CVB3感染通过MCP-1介导病毒性心肌炎小鼠单个核细胞迁移

目的:研究B3型柯萨奇病毒(CVB3)感染与病毒性心肌炎(VMC)炎症细胞迁移的关系及机制。方法:采用差异贴壁法分离小鼠心肌细胞;趋化试验分析心肌细胞培养上清对VMC小鼠外周血单个核细胞(PMNC)的趋化性;实时定量RT PCR分析心肌细胞MCP 1的表达。结果:( 1)CVB3感染心肌细胞培养上清对VMC小鼠PMNC的趋化性明显增强。( 2 )CVB3感染2小时后MCP 1的表达开始升高,至6小时达到高峰,8小时下降;随着CVB3感染量的增加,MCP 1的表达明显升高。( 3)2 5 μg/ml抗MCP 1抗体处理后,CVB3感染心肌细胞培养上清对VMC小鼠PMNC的趋化性下降5 4 % (P <0 0 1) ;5 μg/ml抗MCP 1抗体处理后,趋化性下降的幅度与2 5 μg/ml抗MCP 1抗体处理的相比未见明显差异(P >0 0 5 )。结论:CVB3感染通过MCP 1介导VMC小鼠单个核细胞迁移,这可能是CVB3感染诱发心肌组织炎症细胞浸润的重要机制之一     

抗CD4单抗增强抗CD3单抗／IL—2活化的肿瘤特异性T细胞的抗瘤活性

目的探讨抗CD4mAb增强抗CD3mAb刺激的肿瘤特异性T细胞增殖和杀瘤活性的作用。方法将肿瘤细胞免疫的小鼠脾细胞,采用4种不同的方案培养1单独加2×104U/LrIL2IL2组2单独加抗CD3mAb抗CD3组3加抗CD3mAb48h后,再加入抗CD3mAb和2×104U/LrIL2抗CD3 IL2组4同时加抗CD3mAb和抗CD4mAb48h后,再加入抗CD3mAb、抗CD4mAb和2×104U/LrIL2抗CD3 IL2 抗CD4组。然后分别检测4组效应细胞的增殖水平、杀瘤活性及表型。结果抗CD3 IL2组细胞的3HTdR掺入量在第6,12和20d分别为:22045、13986和1931;抗CD3 IL2 抗CD4组细胞的3HTdR掺入量在第6、12和20d,分别为46193、31047和7443,后者明显高于前者P0.05。在培养12d时,抗CD3 IL2组的细胞对FBL3细胞株的最大杀伤率为83.6%;抗CD3 IL2 抗CD4组细胞的最大杀伤率为91.7%。细胞表型:FACS分析表明,抗CD3 IL2 抗CD4组培养12d的细胞,99%以上为Thy1.2 细胞,且CD4 、CD25 细胞的百分率均高于抗CD3 IL2组。结论抗CD4mAb对抗CD3mAb刺激、IL2诱导的肿瘤特异性T细胞的增殖和杀瘤活性具有增强作用。     

抗人Toll样受体4单克隆抗体的制备及其生物活性研究

目的运用单克隆抗体技术制备抗人Toll样受体4(TLR4)单克隆抗体(mhTLR4抗体),并鉴定其生物学活性。方法以重组人TLR4(rhTLR4)作为抗原,腹腔注射免疫Balb/c小鼠。分离小鼠脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合并培养,挑选阳性杂交瘤细胞,扩大培养,制备和鉴定mhTLR4其生物学效应。结果经3次免疫后的小鼠血清中抗rhTLR4抗体的效价具有较高水平的表达。1∶500的小鼠免疫血清可明显抑制人PBMC的TNF-α表达。分离小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,获得3株阳性单克隆杂交瘤细胞。其中2株经过增殖培养、纯化浓缩制备出较高产量的鼠抗人TLR4单克隆抗体。生物学活性测定表明,产生的抗rhTLR4单克隆抗体,能够明显地阻断脂多糖(LPS)诱导的人PBMC细胞对TNF-α的表达。结论本文制备的鼠抗人TLR4单克隆抗体,经鉴定具有较高的阻断内毒素信号传导的效应。为进一步研制人源化抗TLR4抗体、研制新一代抗内毒素靶向药物奠定了基础。     

抗-CD2单克隆抗体诱导受体变化-CD2和CD3的相互作用

抗CD3MCAb和抗CDZMcAb都能延长移植物存活期并使各自的受体表达暂时下凋。抗CD2McAb也能协同抗CD3McAb延长移植物存活期和诱导耐受。该文用免疫荧光染色后细胞计数仪在体外进一步研究了抗CD2和抗CD3单抗联合作用对小鼠T细胞及其亚群受体表达的影响，并用Northern杂交法测定了细胞内CD2和CD3mRNA的水平。结果显示抗CD2McAb12－15加入用尼龙棉纯化的小鼠脾脏T淋巴细胞培养物中，使T淋巴细胞CD2的表达从72.6％（McF0.68）下降到41.5％（McF为0．45），而CD3的表达不变。抗CD3MCAb2C11使CD2表达从72.6％（McF为0．68）上…     

姜黄素对LPS刺激RAW264.7细胞PGE_2和IL-10影响

目的:观察姜黄素对脂多糖刺激小鼠RAW264.7细胞炎症因子的影响。方法:体外培养小鼠RAW264.7细胞,脂多糖刺激小鼠RAW264.7细胞分泌细胞因子,用不同浓度姜黄素进行干预,ELISA法检测培养上清液中抗炎细胞因子IL-10和炎症因子PGE2含量。结果:姜黄素可抑制脂多糖刺激小鼠RAW264.7细胞释放PGE2,促进抗炎因子IL-10表达,并呈一定量效关系,其影响细胞因子释放作用与细胞毒作用无关。结论:姜黄素呈浓度依赖性地抑制脂多糖刺激小鼠RAW264.7细胞释放PGE2,促进IL-10表达。     

IL-2协同抗CD45RB抗体调节Treg/Th17细胞的比例并延长小鼠移植皮肤存活时间

目的:研究IL-2在抗CD45RB抗体诱导免疫耐受中对Treg/Th17细胞分化的影响,进一步阐明抗CD45RB抗体诱导免疫耐受的机制。方法:用免疫磁珠分选C57BL/6小鼠脾脏中的CD4+T细胞,在抗CD45RB抗体与IL-2的作用下培养72小时后,流式检测Treg/Th17细胞的变化。以BALB/c小鼠为供体,C57BL/6小鼠为受体建立同种异基因皮肤移植模型,分别给予抗CD45RB抗体及IL-2等治疗,术后1、3、5、7、9天取受体鼠脾细胞,动态检测Treg/Th17细胞的变化;术后第9天取移植皮肤HE染色观察炎性细胞的浸润情况;观察并记录移植皮肤的存活时间。结果:CD4+T细胞在IL-2联合抗CD45RB抗体的作用下培养72小时后,Treg比例升高,Th17细胞比例下降;IL-2联合抗CD45RB抗体治疗后明显延长小鼠移植皮肤的存活时间。结论:IL-2可以明显增强抗CD45RB抗体诱导免疫耐受的形成,使Treg细胞上调,下调Th17细胞,有利于免疫耐受的形成。     

单克隆抗体治疗预防小鼠急性柯萨基B_3病毒性心肌炎

作者曾发现淋巴细胞在小鼠病毒性心肌炎发生,发展中有意义,因此,本研究探讨T细胞单抗对小鼠柯萨基B_3病毒性心肌炎的作用。 柯萨基B_3病毒Nancy株在Vero细胞中增殖,经空斑试验确定感染性(PFU)。大鼠抗小鼠培养上请单抗Lytl(53～7.3)和Lyt2(53～6.7)来自San Diego Salk研究所细胞供应中心。注射前,透析去除NaN_3。选二周龄雄性C_3H/He小鼠。腹腔接种300pfu(0.1ml)     

小鼠抗CD_3单抗激活的T细胞增殖中IL-1,IL-2,IL-6的级联相关作用

通过自体辅佐细胞(单核或巨噬细胞)提呈处理过的抗原作用于TcR 可激活T 细胞。作用于TcR CD_3复合物的单抗可模拟这种抗原激活效应。作者使用仓鼠抗小鼠单抗145-2 C11,它结合于CD_3复合体上25-KDa的ε链上,从而激活T 细胞增殖。本实验研究了严格去除辅佐细胞的T 细胞在不同浓度培养下,用抗CD_3单抗激活的条件,包括辅佐细胞浓度、二价和多价抗CD_3单抗及细胞因子IL-1、IL-2、IL-6在T 细胞活化增殖     

一种分离、培养扩增小鼠NK细胞方法的建立

目的:建立小鼠NK细胞的分离及培养扩增的方法。方法:用两步黏附分离法和磁珠活化的细胞分选(MACS)法,从小鼠脾脏的单个核细胞(MNC)中分离NK细胞,计数所得细胞的总数,并用FITC抗小鼠CD3和PE抗小鼠NK1.1单克隆荧光抗体染色后,用流式细胞仪(FACS)检测NK细胞的纯度。以YAC -1为靶细胞,用MTT比色法检测NK细胞的杀伤活性。结果:将两步黏附分离法分离的2×107个脾MNC培养5、10、15、20d,计数细胞的总数并检测CD3-NK1.1 细胞百分率,分别为0.5×107、1.4×107、2.6×107、3.0×107和18.36%、43.44%、55.68%、60.03%。效靶细胞25∶1时,NK细胞的杀伤率分别为54.38%、66.54%、79.38%和83.86%,明显高于脾MNC(41.93%)(P<0.01)。MACS法纯化前后细胞的总数和CD3-NK1.1 细胞的百分率,分别为1.0×108、1.5×106和2.54%、93.60%;但纯化后的细胞在体外培养20d时,只扩增到1.9×106个。结论:用两步黏附分离法分离的小鼠NK细胞,培养2～3wk可获得大量的NK细胞,纯度可达55%～60%;在效靶细胞为25∶1时,NK细胞对YAC1细胞的杀伤率约为80%。     

抗尿激酶单克隆抗体的研究——Ⅰ.分泌抗尿激酶单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

用市售的尿激酶(UK),免癌BALB/c小鼠。取脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞FO融合,获得六株分泌抗尿激酶单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1UB_5、1UD_2、3UA_2、3UD_(12)、3UG_2、3UH_7。其中,1UB_5及1UD_2连续传代培养4个月以上,其培养液抗体的ELISA效价仍为10~(-2)～10~(-3)。两株细胞经扩大培养后,注入C_(57)×BALB/c杂交后的F_1代小鼠,诱生的腹水抗体效价为5×10~(-6)～10~(-7)1UB_5、1UD_2所分泌的抗体经ELISA鉴定,分属IgG_1和IgG2a。用高纯度的低分子量UK包被,ELISA检测后表明,两株细胞所分泌的为抗高分子量UK的McAb。 抗UK的McAb用于粗制品UK的纯化及监察某些肿瘤发生与发展的进一步工作正在进行之中。     

霉酚酸衍生物对小鼠T细胞免疫功能的抑制作用

目的研究2种新型霉酚酸衍生物(代号JU95-07B、JU100-07E)在体外对小鼠T细胞免疫功能的影响。方法小鼠脾细胞用抗CD3单克隆抗体(mAb)刺激,同时加入不同浓度(10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L)及在不同时间点(刺激细胞后第0、6、12 h)加入同一浓度(10-5mol/L)的霉酚酸衍生物后,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清中IFN-γ和IL-2的水平。同时利用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测霉酚酸衍生物对T细胞IFN-γ和IL-2的分泌、表面分子CD25的表达以及增殖的影响。结果 2种霉酚酸衍生物对抗CD3刺激条件下诱导的小鼠脾细胞产生的IFN-γ和IL-2均具有浓度依赖性抑制作用,并且在抗CD3刺激的不同时间点分别加入2种霉酚酸衍生物均能不同程度地抑制小鼠脾细胞产生IFN-γ和IL-2;同时,与单独使用抗CD3刺激相比,分别加入10-5mol/L浓度的2种霉酚酸衍生物后,均能抑制小鼠T细胞表面分子CD25的表达以及增殖。结论体外实验表明2种霉酚酸衍生物均对小鼠T细胞免疫功能具有明显抑制作用,该研究提示这2种霉酚酸衍生物可以抑制自身免疫性疾病和移植排斥反应。     

β2糖蛋白Ⅰ免疫小鼠对辅助性T细胞亚群分化的影响

目的探讨β2糖蛋白I(β2GPI)免疫小鼠引起的辅助性T(Th)细胞分化和抗β2GPI抗体产生的机制。方法将健康的BALB/c小鼠随机分为生理盐水组和β2GPI免疫组,每隔2周由尾静脉注射β2GPI或等量生理盐水,共注射2次或4次。采用间接ELISA检测小鼠血清中抗β2GPI抗体的效价;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测小鼠脾脏细胞GATA结合蛋白3(GATA3)、白细胞介素4(IL-4)、表达于T细胞的T盒(T-bet)、γ干扰素(IFN-γ)、Foxp3的mRNA水平;流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞中GATA3阳性细胞和Foxp3阳性细胞的比例。结果 2次免疫后,小鼠血清中出现高效价(1∶100 000)的抗β2GPI抗体,脾脏中Th2特异性指标GATA3、IL-4的mRNA水平和GATA3阳性细胞比例相对生理盐水组升高。4次免疫后,小鼠血清中抗β2GPI抗体效价进一步升高(1∶100 000),脾脏GATA3、Th1细胞特异性标志物(T-bet、IFN-γ)和调节性T细胞特异性标志Foxp3的mRNA水平下调,IL-4的mRNA水平和2次免疫后无明显差异。此外,脾脏细胞中GATA3阳性细胞的比例进一步上调且伴有Foxp3阳性细胞比例的下调。结论β2GPI免疫小鼠引起Th细胞向Th2细胞优势分化,并伴有Th1细胞和调节性T细胞的抑制,有利于抗β2GPI抗体的产生。     

小鼠CTL体外非特异性扩增对其杀瘤活性的影响

目的 在体外用抗CD3单抗、抗CD28单抗和白细胞介素2（IL－2）扩增肿瘤特异性CTL,为肿瘤过继治疗提供足够数量的、具有高度杀瘤活性的效应细胞。方法 采用两种方案培养肿瘤细胞免疫的小鼠脾细胞。（1）抗CD3单抗刺激48h后,加入抗CD3单抗和20U／mlrIL－2（抗－CD3＋IL－2组）;（2）抗CD3单抗和抗CD28单抗同时刺激48h后,加入抗CD3单抗、抗CD28单抗和20U／ml rIL－2（抗－CD3＋抗－CD2＋IL－2组）。分别检测2组效应细胞的增殖水平、杀瘤活性及表型。结果 抗CD3＋IL－2组细胞的^3H－TdR掺入量在第6天、12天、20天分别为22126、52426、2072,抗－CD3＋抗－CD28＋IL－2组细胞的^3H-TdR掺入量在第6天、12天、30天分别为32168、12922、3265,后者明显高于前者。在培养12d时,抗－CD3＋IL－2组细胞对FBL03的最大杀伤活性为66．4％,抗－CD3＋抗－CD28＋IL－2组细胞对FBL－3的最大杀伤活性为77．8％。细胞表型FACS分析结果表明,抗－CD3＋抗－CD28＋IL－2组培养12d后的细胞90％以上为Thy1.2^ 细胞,且CD25^ 细胞在抗－CD3＋抗－CD28＋IL－2组、抗－CD3＋IL－2组分别为23．00％、8．15％。结论 抗CD3单抗、抗CD28单抗和低剂量IL－2同时非特异性刺激,可获得大量扩增的、具有高度杀瘤活性的肿瘤特异性CTL。     

联合应用CD3/CD28单克隆抗体对小鼠T淋巴瘤细胞EL4活化的影响

目的:研究联合应用CD3/CD28单克隆抗体对小鼠T淋巴瘤细胞EL4活化的影响.方法:ELISA方法检测不同浓度CD3/CD28抗体在不同时间点体外刺激EL4细胞后培养上清中IL-2的分泌;CCK-8方法检测EL4细胞增殖能力;流式细胞术检测EL4细胞周期;RT-PCR检测IL-2、NF-κB和NF-AT转录因子的转录情况.结果:在48小时抗CD3抗体(25μg/ml)与抗CD28抗体(2μg/ml)共刺激EL4细胞明显增加IL-2的分泌和细胞增殖能力,不影响细胞周期.结论:EL4细胞可以作为研究小鼠T淋巴瘤细胞活化的细胞模型.     

肾综合征出血热病毒(HFRSV)抗独特型抗体免疫调节初探

本文应用一株HFRSV抗独特型抗体(Ab_2)观察其对HFRSV感染BALB/c小鼠脾细胞体外增殖的影响,以及部分淋巴因子在其中的作用,旨在探讨抗独特型抗体对免疫应答的调节机理。从感染HFRSV小鼠脾细胞中分离制备单个核细胞悬液体外培养,加入不同剂量Ab_2,用~3H-TdR掺入法测定脾细胞增殖水平。结果Ab_2可明显抑制感染小鼠脾细胞在体外的增殖,并呈剂量依赖关系及具有独特型特异性。早期加入EL-4细胞上清或rHuIL-2可完全逆转此抑制作用,且具有剂量依赖和时间相关性。EL-4细胞上清含有IL-2和IL-6。对抗独特型抗体产生抑制作用的机制进行了讨论。     

抗激活小鼠T细胞抗原单克隆抗体(2H3)的免疫生物学特性分析

2H3为一株抗激活小鼠T细胞表面抗原的单克隆抗体。间接ELISA法所进行的免疫球蛋白属性分析实验表明:2H3属于IgG_1型抗体。同位素H~3-TdR掺入实验表明:2H3能以剂量依赖的方式明显抑制小鼠激活T细胞及CTLL-2细胞依赖IL-2的增殖;能够明显抑制ConA诱导小鼠脾细胞转化早期(12h内)的非特异性淋巴细胞增殖反应。对不同品系小鼠间的双向混合淋巴细胞反应(MLR),2H3也表现出明显的抑制作用,且这种抑制作用具有剂量相关性和无H-2限制性。实验结果提示:2H3具有抗小鼠细胞膜表面IL-2R单克隆抗体的免疫生物学特征。     

抗乙肝病毒前S(2)蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步应用

本文用聚合人血清白蛋白亲和层析柱纯化的含前S(2)-HBsAg,脾内接种BALB/c/小鼠,取其脾细胞与Sp2/0-Ag骨髓瘤细胞进行常规方法融合,以4种酶联法进行筛选,并经多次有限稀释亚克隆培养,最终选出3株为分泌抗前S(2)单克隆抗体的细胞株。再经亚克隆培养和多次传代与冻存,并用抑制酶联法检测其抗体,均为抗前S(2)抗体阳牲。接种BALB/c小鼠     

Aβ42及亚单位疫苗诱导小鼠抗体产生及其中和Aβ42的细胞毒性

目的 :探讨Aβ4 2 及其亚单位肽疫苗接种小鼠后特异性抗Aβ4 2抗体的产生情况。方法 :75只 6wk龄雄性BALB/c小鼠 ,随机分为 5组 :即对照组、Aβ4 2 组 ,Aβ3 6 - 42 组、Aβ1- 15 组和FAβ1- 15组。分别用PBS MF59佐剂 ,Aβ4 2 MF59,Aβ36～ 4 2 七聚赖氨酸 (MAP) MF59,Aβ1- 15 MAP MF59,Aβ1- 15 MAP 福氏佐剂 ,免疫BALB/c小鼠 4次。用间接ELISA法 ,检测各组免疫小鼠血清和脑组织匀浆上清液中特异性抗体的滴度。将Aβ42 、Aβ3 6 - 42 和Aβ1- 15 与培养的PC12细胞共同培养 7d ,用MTT比色法检测 3种抗原肽对PC12细胞的毒性。将各组免疫小鼠的血清加入到含 2 0mg/LAβ4 2 的培养基中 ,再与培养的PC12细胞一起培养 7d ,用MTT比色法测定PC12细胞的存活率。结果 :第 2次免疫后 ,各实验组小鼠的免疫血清均有抗Aβ42 抗体产生 ,且抗体滴度随接种次数的增多而增高。同时 ,在脑组织匀浆上清液中也可检测出低滴度的抗Aβ4 2 抗体。Aβ42 可降低PC12细胞的存活率 ;而不同浓度的Aβ3 6 - 42 和Aβ1- 15 则对PC12细胞的存活率无显著影响。将 4组疫苗免疫血清和 2 0mg/LAβ42 同时加入培养基中培养PC12细胞时 ,可显著提高其存活率。结论 :Aβ42 及其亚单位疫苗 (Aβ1- 15 及Aβ36～ 4 2 )结合MF59佐剂免疫B     

小鼠抗人PD-1单克隆抗体的制备及其生物学活性评价

目的制备鼠抗人PD-1单克隆抗体,并对其生物阻断活性进行评价。方法利用重组人源PD-1/PDCD1蛋白作为免疫蛋白,免疫接种Balb/c小鼠,分离并提取小鼠脾淋巴细胞,然后与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞融合培养,经过多次克隆化培养筛选出稳定分泌鼠抗人PD-1单抗的杂交瘤细胞株。鉴定单抗Ig G类别及亚类,并分析其特异性和细胞毒性;建立Hep G2细胞和Jurkat细胞共同培养体系,ELISA法检测PD-1单抗对Jurkat细胞分泌抗肿瘤细胞因子的影响,MTT法分析PD-1单抗对Jurkat细胞杀伤Hep G2细胞能力的影响。结果获得了1株新的小鼠抗人PD-1单克隆抗体,命名为2H7。单抗2H7能够特异性识别T细胞表面的PD-1蛋白;高浓度长时间处理对Jurkat细胞有一定毒性作用;低浓度单抗2H7可阻断PD-1/PD-L1信号通路,使Jurkat细胞对Hep G2细胞杀伤能力显著增强(P0.01),且Jurkat细胞分泌的IL-2和IFN-γ等细胞因子水平显著高于对照组(P0.01)。结论成功制备了1株具有良好生物阻断活性的小鼠抗人PD-1单克隆抗体2H7,该抗体能够显著提高T细胞对肝癌细胞Hep G2的杀伤能力。     

嗜酸性粒细胞提呈抗原对肺组织CD4+细胞分化的影响

目的:探讨嗜酸性粒细胞(EOS)对肺组织中的CD4 细胞分化的影响。方法:以鸡卵清蛋白(OVA)致敏和雾化吸入刺激BALB/c小鼠以诱发气道的EOS在气道聚集后将其分离纯化,然后与来源于致敏小鼠肺组织的CD4 细胞共同培养。在部分试验中加入抗CD80和(或)抗CD86mAb。同时,将EOS注入致敏小鼠气道,3d后,取出肺组织,并将其制成细胞悬液进行培养。收集培养上清液,用ELISA测定其中IL-4、IL-5、IL-13及INF-γ的含量。结果:在和EOS体外共同培养的条件下,肺组织CD4 淋巴细胞产生IL-4、IL-5、和IL-13等Th2类因子,但不产生INF-γ等Th1类因子;抗CD80和(或)抗CD86mAb可以明显抑制Th2类细胞因子的产生。将EOS注入致敏小鼠气道后,同样在体内能激发肺组织CD4 活化,产生Th2细胞因子IL-4,IL-5,IL-13,但不产生INF-γ,与体外结果相似,抗CD80和(或)抗CD86mAb可以抑制EOS在体内的抗原提呈过程。结论:EOS细胞在体内或体外均能摄取和处理抗原,激发CD4 的Th2反应。