组蛋白甲基化转移酶SETD4对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响

目的：明确组蛋白甲基化转移酶含SET结构域蛋白4 (SET-domain-containing protein 4, SETD4)在临床鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）组织中的表达，分析SETD4对NPC细胞增殖和迁移的影响。方法：采用免疫组织化学法检测86例临床NPC标本与对照组30例鼻咽黏膜慢性炎症（nasopharyngeal chronic inflammation,NPI）组织中SETD4蛋白的表达；基于CRISPR/Cas9技术敲除CNE2细胞中SETD4基因，DNA测序结合半定量RTPCR进行鉴定；以SETD4敲除前后的CNE2细胞为研究对象，于倒置显微镜下观察细胞形态，采用CCK-8实验分析细胞增殖活性、Transwell实验观察细胞迁移能力变化、Western blot检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）、细胞周期相关蛋白、上皮-间充质转化标志物和组蛋白赖氨酸甲基化的变化，并通过生物信息学富集SETD4相关联的功能和信号通路。结果：SETD4蛋白主要定位于NPC细胞核...     

慢病毒介导的CCDC80基因敲除通过降低Aib1表达抑制卵巢癌细胞增殖

目的:探讨含卷曲螺旋结构域蛋白80(coiled-coil domain-conaining protein 80,CCDC80)基因敲除对人卵巢癌ES-2细胞增殖和凋亡的影响。方法:慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术敲除卵巢癌ES-2细胞中的CCDC80基因,基因组测序检测CCDC80的敲除效率;细胞增殖曲线、细胞划痕实验和软琼脂克隆形成实验检测CCDC80基因敲除对细胞增殖、迁移和克隆形成能力影响;Annexin V/PI染色和流式细胞术检测CCDC80基因敲除后细胞周期和凋亡的变化;Western blot法分析增殖相关蛋白表达量;裸鼠荷瘤模型体内实验研究CCDC80基因敲除对卵巢癌细胞增殖的影响。结果:DNA测序结果显示慢病毒介导的CRISPR/Cas9方法可以在卵巢癌ES-2细胞中敲除CCDC80基因。CCDC80基因敲除可以显著抑制细胞增殖、克隆形成和迁移能力(P0.01)。此外,CCDC80基因敲除可以减少G_1期细胞数目,增加S和G_2期细胞数,促进细胞凋亡(P0.01)。裸鼠体内研究显示,CCDC80基因敲除可以显著抑制ES-2细胞体内增殖(P0.01),免疫组化结果显示CCDC80基因敲除细胞形成的肿瘤组织DNA损伤蛋白p-H2AX表达增加,而增殖标志物BrdU表达量减少。Western blot结果显示CCDC80基因敲除细胞p-histone H3表达量减少,p-ERK1/2表达增加(P0.01)。qPCR结果显示CCDC80基因敲除细胞中Aib1 mRNA表达显著降低(P0.01)。结论:CCDC80基因敲除抑制了ES-2细胞增殖,促进细胞凋亡,其机制可能与影响Aib1蛋白表达及MAPK信号通路有关。     

利用CRISPR/CAS9技术构建QKI敲除GC1-spg细胞株及其生物学功能检测

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建QKI敲除的GC1-spg细胞株,并在体外研究QKI对GC1-spg细胞增殖和分化的影响。方法利用CRISPR/Cas9系统的PX330质粒构建敲除QKI的重组质粒,转染GC1-spg野生型细胞,加入嘌呤霉素进行筛选,通过蛋白质免疫印迹(Western blot)和基因测序鉴定出GC1-spg敲除QKI细胞株;常规培养野生型和敲除细胞株,利用细胞计数检测试剂盒(CCK8)绘制增殖曲线和荧光定量PCR(q-PCR)检测减数分裂相关基因变化。结果本研究成功构建出QKI敲除GC1-spg细胞株,与对照组相比,QKI敲除细胞株的增殖明显下降(P0.05),减数分裂相关分子标志基因c-kit、Mtl5和Hspa2表达量明显降低(P0.05)。结论 QKI蛋白可以影响GC1-spg的增殖和分化,因此QKI蛋白可能通过影响增殖和分化而影响精子发生。     

稳定敲除CACYBP/SIP基因的 MCF-7细胞株的构建及其细胞增殖的变化

目的利用CRISPR/Cas9系统构建CACYBP-/-乳腺癌MCF-7基因缺陷细胞株,并研究该基因敲除株对细胞增殖能力的影响。方法设计特异sgRNA序列,构建Lenti-CAS9-sgRNA-puro质粒,转染MCF-7细胞,puromycin抗性筛选,Cruiser检测sgRNA活性,极限稀释法筛选单克隆株,Western blot检测CACYBP/SIP蛋白的表达,Brdu和MTT试剂盒检测CACYBP/SIP缺失后细胞增殖能力。结果成功构建Lenti-CAS9-sgRNA-puro质粒,puromycin最佳筛选浓度为0. 9μg/m L,sgRNA1活性最高,获得的单克隆系测序唯一敲除CACYBP/SIP的MCF-7细胞株增殖能力减弱(P0. 05)。结论敲除CACYBP/SIP的MCF-7细胞株增殖能力减弱。     

核仁磷酸蛋白基因NPM1敲除人宫颈癌细胞株的构建及功能

目的通过CRISPR/Cas9系统定向敲除人类宫颈癌细胞(HELA)的核仁磷酸蛋白1基因(nucleophosmin1, NPM1),探讨敲除对HELA细胞生物学行为的影响。方法利用http://crispr.mit.edu sgRNA在线设计工具设计sgRNA,通过T7E1系统筛选合适的sgRNA,将设计好的质粒通过转染的方式转入HELA细胞株,通过博来霉素(zeocin)抗生素进行筛选,通过Western blot,PCR,基因测序等手段确认敲除细胞系的建立,通过免疫荧光的方式观察敲除细胞株。结果 T7E1酶切PCR退火产物之后琼脂糖凝胶结果表明,CRISPR/Cas9系统对HELA细胞基因组进行了切割,并在同源重组时发生了碱基错配;Western blot结果说明基因敲除后NPM1蛋白表达消失;基因测序的结果表明敲除细胞系建立的成功;免疫荧光的结果表明该细胞系出现异常核仁现象。结论 NPM1敲除后细胞核仁异常,可能影响细胞正常生命进程。     

miRNA-25对人食管鳞状细胞癌细胞株TE1增殖的影响

目的:探讨过表达/沉默微小RNA-25(microRNA-25,miRNA-25)对人食管鳞状细胞癌细胞株TE1增殖能力的影响及其作用机制。方法:RT-PCR检测各临床样品组织中miRNA-25的表达水平。建立miRNA-25过表达/沉默的TE1细胞株,采用CCK-8法、Brd U实验和流式细胞术检测TE1细胞增殖能力的变化及细胞周期状态;Western blot法和RT-PCR法检测细胞周期调控因子细胞周期蛋白E1(cyclin E1)和细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)的蛋白与mRNA表达水平。结果:miRNA-25在食管黏膜组织中具有特异性表达并在TE1细胞中呈高表达。CCK-8法和Brd U实验结果显示过表达miRNA-25的TE1细胞的增殖能力显著增加(P0.05),而沉默miRNA-25抑制TE1细胞的增殖;流式细胞术检测结果显示过表达miRNA-25可明显促进TE1细胞从G0/G1期向S期转换,沉默miRNA-25则抑制其转换。同时Western blot和RT-PCR实验结果显示过表达miRNA-25后,cyclin E1和CDK2的蛋白和mRNA表达水平均显著增加(P0.05),沉默miRNA-25后则显著减少(P0.05)。结论:miRNA-25能够促进人食管鳞状细胞癌细胞株TE1的增殖,其作用机制可能与促进细胞周期转换及上调cyclin E1和CDK2的表达水平有关,提示miRNA-25可作为治疗食管鳞状细胞癌的一个潜在靶点。     

受体酪氨酸激酶Axl高表达促进鼻咽癌临床进展

目的:探讨受体酪氨酸激酶anexelekto(Axl)在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)中的表达及意义。方法:采用免疫组化法检测78例NPC和32例鼻咽黏膜慢性炎中Axl的表达,分析Axl蛋白表达与NPC患者临床参数的相关性。常规培养NPC细胞,免疫荧光法检测不同分化NPC细胞系CNE1、CNE2Z及C666-1中Axl的蛋白表达情况。应用Axl特异性抑制剂TP-0903处理CNE1和C666-1细胞,CCK-8实验检测细胞的活力,流式细胞术检测细胞周期的分布,q PCR检测Axl和增殖细胞核抗原(PCNA)的mRNA表达,Western blot检测Axl及p-Axl蛋白的表达。结果:Axl蛋白定位于胞膜和胞质。NPC中Axl高表达阳性率显著高于鼻咽黏膜慢性炎(P0.01)。Axl高表达与患者年龄、性别及M分期无关,与临床分期、T分期和N分期呈正相关(P0.05)。Axl在高分化CNE1细胞中低表达,在低分化CNE2Z细胞和未分化C666-1细胞中表达水平明显增高。TP-0903呈浓度和时间依赖性抑制NPC细胞的活性,2 nmol/L TP-0903即具有显著抑制效应,能阻滞细胞周期于G0期,在降低Axl活性的同时也显著抑制PCNA的表达。结论:Axl高表达可促进NPC的临床进展;TP-0903显著抑制NPC细胞的增殖,提示Axl可能在NPC靶向治疗中具有一定的价值。     

cyclinD1过表达对子宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞增殖及上皮间质转化的影响北大核心CSCD

目的 探讨cyclin D1过表达对子宫颈鳞癌SiHa细胞增殖、分化的影响及其他信号分子的变化情况.方法 采用PCR法扩增cyclin D1基因全长,构建cyclin D1-pcDNA3.1质粒转染人乳头状瘤病毒16阳性的SiHa细胞,筛选cyclin D1稳定过表达细胞株.采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法和Western blot分别检测转染细胞cyclin D1 mRNA和蛋白表达.采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法绘制细胞生长曲线,采用RT-PCR法和Western blot检测转染细胞CK7、E-cadherin、波形蛋白、Snail基因的mRNA和蛋白表达;采用RT-PCR法检测增殖分化相关基因CDK4、CDK2、p21、p27、cyclin E、Rb、E2F、E6/E7、Ki-67基因的mRNA表达水平.对细胞同步化处理,用RT-PCR法检测细胞周期不同时间点cyclin D1及p21基因的mRNA表达情况.结果 成功构建cyclin D1稳定过表达的G-3细胞株.生长曲线及Ki-67 mRNA升高（P〈0.05）提示G-3细胞增殖速度加快,G-3细胞中波形蛋白、Snail基因和蛋白表达明显增加（均P〈0.05）,E-cadherin、CK7基因和蛋白表达明显降低,提示转染细胞发生了上皮间质转化.cyclin D1过表达后,CDK4、CDK2、p21、p27、cyclin E表达增加,Rb、E2F、E6/E7、p16表达无明显改变,p21与cyclin D1表达趋势基本一致,在细胞周期不同时间点表达存在波动性.结论 转染诱导cyclin D1过表达可促进SiHa细胞增殖和上皮间质转化,这一过程中伴随着CDK4、CDK2、p21、p27、cyclin E基因表达的上调.cyclin D1过表达时,p21表达量也增高,可能通过影响波形蛋白表达参与了对SiHa细胞上皮间质转化的调控.     

RAW264.7细胞MyD88基因缺失株构建北大核心CSCD

目的:构建MyD88基因缺失的RAW264.7细胞株,为探寻MyD88基因的作用提供重要载体。方法:制备HBLV-Cas9-PURO慢病毒,感染RAW264.7细胞,得到RAW264.7-Cas9细胞株。依据CRISPR/Cas9系统原理,设计3条靶向MyD88基因的sgRNA,慢病毒包装后感染RAW264.7-Cas9细胞株,观察感染效果,PCR和Western blot验证MyD88基因敲除水平并筛选稳转细胞株。选取敲除效果最佳株,经LPS和PGN诱导后,荧光定量PCR和ELISA检测TNF-α表达和分泌。结果:HBLV-Cas9-PURO感染后RAW264.7细胞Cas9基因扩增明显升高,RAW264.7-Cas9细胞株构建成功。包装目的基因的慢病毒感染RAW264.7-Cas9后,荧光显微镜观察导入成功;PCR显示与对照组相比,HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP感染后MyD88基因表达显著下调;Western blot进一步证实,HBLV-m-MyD88 gRNA1-GFP和HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP感染后MyD88蛋白表达下降,且HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP组下降最为显著。LPS和PGN诱导HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP组细胞后,TNF-α表达和分泌水平均下调。结论:利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术成功构建稳定敲除MyD88基因的RAW264.7细胞株。     

汉防己甲素对人鼻咽癌CNE1和CNE2细胞株的放疗增敏作用

目的:探讨最大非毒性剂量汉防己甲素(tetrandrine,Tet)对人鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2的放疗增敏机制。方法:分别采用最大非毒性剂量Tet(对CNE1细胞为1.5μmol/L;对CNE2细胞为1.8μmol/L)、4 Gy放疗和最大非毒性剂量Tet联合放疗处理CNE1和CNE2细胞;流式细胞术检测各组细胞周期分布,Western blot检测各组细胞γ-H2AX、cleaved caspase-3、p-CDC25C、CDK1、p-CDK1、cyclin B1、ERK和p-ERK的蛋白水平。结果:最大非毒性剂量Tet联合放疗后可上调CNE1和CNE2细胞中γ-H2AX的表达。放疗组CNE1和CNE2细胞G_2/M期的比例分别为(18.09±0.42)%和(18.48±1.32)%,联合处理组CNE1和CNE2细胞G_2/M期的比例降为(15.88±1.04)%和(13.80±0.82)%,与放疗组比较差异有统计学意义(P0.05)。联合处理可增加放疗所致的cleaved caspase-3的蛋白水平(P0.05)。不同浓度Tet处理CNE1和CNE2细胞后,p-CDC25C和p-CDK1的蛋白水平随Tet浓度增加而升高(P0.05),CDK1的表达无明显改变;最大非毒性剂量Tet不影响p-CDC25C、p-CDK1和CDK1的蛋白水平。在CNE1和CNE2细胞中,联合处理可明显降低放疗引起的p-CDC25C和p-CDK1的蛋白水平(P0.05),上调放疗后cyclin B1的表达,而对总CDK1的表达无明显调节作用;联合处理可显著抑制放疗所致的pERK蛋白水平(P0.05)。结论:最大非毒性剂量Tet可以增加放疗引起的CNE1和CNE2细胞的DNA断裂及细胞凋亡,其放疗增敏的机制可能与Tet调控ERK/CDC25C/CDK1/cyclin B1通路、去除放疗导致的G2/M期阻滞有关。     

敲除Dock180抑制大鼠H9C2心肌细胞系增殖和促凋亡

目的探讨敲除细胞质移动蛋白1(Dock180)对大鼠H9C2心肌细胞系增殖和凋亡的影响及其机制。方法用CRISPR/Cas9系统构建single guide RNA(sgRNA)Dock180质粒,并将其包装成敲除Dock180重组慢病毒再进行筛选,建立敲除Dock180的H9C2心肌细胞稳定株。实验分为A:阴性慢病毒组(Cas9)、B:敲除Dock180组、C:阴性慢病毒低氧组、D:敲除Dock180低氧组。RT-PCR检测各组细胞Dock180 mRNA表达水平,Western blot检测相关蛋白的表达水平,MTT检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 B组和D组Dock180 mRNA和蛋白无表达;分别较A组和C组,B组和D组p-ERK1/2、Bcl-2蛋白和细胞增殖率均降低(P0.01),Bax蛋白和细胞凋亡率均增加(P0.05,P0.01);较A组,C组Dock180 mRNA和蛋白表达降低,p-ERK1/2、Bcl-2蛋白和细胞增殖率均降低,Bax蛋白和细胞凋亡率均增加(P0.05,P0.01);较B组、D组p-ERK1/2、Bcl-2蛋白和细胞增殖率均降低,Bax蛋白和细胞凋亡率均增加(P0.05,P0.01)。结论敲除Dock180可抑制H9C2心肌细胞增殖,促进细胞凋亡,其作用可能通过p-ERK1/2、Bax和Bcl-2分子介导。     

SATB1高表达通过促进上皮-间充质转化而介导鼻咽癌细胞侵袭和转移

目的:探讨鼻咽癌(NPC)中特殊富含AT序列结合蛋白1(SATB1)的表达及其与肿瘤侵袭和转移的关系。方法:免疫组化检测76例临床NPC及61例对照鼻咽黏膜慢性炎症(NPI)组织样本中SATB1、上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)的表达,并分析NPC中SATB1与患者临床参数、E-cadherin和vimentin表达的相关性。体外培养不同分化状态的NPC细胞系CNE1、CNE2Z及C666-1,筛选出SATB1高表达细胞系,采用小干扰RNA(siRNA)沉默SATB1表达后,分析上皮-间充质转化(EMT)相关分子的表达及细胞侵袭能力的改变。结果:临床鼻咽组织中SATB1表达定位于胞质和胞核,NPC组中SATB1阳性表达率显著高于对照NPI组(P0.01);E-cadherin在NPI黏膜上皮中呈膜阳性表达,NPC中膜表达水平下降,但出现胞质阳性。NPI中E-cadherin膜阳性率为100%,显著高于NPC的32.89%(P0.01)。Vimentin呈胞质阳性,NPI上皮细胞中均阴性,但NPC中阳性率为51.32%(P0.01)。NPC中SATB1高表达与患者性别、年龄及N分期无关,但与T分期和M分期均呈正相关(P0.05);SATB1高表达与vimentin呈正相关(r=0.358,P=0.009)。NPC细胞系中SATB1表达与细胞分化水平呈负相关。采用siRNA敲减C666-1细胞中SATB1表达后,E-cadherin表达上升,vimentin表达下降,且细胞侵袭能力下降。结论:SATB1高表达通过促进EMT而介导NPC临床进展。     

The expression of cyclin G in nasopharyngeal carcinoma and its significance

To investigate the expression of cyclin G1, cyclin G2 in nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell lines and its significance. The protein expression of cyclin G1, cyclin G2 in NPC cell lines of different differentiation degree (HNE2, CNE1) was detected by indirect immunofluorescence. The mRNA expression of cyclin G1, cyclin G2 in HNE2 and CNE1 was measured with RT–PCR. The cyclin G1 expression in HNE2 and CNE1 was weak, and cyclin G2 expression in the cytoplasm near cell membrane was strong, continuous, and homogeneous. The expression level of cyclin G1-mRNA in HNE2 was 2.097 ± 0.262, which was significantly higher than CNE1 (0.997 ± 0.286, P < 0.05); the expression level of cyclin G2-mRNA in HNE2 was 0.708 ± 0.107, which was significantly lower than CNE1 (1.216 ± 0.037, P < 0.05). Abnormal expression of cyclin G was closely related to tumor differentiation, the origin, and progression of NPC.     

小檗碱增强丝裂霉素C诱导的膀胱癌T24细胞周期阻滞及凋亡

目的:研究小檗碱(berberine,Ber)增强丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)诱导的人类膀胱癌T24细胞周期阻滞和细胞凋亡的作用及其相关机制。方法:将T24细胞分为4组:对照组、MMC组、MMC+Ber组和Ber组;采用CCK-8法检测不同药物处理后T24细胞的活力;采用流式细胞术分析不同药物处理后T24细胞周期的情况;Western blot检测细胞周期调控相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达;Annexin V-FITC/PI双染后用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果:CCK-8实验表明Ber能增强MMC抑制T24细胞活力的作用;流式细胞术检测细胞周期结果显示,MMC+Ber组T24细胞滞于G_0/G_1期(P0.05);与MMC组相比,MMC+Ber组p21和p27的蛋白表达上调(P0.05),cyclin D1、CDK2和CDK4的蛋白表达下调(P0.05),同时Ber促进MMC下调survivin的蛋白表达(P0.05);Annexin V-FITC/PI双染结果显示,Ber能促进MMC诱导的T24细胞凋亡(P0.05)。结论:Ber能显著增强MMC抑制T24细胞活力的作用,其机制可能是通过上调p21和p27,进而抑制cyclin D1、CDK2和CDK4表达;同时通过抑制survivin蛋白的表达,最终导致细胞被阻滞在G_0/G_1期,并促进细胞凋亡。     

小檗碱增强表柔比星诱导T24细胞G_0/G_1期阻滞的作用机制

目的:探讨小檗碱联合表柔比星对膀胱癌T24细胞周期的影响及相关作用机制。方法:实验将膀胱癌T24细胞分为4组:对照组、表柔比星组、表柔比星+小檗碱组和小檗碱组,采用MTT法检测细胞的活力,检测药物处理后对膀胱癌T24细胞增殖的抑制情况。用流式细胞术分析T24细胞周期分布并用Western blot法测定cyclin D1、CDK2、CDK4、P21和P27蛋白的表达水平。结果:小檗碱联合表柔比星显著抑制T24细胞的活力,存在时间依赖性,联合用药组的G_0/G_1期细胞比例增高,S期和G_2期细胞比例降低,与单用药物组及对照组比较有显著性差异(P0.05)。联合用药上调细胞周期依赖性激酶抑制蛋白P27和P21蛋白的表达水平,同时下调cyclin D1、CDK2及CDK4细胞周期蛋白的表达水平。结论:小檗碱增强表柔比星对膀胱癌T24细胞增殖的抑制及G_0/G_1期阻滞,其作用机制可能与上调P27及P21蛋白和抑制cyclin D1、CDK2及CDK4蛋白表达有关。     

沉默ClC-3氯通道基因对HeLa细胞周期分布的影响

目的:探讨沉默HeLa细胞的ClC-3氯通道基因后细胞周期分布的变化及其作用机制。方法:依照siRNA设计原则构建沉默ClC-3基因的ClC-3 siRNA并转染HeLa细胞;实验分为空白对照组(control组)、转染试剂对照组(Lipo组)、阴性对照组(negative siRNA组)和ClC-3 siRNA组。采用real-time PCR检测ClC-3 siRNA的沉默效率;流式细胞术检测细胞周期分布情况;Western blot检测ClC-3蛋白及相关细胞周期蛋白(cyclin)D1、细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)4、CDK6、P21和P27等表达。结果:CIC-3 siRNA成功沉默HeLa细胞的ClC-3基因。和其它组相比,ClC-3 siRNA组的细胞周期被阻抑在G_0/G_1期。CIC-3 siRNA组的cyclin D1、CDK4和CDK6蛋白表达水平明显下降,P21和P27蛋白表达水平明显上升。结论:沉默HeLa细胞ClC-3氯通道基因可影响cyclin D1、CDK4、CDK6、P21和27蛋白的表达水平胆抑HeLa细胞周期停滞在G_0/G_1期。     

Trim72基因在肝癌转移中的功能研究

目的 利用CRISPR-Cas9基因编辑技术验证与非小细胞肺癌转移相关的Trim72基因的敲除是否引起肝癌转移能力的变化.方法 建立稳定表达Cas9蛋白的小鼠肝癌细胞系Hepa1-6(Cas9),随后利用针对Trim72基因的单导向RNA(sgRNA)进行特异性基因敲除获得Hepa1-6(Trim72-KO)细胞系,再通过体外Transwell实验和体内皮下瘤肺转移检测评估该细胞系的迁移和侵袭能力.结果 利用CRISPR-Cas9系统成功获得了Hepa1-6(Trim72-KO)细胞系.Transwell实验结果表明,敲除Trim72基因后,Hepa1-6(Cas9)细胞系的体外迁移和侵袭能力增强;体内皮下瘤肺转移病理检查结果显示,Hepa1-6(Trim72-KO)细胞系(实验组)所成皮下瘤的体内转移能力明显强于未转入相应sgRNA的Hepa1-6(Cas9)细胞系(对照组).结论 通过CRISPR-Cas9系统成功获得了敲除Trim72基因的Hepa1-6(Trim72-KO)细胞系,该细胞系表现出较Hepa1-6(Cas9)细胞系更强的侵袭和转移能力,说明Trim72基因可能在肝癌的侵袭和转移中起重要作用,有望成为肝癌基因治疗的潜在靶点.     

FERMT2在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞生长的调控

目的:观察fermitin家族同源蛋白2(FERMT2)在肝细胞癌(HCC)组织中的表达,并以体外实验分析FERMT2基因敲除对肝癌细胞生长及相关调控分子表达的影响。方法:采用real-time PCR及免疫组化实验检测FERMT2在HCC及癌旁正常肝组织中的表达情况;采用CRISPR/Cas9技术构建FERMT2基因敲除的稳定MHCC97H细胞系,通过WST-1法和流式细胞术比较其与野生型MHCC97H细胞活力、细胞周期和凋亡状态的改变,并采用Western blot检测相关调控蛋白的表达变化。结果:FERMT2在HCC组织中的mRNA和蛋白表达水平均显著高于癌旁组织,且FERMT2蛋白的高表达与HCC患者术后复发有关(P0.05);成功构建了FERMT2基因敲除的稳定MHCC97H细胞系;与野生型细胞相比,FERMT2基因敲除后细胞活力明显减弱,S期细胞数量明显减少,细胞凋亡增加,且细胞内增殖细胞核抗原、细胞周期蛋白及细胞周期蛋白依赖性激酶2的表达均显著降低(P0.05);细胞凋亡抑制因子survivin及Bcl2的表达也明显下降(P0.05),并可检测到cleaved caspase-3。结论:FERMT2在肝癌组织中呈高表达,它可能通过调控细胞周期调节蛋白及抗凋亡蛋白的表达影响肝癌细胞的活力、细胞周期及凋亡,进而在肝癌形成及发展过程中发挥促癌作用。