神经干细胞联合骨髓间充质干细胞移植对小鼠脊髓损伤的修复作用

目的:研究神经干细胞(NSCs)联合骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对小鼠脊髓损伤(SCI)的作用。方法:分别培养与鉴定绿色荧光蛋白(e GFP)转基因小鼠的NSCs与td Tomato红色荧光蛋白转基因小鼠的BMSCs;将两种细胞进行Transwell共培养,并用免疫荧光染色观察巢蛋白(nestin)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达,鉴定BMSCs的分化情况;将24只3月龄雌性小鼠随机分为3组:对照组(control)、移植组(BMSCs)和共培养BMSCs移植组(BMSCs+NSCs),利用撞击法制备小鼠SCI模型,并在损伤局部移植细胞和培养基,利用BMS评分在不同时间点评估小鼠脊髓功能恢复情况; Western Blot检测脊髓损伤部位的神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)的蛋白表达水平。结果:荧光倒置显微镜下可见分离培养的NSCs呈现绿色荧光,BMSCs呈现红色荧光,经细胞免疫荧光检测可见共培养后的BMSCs阳性表达神经干细胞和神经元特异性标记物,BMS评分结果显示细胞移植5 d后,移植组和共培养BMSCs移植组小鼠有差异,第7 d差异最明显,Western Blot结果显示共培养BMSCs移植组NGF和BDNF蛋白表达水平高于移植组和对照组。结论:小鼠NSCs与BMSCs在Transwell小室中共培养后,有利于BMSCs向神经方向分化,并有利于SCI小鼠运动功能的恢复。     

大鼠脊髓神经干细胞的鉴定及光镜和电镜观察

本研究应用无血清培养技术对分离的大鼠胚胎脊髓神经干细胞进行体外培养,在倒置显微镜和电镜下观察细胞形态,应用BrdU标记、免疫荧光染色检测细胞增殖、分化情况。免疫荧光显示nestin、MAP2、GFAP以及BrdU/nestin、BrdU/MAP2、Br-dU/GFAP均有阳性表达,说明从大鼠胚胎脊髓可成功分离出神经干细胞,它们分化后可以表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原。脊髓神经干细胞具有自我更新能力,能分化为神经元和星型胶质细胞。     

脊髓神经管神经上皮干细胞的分离培养和诱导分化

目的：从胚胎大鼠脊髓神经管中分离神经上皮干细胞并诱导其向多巴胺能神经元方向分化。方法：利用无血清悬浮培养、单细胞克隆技术分离神经上皮干细胞；采用5－溴－2－脱氧尿苷（BrdU）标记新生细胞，免疫细胞化学单标或双标染色技术，检测神经上皮干细胞蛋白（nestin）和分化后特异性神经细胞抗原的表达；用纹状体组织提取液，诱导神经上皮干细胞向多巴胺能神经元方向分化。结果：从胚胎大鼠脊髓神经管 中分离的细胞可以连续传代，表达nestin，它们分化后可以表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原；与对照组3％相比，纹状体组织提取液可以诱导这些细胞中的12％分化成为多巴胺能神经元。结论：分离自脊髓神经管的细胞具有自我更新能力和多分化潜能（multipotent)，是增殖能力很强的神经干细胞；这些干细胞在一定的体外环境中能被诱导成为特定的神经元，提示其可以为神经移植提供材料。     

五花血藤水煎液通过抗炎作用促进脊髓损伤后小鼠运动功能恢复

目的 探讨五花血藤水煎液（Sargentodoxa cuneata,SCD）在小鼠脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后的抗炎作用及其对运动功能恢复的影响。方法 选取36只SPF级小鼠随机分成假手术组、脊髓损伤组和SCD组，利用BMS评分检测小鼠后肢运动功能恢复情况，免疫蛋白质印迹法检测各组小鼠脊髓白细胞介素（IL）-6、IL-12A、肿瘤坏死因子（TNF）-α和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）的表达，免疫荧光染色通过NeuN观察损伤处脊髓前角神经元变化，rAAV-retro逆行示踪观察各组小鼠胫骨前肌（tibialis anterior muscle,TA）相关脊髓运动神经元分布。结果 与脊髓损伤组相比，SCD组小鼠在损伤后7 d的BMS评分显著提高（P<0.05），损伤后14 d,IL-6、IL-12A和TNF-α表达明显降低（P<0.05）,BDNF的表达显著升高（P<0.05）；损伤处脊髓前角神经元数量显著增多（P<0.05）,TA相关运动神经元数量明显增多（P<...     

小鼠来源诱导多能干细胞定向分化为神经元的体外实验研究*

 目的： 探讨源于小鼠的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）体外定向分化为神经元的方法,为大量稳定地获得神经元及提供种子细胞治疗脊髓损伤奠定体外实验基础。方法: 源于小鼠的iPSCs在不同的诱导培养基中经悬浮、贴壁、再悬浮和再贴壁培养。免疫荧光检测iPSCs多能性标志物、神经干细胞及其分化细胞标志物的表达。RT-PCR检测神经元及胶质细胞基因表达并行神经元基因测序鉴定,流式细胞术检测iPSCs定向分化为神经干细胞及进一步分化为神经元的比例。结果: 源于小鼠的iPSCs表达干细胞多能性标志物Sox2、Oct4和SSEA1。悬浮培养可以形成类球形拟胚体;经诱导及机械分离后的细胞可形成神经球,神经球经诱导后可分化为神经元。免疫荧光显示iPSCs可诱导出表达nestin的神经球,贴壁培养的神经球可分化为分别表达微管相关蛋白2（MAP-2）、胶质细胞原纤维酸性蛋白（GFAP）及髓磷脂碱性蛋白(MBP)的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。RT-PCR及基因鉴定结果显示形成小鼠神经元;流式细胞术检测结果显示分化细胞中神经干细胞和神经元的比例分别为63.93%±1.47%和21.40%±1.70%。结论: 源于小鼠的诱导多能干细胞能够稳定地在体外定向分化为神经元,为脊髓损伤的治疗提供了一个可靠的细胞来源。     

体外诱导的皮肤源性神经干细胞在大鼠受损伤脊髓内的存活、分化和迁移

目的探讨经体外诱导的皮肤源性神经干细胞能否在大鼠脊髓半横断损伤处存活、迁移和分化.方法应用转染绿色荧光蛋白基因新生大鼠的皮肤在体外经分离细胞、培养、诱导增殖以及用免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞等过程,将诱导产生的皮肤源性神经干细胞移植入大鼠脊髓半横断损伤处,30 d和60 d后用免疫细胞化学染色法观察移植细胞的存活、迁移和分化.结果皮肤分离细胞在培养10 d时,呈悬浮生长的细胞已增殖成若干细胞球,并呈nestin免疫细胞化学阳性染色,表明是神经干细胞球.在体内可观察到脊髓损伤处有许多带有绿色荧光的移植皮肤源性神经干细胞,有些还迁移到较远的宿主脊髓组织内.存活的移植细胞有些呈现nestin阳性、MAP2阳性及GFAP阳性.结论经体外诱导的皮肤源性神经干细胞能够在受损伤的大鼠脊髓内存活、迁移并分化为神经元样细胞和星形胶质样细胞.     

巢蛋白在胚胎及新生大鼠脊髓的表达

目的　检测不同发育时期巢蛋白 (nestin)在脊髓神经干细胞的表达水平 ,探讨脊髓神经干细胞的发育规律 ,为分离、富集和增殖均质的神经干细胞以及后期的研究工作如神经干细胞定向分化及移植治疗等研究提供实验依据。方法　将Wistar大鼠按胎龄及日龄分组 ,剥离脊髓 ,制成单细胞悬液 ,经间接荧光法标记nestin抗原 ,用流式细胞仪检测和分析。结果　从E13到P7整个发育过程中都有nestin抗原的表达 ,呈升高趋势 ,其中P1期表达水平最高。出生后表达下降 ,趋近于 90d(同型对照 )表达水平。结论　巢蛋白在脊髓的表达出现于胚胎早期 ,表达水平随胎龄轻微波动 ,呈升高趋势 ,P1达到高峰 ,出生后表达下降 ,趋于成鼠的微量表达     

龟板对脊髓损伤大鼠神经干细胞的作用

为了观察龟板对大鼠脊髓损伤后 nestin表达和后肢功能恢复的影响 ,本实验于手术后 1d、7d、14 d、2 1d、2 8d分别对大鼠进行 Tarlov评分和斜板试验检查后肢功能 ,处死动物后应用免疫组织化学技术检测神经上皮干细胞蛋白的表达 ,用图像分析仪进行定量分析 ,观察了龟板对脊髓损伤后神经上皮干细胞蛋白的影响。结果表明 ,脊髓损伤后第 1d,在两组受损伤脊髓灰质中都可见到 nestin的表达 ;第 14 d时达到高峰 ,龟板组为 3 8.2 4± 6.83 ,损伤组为 2 2 .48± 7.83 (P<0 .0 5 )。龟板组可使损伤的脊髓中 nestin持续高表达至术后第 2 8d,而损伤组仅持续高表达至术后 2 1d。增加的 nestin阳性细胞数量与神经功能的改善平行。本研究结果提示 :龟板可减轻神经损伤症状和促进脊髓损伤后神经干细胞的增殖     

Sox2诱导小鼠胚胎成纤维细胞直接重编程为神经干细胞

目的:探讨Sox2诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)直接重编程为神经干细胞的方法,为诱导神经干细胞(induced neural stem cells,i NSCs)作为种子细胞治疗脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)奠定实验基础。方法:逆转录病毒感染Sox2转录因子的MEFs在神经干细胞培养基中贴壁培养10 d。随后,悬浮、贴壁反复循环培养3次。Real-time PCR检测神经干细胞标志基因和多潜能标志基因的表达。i NSCs在分化培养基中贴壁培养7~14 d,免疫荧光分别检测神经干细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志物nestin、MAP2、GFAP和MBP的表达。将i NSCs显微注射至小鼠大脑皮质,7~14 d后免疫荧光检测神经细胞标志物nestin、MAP2、GFAP和MBP的表达。结果:Real-time PCR显示i NSCs的多种神经干细胞标志基因nestin、Blbp、Pax6和zbtb16表达较诱导前显著增高(P0.05),且i NSCs不表达多潜能相关基因Nanog、Oct4和zfp42。免疫荧光显示i NSCs高表达神经干细胞标志物nestin。免疫荧光同时表明i NSCs可在体内外存活并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:Sox2可以诱导MEFs直接重编程为神经干细胞。i NSCs具有自我更新的能力,且在体内外都具有三向分化潜能,可作为修复SCI合适的种子细胞。     

条件培养液对Wistar大鼠海马神经干细胞单细胞克隆增殖的影响

目的探讨神经干细胞(NSCs)条件培养液对其单细胞克隆增殖的影响。方法采用无血清培养法体外培养Wistar大鼠海马神经干细胞并进行传代培养,然后收集神经干细胞条件培养液。第四代细胞进行单细胞克隆,并将单细胞克隆细胞分为条件培养液组、无血清培养液对照组。通过MTT法比较两组细胞的增殖情况。单克隆培养细胞行巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色,诱导分化后细胞行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Galc)免疫细胞化学染色。结果单克隆培养后克隆球表达nestin,诱导分化后细胞表达NSE、GFAP、Galc,条件培养液组细胞增殖速度高于对照组。结论条件培养液能提高Wistar大鼠海马神经干细胞单细胞克隆的增殖速度。     

巨噬细胞促进神经干细胞向小鼠脊髓损伤区迁移

目的探讨巨噬细胞在神经干细胞(NSC)体内和体外迁移中的作用。方法体外分离、培养携带绿色荧光蛋白(GFP)小鼠的NSC,免疫荧光细胞化学染色检测神经上皮干细胞蛋白(nestin)表达;制作小鼠脊髓损伤模型,利用实时定量PCR检测组织巨噬细胞趋化蛋白1(MCP-1)mRNA水平,在损伤区两侧局部微量注射携带GFP的NSC,于1周后观察NSC向损伤区迁移情况;体外培养巨噬细胞,用TranswellTM迁移实验检测其对NSC迁移的影响,用ELISA检测MCP-1的含量。结果获得高表达nestin的NSC;与对照组相比,脊髓损伤组脊髓MCP-1 mRNA水平显著升高,注射入脊髓的NSC自注射区向损伤区迁移,并到达高表达F4/80区域。巨噬细胞可显著增加NSC体外迁移的数量,并分泌大量MCP-1。结论巨噬细胞诱导NSC向脊髓损伤区迁移,其可能机制是通过MCP-1起作用。     

巢蛋白在不同发育阶段人胚胎脊髓中的表达变化

目的:研究人胚胎脊髓生长发育过程中巢蛋白(nestin)的变化趋势。方法:采用免疫组织化学方法对不同发育时期(3周～8个月)的人胚胎脊髓中巢蛋白(nestin)的表达及变化进行了研究。结果:Nestin阳性细胞在神经上皮贯穿整个发育过程,5周基板、翼板形成后即可见到阳性物,而边缘层6周出现。中央管、基板、翼板、边缘层内nestin阳性细胞达高峰的时间分别是6周、7周、8周、9周,而表达明显减少的时间分别是8周、9周、10周、11周。随着脊髓的发育成熟,灰、白质内nestin阳性产物逐渐减少,而中央管的阳性细胞数至3月后较为稳定。结论:在脊髓不同部位神经干细胞出现时间和达到高峰的时间均不同,提示在脊髓的不同部位神经干细胞增殖、分化并不同步。     

神经干细胞移植修复大鼠脊髓半切伤的研究

目的：观察神经干细胞移植修复脊髓半切伤的疗效并探讨移植最佳时机。方法：制备大鼠T13-L1脊髓半切伤模型，取胎龄13、5d胎鼠大脑组织，体外分离、培养、诱导神经干细胞，并采用免疫细胞化学技术分别检测NSC（neural stemcell）特征性标志Nestin（巢蛋白）表达和用血清诱导分化为大量神经元NSE（neuron specific enolas）和神经胶质细胞GFAP（glial fibrillary acidic protein）表达。用明胶海绵吸附BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶）标记好的神经干细胞悬液移植到脊髓半横断处，移植时间选择损伤后立即移植、损伤后第9、14d。观察移植后的大鼠行为的变化，通过CBS（combine behavioral score）评分和爬网格实验评价大鼠的运动功能恢复情况，并进行免疫组化鉴定，光学显微镜观察移植神经干细胞的存活和迁移。结果：在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖，形成悬浮生长的呈Nestin阳性的神经球；用血清诱导分化为大量表达NSE阳性的神经元和GFAP阳性的神经胶质细胞。与对照组相比，神经干细胞移植组明显修复了损伤结构，改善了下肢的功能，尤其是第9d移植组。结论：神经干细胞移植促进了脊髓损伤后神经结构和功能的恢复，是治疗脊髓半切伤一种有效方案，考虑综合因素移植干细胞的最佳时机应选损伤后9d左右。     

电刺激联合神经营养素3可促进脊髓损伤大鼠内源性神经干细胞的增殖和分化

文题释义： 神经营养素3：是神经生长因子基因家族的成员,可促进多种中枢和外周神经元的存活和分化,调节神经元突触活动,并对神经系统发育和成熟起重要作用。神经营养素3在损伤条件下对神经元具有保护作用,因而在治疗神经系统疾病和神经损伤中有临床应用前景。 内源性神经干细胞：正常机体中,神经干细胞一般处于静息状态,在特定的生理或病理刺激下被激活,其中侧脑室外侧壁的室下带和海马齿状回的颗粒下带是产生神经干细胞最为活跃的区域,神经系统损伤后,在多种细胞因子、调控基因的调节下发生增殖、迁移和分化等。 背景：由于外源性神经干细胞的获取有限,且容易产生免疫排斥以及伦理问题等严重制约其向临床转化,因此如何激活内源性神经干细胞并促进其生长增殖、分化,成为近期科研工作者究的热点。 目的：探讨电刺激联合神经营养素3对大鼠脊髓损伤后内源性神经干细胞增殖及向神经元分化的作用。 方法：将96只SD大鼠随机分为假手术组、脊髓损伤组、电刺激组、电刺激+神经营养素3组,每组24只。假手术组仅暴露脊髓,其他3组大鼠应用改良Allen法建立脊髓损伤模型,造模后给予相应措施进行干预。造模后7,14,21,28 d时,以BBB评分评价大鼠后肢运动功能,电生理学检查运动诱发电位潜伏期;造模后28 d取材,进行苏木精-伊红染色观察脊髓病理变化,免疫组化染色观察内源性神经干细胞的增殖和分化情况。实验方案经兰州大学第二医院医学伦理委员会批准。 结果与结论：①与假手术组相比,脊髓损伤组大鼠的BBB评分明显降低(P < 0.01),脊髓组织可见大量炎症细胞浸润,并存在多个空洞;与脊髓损伤组相比,电刺激组、电刺激+神经营养素3组大鼠后肢功能开始逐渐恢复,电刺激+神经营养素3组BBB评分明显高于电刺激组(P < 0.05),上述病理损伤变化明显改善;②脊髓损伤组7,14 d及电刺激组大鼠7 d时双后肢运动诱发电位潜伏期均未测出,电刺激组、电刺激+神经营养素3组21,28 d时运动诱发电位潜伏期较模型组缩短(P < 0.05),电刺激+神经营养素3组潜伏期缩短更显著    (P < 0.05);③BrdU和Nestin阳性细胞数、微管相关蛋白2的表达：电刺激+神经营养素3组>电刺激组>脊髓损伤组;胶质纤维酸性蛋白的表达：脊髓损伤组>电刺激组>电刺激+神经营养素3组。结果表明脊髓损伤大鼠经电刺激及神经营养素3干预后,促进内源性神经干细胞增殖和向神经元分化,病理损伤明显减轻,后肢运动功能显著改善。 ORCID: 0000-0002-6353-8874(张培根) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

S100A4促进脑源性神经营养因子表达影响神经干细胞的分化

文题释义：神经干细胞电穿孔：即通过高强度的电场作用,瞬时提高细胞膜的通透性,从而吸收周围介质中外源分子的方法进行转染,通过研究发现在230 V、350 μF条件进行电转染效率较高,可以在后续实验中采用。 神经干细胞成神经诱导分化：神经干细胞是一类多能干细胞,可以向神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞分化。脊髓损伤部位常常表现为瘢痕愈合,难以恢复脊髓的正常生理功能,通过提高神经干细胞向神经元分化的比例,尽可能减少其向胶质细胞分化,进而减少损伤部位瘢痕的形成,对于治疗脊髓损伤、恢复脊髓生理功能具有重要的临床意义。 背景：如何促进神经干细胞大量向神经元分化是研究的难点。研究发现,S100A4 蛋白可能通过多种途径在中枢神经系统修复中发挥作用。 目的：研究S100A4是否通过上调脑源性神经营养因子表达进而影响神经干细胞向神经元样细胞的分化。 方法：购买鉴定合格的小鼠胚胎大脑海马和室管膜下区来源的神经干细胞,体外培养传代,电穿孔法向神经干细胞中转染S100A4表达载体和/或脑源性神经营养因子siRNA,转染48 h后向神经元方向诱导分化,诱导分化3 d后采用Western blot检测细胞中脑源性神经营养因子及Tuj1蛋白表达,免疫荧光检测Tuj1阳性神经元比例。 结果与结论：①与转染无关序列质粒组比较,转染S100A4组神经干细胞中Tuj1阳性细胞比例及相应的Tuj1、脑源性神经营养因子的表达量显著增高(P < 0.01);②与S100A4+siRNA无关序列共转染组比较,S100A4+脑源性神经营养因子siRNA共转染组神经干细胞中Tuj1阳性细胞比例及相应的Tuj1、脑源性神经生长因子的表达量显著降低(P < 0.01);③结果表明,S100A4的过表达可促进神经干细胞向神经元样细胞分化,其可能通过脑源性神经营养因子发挥作用。 ORCID: 0000-0002-1131-3497(杜晓文) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

骨形成蛋白4对脊髓损伤后大鼠功能和神经干细胞的影响

目的　观察骨形成蛋白 4对脊髓损伤后大鼠功能和神经干细胞的影响。方法　应用改良Allen脊髓损伤模型 ,将成年SD大鼠 6 0只随机分为BMP 4组、脊髓损伤组。分别于术后 1d、7d、14d、2 1d、2 8d处死动物 ,并且对大鼠进行Tarlov评分和斜板试验检查后肢功能。应用免疫组织化学技术检测巢蛋白 (nestin)的表达 ,观察BMP4对脊髓损伤后nestin表达的影响。结果　第 2 1d时BMP4组大鼠功能改善明显与损伤组比较差异有显著性意义 (P <0 0 5 ) ;脊髓损伤后第 1天 ,在BMP4组和脊髓损伤组的室管膜、室管膜下区、损伤脊髓灰质中都可见到nestin的表达。于损伤后迅速增加 ,第 14天时达到高峰。BMP4组灰质nestin表达为 15 35± 3 83,脊髓损伤组灰质为 8 4 8± 3 5 3,两者差异有显著性 (P <0 0 1)。BMP4组可使损伤的脊髓中nestin持续高表达至术后第 2 8天 ,而脊髓损伤组仅持续表达至术后 2 1d。增加的nestin阳性细胞数与神经功能的改善平行。结论　提示BMP4可减轻神经损伤症状和对脊髓损伤后神经干细胞有促进增殖作用。     

过表达胶质细胞神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤

文题释义： 胶质细胞源性神经营养因子：作为轴突再生的一种重要神经营养因子,可诱导间充质干细胞向神经样细胞分化并对中枢神经系统退行性疾病、脊髓损伤后神经功能恢复起到重要作用。 突触素：作为突触的特异性蛋白是突触形成过程中最重要的标志物,主要位于神经元胞体及轴突,可调节神经元轴突延伸,参与突触囊泡的介导转运、神经递质释放,对促进脊髓损伤后神经功能恢复起到重要作用。 背景：胶质细胞神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)在诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外定向分化及促进脊髓损伤大鼠神经功能恢复过程中起到重要作用。 目的：观察过表达GDNF基因的BMSCs分化情况及其促进脊髓损伤大鼠神经功能恢复的潜在分子机制。 方法：①以重组目的基因腺病毒转染BMSCs并分为Ad-GDNF-GFP转染组、Ad-GFP转染组、未转染组,免疫荧光鉴定各组细胞神经元特异性烯醇化酶及微管相关蛋白2的表达,Western blot检测各组细胞GDNF、Wnt3a、Wnt7a蛋白表达。②以改良Allen法制备大鼠脊髓损伤模型,将造模成功的45只SD大鼠随机分为3组,分别以过表达GDNF基因BMSCs(GDNF-BMSCs)、BMSCs、PBS移植至脊髓损伤局部。移植后4周采用BBB评分法评估大鼠运动功能恢复情况,苏木精-伊红染色观察脊髓形态变化,免疫组化检测损伤局部神经元特异性烯醇化酶、突触素Ⅰ及胶质纤维酸性蛋白表达,Western blot检测损伤局部Bcl-2、肿瘤坏死因子α蛋白表达。 结果与结论：①Ad-GDNF-GFP转染组BMSCs可向神经元样细胞形态转变并表达神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2;Wnt3a、Wnt7a蛋白表达量显著高于Ad-GFP转染组、未转染组;②移植后4周,GDNF-BMSCs移植组大鼠BBB评分明显提高、脊髓空洞面积显著缩小。GDNF-BMSCs移植组脊髓损伤局部胶质纤维酸性蛋白、肿瘤坏死因子α表达量显著低于BMSCs移植组及PBS移植组,而神经元特异性烯醇化酶、突触素Ⅰ及Bcl-2表达量显著高于BMSCs移植组、PBS移植组;③结果表明,Wnt信号通路参与过表达GDNF基因 BMSCs向成熟神经元分化过程,移植后通过降低脊髓损伤局部炎症反应、减少细胞凋亡及胶质瘢痕形成、促进轴突再生,提高BMSCs移植治疗脊髓损伤的疗效。 ORCID: 0000-0001-6467-730X(黄成) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

NT-3基因修饰及维甲酸预诱导的骨髓间充质干细胞在脊髓损伤处分化为神经元样细胞的研究

目的 探讨移植在脊髓损伤处的神经营养素-3(NT-3)基因修饰及维甲酸(RA)预诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的潜能.方法 将MSCs、RA诱导的MSCs、LacZ基因修饰的MSCs、NT-3基因修饰的MSCs和NT-3基因修饰及RA预诱导的MSCs分别立即移植到脊髓全横断处(T10脊髓),术后67d取材和冷冻切片,用免疫荧光组织化学染色方法检测MSCs的分化潜能,计算各细胞移植组脊髓损伤处的MSCs分化为神经元样细胞的百分率.结果 移植的MSCs在受损伤的脊髓内可分化为神经干细胞(nestin阳性)、神经胶质样细胞(GFAP阳性)和神经元样细胞(NF和MAP2阳性),有些还可以向含有某种神经递质和有形成突触潜能的神经元样细胞分化(ChAT、5-HT和PSD95阳性).联合应用NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs能在受损伤的脊髓内更有效地提高MSCs向神经元样细胞分化的百分率.结论 NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs能在脊髓损伤处更好地分化为神经元样细胞.     

胶原/丝素蛋白支架联合神经干细胞治疗创伤性脊髓损伤北大核心

背景:随着交通事故、坠落伤、运动损伤等不断增多,创伤性脊髓损伤已成为危及脊髓健康的一个重要问题。目的:探讨胶原/丝素蛋白支架联合神经干细胞治疗创伤性脊髓损伤的疗效。方法:①分别提取胶原和丝素蛋白原料,将二者以质量比2∶4混合,采用真空冷冻干燥法制备胶原/丝素蛋白支架;将第3代GFP小鼠神经干细胞接种至胶原/丝素蛋白支架上,光学显微镜和扫描电镜下观察神经干细胞生长情况。②采用随机数字表达将40只成年SD大鼠分5组,正常组不进行任何处理,模型组建立T10段脊髓缺损模型,干细胞组脊髓缺损处注射神经干细胞,支架组脊髓缺损处植入胶原/丝素蛋白支架,联合组脊髓缺损处植入接种神经干细胞的胶原/丝素蛋白支架,每组8只。术后每周进行旷场实验BBB评分和斜坡实验,术后第8周行神经诱发电位检测、苏木精-伊红和免疫荧光染色,评价创伤性脊髓损伤大鼠恢复情况。结果与结论:①光学显微镜和扫描电镜下观察显示,胶原/丝素蛋白支架上有利于神经干细胞的黏附、伸展与分化。②旷场实验BBB评分和斜坡实验结果显示,脊髓损伤各组大鼠的运动功能随时间的延长均有不同程度的恢复,各治疗组大鼠的运动功能的恢复速度与程度均优于模型组,其中以联合组大鼠运动功能恢复最好。术后第8周,脊髓损伤后各治疗组大鼠的运动诱发电位和体感诱发电位的潜伏期、振幅检测结果均优于模型组(P<0.05),联合组检测结果优于干细胞组、支架组(P<0.05)。术后第8周苏木精-伊红染色显示,模型组大鼠脊髓损伤部位修复效果最差,联合组修复效果最好;免疫荧光染色显示,模型组大鼠脊髓损伤部位神经丝蛋白阳性细胞最少,各治疗组神经丝蛋白阳性细胞均多于模型组,其中以联合组最多。③胶原/丝素蛋白支架联合神经干细胞对创伤性脊髓损伤大鼠双下肢功能改善和脊髓组织修复具有一定效果。     

外胚层间充质源神经干细胞-纤维蛋白支架复合体移植修复大鼠脊髓损伤

目的:评价外胚层间充质来源的神经干细胞-纤维蛋白支架复合体移植治疗大鼠脊髓损伤的疗效。方法:于大鼠鼻呼吸黏膜组织获取外胚层间充质干细胞(EMSCs),并诱导为神经干细胞(NSCs)。制作大鼠脊髓横断模型,将EMSCs源性神经干细胞-纤维蛋白支架复合体移植入脊髓断端(作为NSCs-纤维蛋白支架移植组;N-F组),每周对大鼠行BBB评分,12周后对脊髓标本行免疫组织化学显色,并利用免疫印迹检测脊髓横断部位神经生长相关蛋白-43(GAP43)、神经丝蛋白-200(NF200)、突触蛋白(synapsin)的表达量,并与纤维蛋白支架移植组(Fg组)、单纯手术组(SCI组)进行比较。结果:鼻呼吸黏膜EMSCs源性神经干细胞高表达巢蛋白(nestin)、CD133,在纤维蛋白胶内生长良好,并可形成神经元样突起。从术后2周开始,N-F组BBB评分每周均高于Fg组和SCI组,差异有统计学意义。免疫印迹检测显示N-F组动物脊髓标本NF200、GAP43、synapsin相对表达量均高于Fg组和SCI组。脊髓组织切片免疫组织化学显示脊髓断端N-F组可见大量阳性神经纤维呈网络状结构,并伸入断端两侧脊髓实质;Fg组有较少量纤维通过;SCI组几乎没有阳性纤维通过。结论:纤维蛋白支架对鼻呼吸黏膜EMSCs源性NSCs的生长分化具有良好的促进作用。EMSCs源NSCs对脊髓损伤后的组织学重建和功能恢复均具有明显的促进作用。