：序列分析表明，获得的epf基因片段长895bp；原核表达的融合蛋白EF-GST分子量约62000，凝血酶处理后的EF抗原分子量约35000，两者均可与制备的EF多克隆抗血清发生特异性反应。结论：成功克隆了人源分离株ZYH24 epf基因片段，在原核系统实现高效的功能性表达，为开展EF蛋白的相关研究奠定了基础。     

戊型肝炎病毒Ⅳ型的ORF3及ORF2蛋白的分片段表达、纯化及抗原性分析

目的：对戊型肝炎病毒（HEV）Ⅳ型ORF3的全长基因片段和4个覆盖全长ORF2的互相重叠的基因片段进行了表达，对表达产物进行了纯化及抗原性分析。方法：将O3、FB5、E4、F2－2和E5基因片段分别连接到融合性表达质粒pThioHis，用IPTG进行诱导表达，并用反向、分子筛、离子交换和亲和层析方法进行纯化，用纯化的蛋白分别制备检测抗HEV IgG的诊断试剂，用该试剂检测急性散发性的戊肝病人和非戊肝病人血清。结果：位于ORF2－N端的FB5蛋白在急性期的戊肝病人血清中具有最强的反应性；而且仍有部分被HEV I型或／和Ⅱ型的诊断试剂排除的急性非戊肝病人血清对HEV Ⅳ型的多肽吴阳性反应。结论：为早期诊断戊肝病毒的感染，其诊断试剂应含有HEVⅣ型的ORF2N－端的蛋白片段。     

幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位融合蛋白表达的研究

目的：获得大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）与幽门螺杆菌保护性抗原热休克蛋白A亚单位（HspA）的融合蛋白。方法：PCR扩增ltB和hspA基因，依次构建至表达载体pIM-1，转化大肠杆菌，SDS-PAGE、免疫印迹分析目的蛋白表达情况。采用GM1ELISA和D( )-半乳糖亲和层析方法检测重组LTB-HspA融合蛋白LTB组分与GM1神经节苷脂结合活性。结果：重组LTB-HspA融合蛋白表达量最高可达细菌总蛋白的25％。免疫印迹检测结果证实为重组LTB-HspA融合蛋白。GM1ELISA和D( )-半乳糖亲和层析方法检测结果证实重组LTB-HspA融合蛋白具有与GM1神经节苷脂结合的活性。结论：LTB-HspA融合蛋白的表达研究，为研制幽门螺杆菌分子内佐剂疫苗打下了基础。     

单纯疱疹病毒I和Ⅱ型共同抗原gD在大肠埃希菌中的重组表达

目的 克隆人单纯疱疹病毒I、Ⅱ（HSV－I、Ⅱ）型共同性抗原gD基因，构建重组表达载体pMAL-c2/gD,诱导融合蛋白MBP－gD的表达。方法 提取病毒DNA，PCR扩增出gD基因，克隆于原核表达载体pMAL-c2并转化大肠埃希菌DH5α。PCR、双酶切及测序证实插入的gD基因序列正确后，IPTG诱导表达融合蛋白MBP－gD，并进行免疫学鉴定。结果 构建的重组表达质粒pMAL-c2/gD在大肠埃希菌中能高效表达。经SDS－PAGE分析，表达产物约占菌体总蛋白35．5％，其中39％以可溶蛋白形式存在于胞质中，61％以包涵体形式存在。结论 构建了pMAL-c^2/gD表达质粒，Western blot证实，HSV－I gD单克隆抗体DL6可特异识别表达的gD蛋白，该蛋白具有天然gD的抗原性。     

重组质粒pYTA/Aβ-HBcAg的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :研究 β 淀粉样肽 (Aβ)与HBcAg的融合基因Aβ HBcAg的原核表达 ,并检测表达的融合蛋白Aβ HBcAg的免疫原性。方法 :从重组质粒 7Z/Aβ HBcAg中 ,切下含Aβ HBcAg的基因片段 ,将其融合于质粒pYTA1的lac启动子之后 ,构建重组表达质粒pYTA/Aβ HBcAg。以此重组质粒转化大肠杆菌DH5α,在IPTG诱导下表达。超声破碎表达的细菌 ,通过SDS PAGE及考马斯亮蓝染色 ,检测融合蛋白Aβ HBcAg的表达。采用ELISA法检测融合蛋白的反应原性。融合蛋白经饱和硫酸铵盐析法分离和纯化后免疫BALB/c小鼠 ,用ELISA法检测血清中抗 Aβ抗体的滴度。 结果 :融合蛋白以可溶性形式存在于细菌裂解液的上清中 ,其表达量为菌体总蛋白量的 7%。表达的融合蛋白既有Aβ的反应原性 ,又有与HBcAg的反应原性。经 3次免疫后 ,BALB/c小鼠血清中抗 Aβ抗体的滴度最高可达为 1∶16 0 0 0。结论 :融合基因Aβ HBcAg可在大肠杆菌DH5α中表达。表达产物为可溶性蛋白 ,存在于细菌裂解液的上清中 ,具有较强的免疫原性。本研究为正在进行的AD基因工程疫苗的动物实验打下了基础     

人肝再生增强因子单克隆抗体的制备:以非纯化的大肠杆菌表达抗原筛选杂交瘤

目的 :利用杂交瘤技术、以非纯化的大肠杆菌表达重组蛋白作为筛选抗原 ,制备小鼠抗人肝再生增强因子(hALR)的单克隆抗体。方法 :用实验室纯化的重组hALR 硫氧环蛋白融合蛋白免疫BALB c小鼠 ;小鼠脾细胞与SP2 0骨髓瘤细胞融合后经HAT选择培养基筛选杂交瘤 ;以重组质粒pQE30 hALR与空质粒pQE30在大肠杆菌中诱导表达后的细菌裂解产物作为筛选抗原和对照抗原 ,用ELISA方法筛选能分泌抗hALR单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞克隆 ;进一步以ELISA方法和免疫印迹方法检测该杂交瘤细胞产生的抗体对真核细胞表达的重组hALR及人体血清中天然hALR的反应性。结果 :成功筛选出一株能稳定分泌抗hALR单克隆抗体的杂交瘤细胞 ;其产生的抗体能对真核细胞表达的重组hALR及人体血清中天然的hALR发生特异的抗原抗体反应。结论 :大肠杆菌表达的重组蛋白在以空质粒表达产物作为对照下 ,不经过任何纯化步骤也能够用于单克隆抗体制备中的杂交瘤筛选 ;hALR单克隆抗体为深入研究hALR提供了研究手段。     

抗戊型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建与筛选

目的 :构建人抗戊型肝炎病毒 (HEV)噬菌体抗体库 ,筛选人源中和性抗HEV的单克隆抗体 (mAb)。方法 :取抗HEV抗体阳性的 6例HE患者静脉血 ,分离淋巴细胞 ,提取细胞总RNA后逆转录。用一组人IgGFab基因特异性引物 ,分别扩增IgGκ0轻链与重链Fd段基因。将κ轻链与Fd段基因先后克隆入噬菌体载体pComb3的相应位点 ,经电穿孔法转化大肠杆菌XL1 Blue ,再以辅助噬菌体VCSM13超感染 ,构建人抗HEV噬菌体抗体库。采用独特的 5轮筛选法 (逐渐降低抗原包被量 ,严格洗脱条件 ) ,以固相化的 4种含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原 ,筛选人噬菌体抗体库 ,并以ELISA鉴定噬菌体抗体。结果 :经数次电转化构建了容量为1.9× 10 7重组率为 80 %的κ轻链基因库 ;容量为 1.8× 10 7重组率为 2 0 %的Fab基因库。以含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原特异淘筛 5次 ,出现特异富集。ELISA鉴定第 5轮筛选产物 ,得到 4株与HEVORF2重组混合抗原具有较高亲和力的Fab噬菌体抗体 ,可能为中和抗体。结论 :成功地构建了人抗HEV噬菌体抗体库 ,并获得人源抗HEV特异性噬菌体抗体。     

人β防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

目的:构建人β防御素4(human β defensin 4,HBD4)基因的原核融合表达载体PGEX-4T-2/mHBD4,诱导GST-HBD4融合蛋白在大肠杆菌中表达,并制备其多克隆抗体.方法:从重组克隆载体PMD18-T/HBD4中扩增HBD4成熟肽编码基因,并克隆入PGEX-4T-2中,在IPTG诱导下,表达GST-HBD4融合蛋白.以表达的融合蛋白GST-HBD4作为免疫原免疫家兔制备抗GST-HBD4的抗血清,抗体效价及特异性分别用ELISA和Western blot法鉴定.结果:在大肠杆菌中成功表达Mr约为32 000的融合蛋白GST-HBD4.ELISA法检测抗血清的效价可达到1:128 000,Western blot分析抗血清可与原核表达的融合蛋白GST-HBD4特异结合.结论:在大肠杆菌中成功表达了GST-HBD4融合蛋白,并制备了GST-HBD4的抗血清,为进一步研究HBD4蛋白的结构和功能奠定了基础.     

新型戊型肝炎病毒ORF2部分基因的构建表达及表达产物的抗原性分析

目的对新型戊型肝炎病毒ORF2的3′端部分基因进行重组质粒构建及融合表达,并对表达蛋白进行抗原性分析。方法用PCR方法从含有HEVORF2基因的pGEM-T载体上扩增表达片段,双酶切后与原核表达载体pThioHisA构建重组质粒pThioHisA-T11。诱导表达后进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。并用纯化的融合蛋白建立EIA检测方法,对40份抗-HEVIgG国家参比血清进行检测。结果含有pThioHisA-T11重组质粒的菌株表达相对分子质量为40×103的可溶性融合蛋白T11,免疫印迹证明融合蛋白T11能与抗HEVIgG发生特异反应。EIA检测结果显示,阳性参比血清符合率为80%(8/10),阴性参比血清符合率为87%(26/30),总符合率为85%。结论表达了新型HEVORF2羧基端278氨基酸并证明有抗原活性,为今后提高HEV检出率奠定了基础。     

表达HIV-1 gag-gp120嵌合基因酵母工程菌的构建及表达条件的优化

目的：构建表达HIV-1gag-gp120嵌合基因的酵母工程菌，并优化表达条件。方法：将gag-gp120嵌合基因插入到酵母表达载体pHILS1中，构建了表达质粒pHILGP。线性化质粒电转化毕赤酵母菌GS115后进行整合，通过PCR及表达产物的SDS-PAGE和ELISA等方法筛选 阳性酵母工程菌，并优化表达条件。结果：成功构建表达融合蛋白的酵母工程菌，表达量为13%左右。表达蛋白能与HIV-1阳性血清发生反应，但其相对分子质量（Mr）比预计计算的值要小。最佳表达条件为：BMMY培养基，85%溶解氧，培养时间3d，1%甲醇诱导浓度。结论：表达的融合蛋白具有很好的抗原特异性，存在于上清中，这有利于目的蛋白的分离纯化。     

鲑鱼降钙素基因在大肠杆菌中的可溶性高效表达

用PCR的方法从含有鲑鱼降钙素基因的质粒中扩增出目的基因,并将其插入硫氧还原蛋白融合表达质粒pTrxFus中,转入大肠杆菌GI724,以色氨酸诱导,使之与硫氧还原蛋白融合表达,融合蛋白可占菌体总蛋白的50％左右。用超声破碎菌体后,上清直接上CM－SepharoseFF柱进行分离纯化,得到融合蛋白的纯度达90％以上。动物体内活力分析表明,融合蛋白有明显的降低血钙的作用,此工作为重组鲑鱼降钙素的开发应用和功能研究打下了基础。     

重组人卵透明带蛋白3的制备及其免疫学活性分析

目的:纯化制备rhuZP3,并分析其免疫学活性.方法:在含重组质粒pGEX4T-1/ huZP3 的大肠杆菌 BL21中,经IPTG诱导表达出GST-融合蛋白,蛋白经过一系列的纯化,然后SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度.rhuZP3免疫小鼠,ELISA法检测抗血清对rhZP3的抗体反应.结果:表达出了可溶性融合蛋白,纯化后的rhuZP3纯度达95%.而且它在ELISA 鉴定实验中能被抗rhuZP3抗体识别.结论:通过原核表达系统制备的rhuZP3及其抗体具有免疫学活性.     

Parasite antigens expressed in Escherichia coli. A refined approach for epidemiological analysis

A simple method is described to generate carrier-free recombinant antigens following their expression in Escherichia coli. A plasmid, called pMSgt11, has been constructed such that the cleavage site for the protease factor Xa separates the recombinant antigen from an enzymatically active beta-galactosidase. Thus, rapid purification of the active beta-galactosidase recombinant protein, followed by digestion with factor Xa, releases the antigen of interest. The pMSgt11 plasmid is compatible with the phage expression vector, lambda gt11 and the feasibility of applying this system has been demonstrated using malarial recombinant antigens. Inserts from lambda gt11 recombinant Plasmodium falciparum clones have been recloned into the EcoRI site of pMSgt11 and the expressed soluble fusion proteins have been purified from crude extracts using a one step affinity chromatography. After protease digestion, the fusion protein cleavage products were analysed by immunoblot with a panel of different human immune sera. We were able to successfully demonstrate specific antibody titers to the parasite-derived carrier-free antigen, without interference from anti-Escherichia coli-specific antibodies. The general application of this approach to epidemiological analysis is discussed.