MICA新等位基因MICA*002:04的DNA序列鉴定及分析

目的:直接测序法及外显子3 DNA片段克隆测序定确认MICA新的等位基因MICA*002:04。方法:用组特异性引物分别扩增MICA基因,采用Sequence Base Typing(SBT)法分型技术及PCR片段克隆测序法对MICA多态性基因的外显子2、3、4、5进行双向测序。结果:发现1个与MICA*002:01序列相近的新等位基因,在外显子3上有1个碱基位置与国际通用MICA数据库不相符。该基因与MICA*002:01相比在外显子3的碱基位置486出现突变(C→A),密码子位置20由GCC→GCA,相应编码氨基酸是同义突变。结论:DNA测序结果表明该基因序列为新的MICA等位基因,已提交GenBank,于2010年9月被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为MICA*002:04。     

MICA无效等位基因MICA*063N核苷酸序列全长分析

目的 分析主要组织相容复合物I类相关基因A(rnajor histocompatibility complex class Ichain-related gene A,MICA)无效等位基因MICA* 063N的核苷酸序列及探讨其分子基础.方法 采用直接测序法(sequence-based typing,SBT)对MICA* 063N基因进行多态性分析并应用基因克隆测序法检测其碱基序列,应用测序软件比对MICA分型.结果 直接测序法发现该基因序列与MICA* 027类似,在第2外显子编码子62碱基位置184出现信号“Y”,提示该位置出现碱基突变.再以克隆测序法证明,该碱基突变为C→T,在该位置编码子由CAG→TAG,TAG编码终止密码子.由于该等位基因提前出现终止密码子,因此推测可能该基因表达为截短或无效蛋白质.结论 MICA* 063N基因序列已提交GenBank,已于2010年10月获世界卫生组织HLA命名委员会正式命名(编号HWS10011131).     

MICA基因第2～4外显子大规模双向测序及分子克隆检测平台的建立

目的 建立稳定的、大规模的MICA基因第2～4外显子双向测序分型检测技术平台,并分析其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP).方法 自行设计MICA基因第2～5外显子扩增引物及测序引物,探索PCR扩增及测序的最佳反应条件.用商品化的MICA基因单向测序分型试剂盒作为平行对照,对4个包含MICA* 010等位基因的样本采用自行设计引物扩增,并进行分子克隆和单倍体测序.结果 采用自行建立的MICA基因双向测序分型方法验证了100人份平行对照组单向测序分型结果.应用本研究建立的方法获得了中国人群MICA基因第2～4外显子22个SNP位点.两个新等位基因MICA* 065、MICA* 066获得了世界卫生组织的正式命名.首次发现了MICA等位基因第3内含子新的SNP位点,序列已提交IMGT/H LA数据库.结论 建立的MICA基因双向测序方法可大规模应用于中国人群的MICA基因多态性、组织器官移植配型和疾病研究.     

新等位基因HLA-A*01:130的序列分析及HLA分子三维结构模拟

目的:确认HLA新等位基因HLA-A*01:130并分析其有异常反应格局的核苷酸序列。方法:应用DNA测序分型技术(PCR-SBT)进行HLA分型,对可疑新等位基因采用单链测序基因分型技术直接测定基因序列,分析其与同源性最高的HLA等位基因序列的差异。最后,经Swiss-Model对HLA分子进行三维结构模拟。结果:新基因与所有已知的HLA-A等位基因序列均不相同,与HLA-A*01:66基因序列相比在第3外显子368位碱基由A→G,导致第99位密码子改变,酪氨酸→半胱氨酸。替代氨基酸位于抗原肽结合区β片层上。结论:发现一个新的HLA-A等位基因,现已被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*01:130。     

人MICA*008等位基因预筛选及其真核表达载体的构建与表达

目的:应用序列特异性PCR技术(PCR-SSP)分析不同细胞系中MICA*008等位基因特异性位点,筛选出人MICA*008基因型,并构建其真核表达载体.方法:PCR-SSP技术分析本实验室保存的多种人源性细胞系中多态性基因MICA的特异性位点,预筛选出包含MICA*008等位基因的细胞系,应用RT-PCR扩增MICA*008基因片段,随后克隆到pcDNA3(+)真核表达载体,用经过测序、鉴定的pcDNA3(+)/MICA*008质粒转染结肠癌细胞系sw480,通过流式细胞术检测MICA膜蛋白表达水平.结果:预筛选出包含MICA*008基因型的细胞系,成功构建了pcDNA3(+)/MICA*008质粒,pcDNA3(+)/MICA*008转染sw480细胞系后,其MICA膜蛋白表达水平明显提高.结论:验证了应用PCR-SSP技术对细胞系中对特定MICA等位基因预筛选的可行性,成功构建了多态性MICA基因中MICA*008等位基因的真核表达载体pcDNA3(+)/MICA*008并转染结肠癌细胞系sw480,为后续体外研究MICA*008在结肠癌及其他肿瘤的作用奠定了基础.     

中国汉族人群人类白细胞抗原新等位基因A~*1155的确认

背景:在国内发现的新等位基因中,大部分都是先采用人类白细胞抗原分型低分辨方法进行分型,如发现反应格局异常后,再进一步用基因测序或基因克隆方法进行确认,这样有可能导致一些新等位基因未被发现。基因测序分型方法被认为是人类白细胞抗原分型的金标准,它可得出精确的核苷酸序列。目的:直接采用基因测序分型方法对中华骨髓库标本进行检测,识别和确认中国汉族人群中新发现的等位基因。方法:应用中国造血干细胞捐献者测序结果可疑为新等位基因的重采血样5mL,采用基因测序分型技术,发现一样本HLA-A位点的杂合结果HLA-A*030101/A*110101在外显子上有1个位置与数据库不符,为了区别哪一个为新等位基因,采用基因克隆(TOPOTACloning)技术对两个等位基因1-8外显子进行DNA双向测序,发现1个与HLA-A*110101序列相近的新等位基因,分析两者核苷酸序列的差异。并将测序结果与已知人类白细胞抗原等位基因序列比较分析。结果与结论:通过克隆分离杂合等位基因,再进行测序确认发现新的序列与A*110101相比,在第2外显子第330碱基位置上C→G,密码子86AAC→AAG,发生了氨基酸的改变,由天冬酰氨变为赖氨酸。提示该等位基因为新的HLA-A等位基因,2009-10-31被世界卫生组织人类白细胞抗原因子命名委员会正式命名为HLA-A*1155。     

新等位基因人类白细胞抗原B*4609的发现和确认

目的 鉴定一个人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)新等位基因HLA-B*4609.方法 使用序列特异性寡核苷酸PCR技术进行HLA基因分型,发现反应格局异常的可疑新等位基因,应用分子克隆和DNA双向测序技术测定新等位基因的核苷酸序列,并与已知等位基因进行序列比对分析.结果 检出1个样本HLA-B位点反应格局异常,DNA测序分型结果一个为B*151101,另一个的核苷酸序列与已知的HLA等位基因均不同,该基因序列与同源性最高的HLA-B*460101基因序列相比,在第3外显子区域中527位碱基发生A→T突变,导致176位编码氨基酸由谷氨酸(GAG)变成缬氨酸(GTG).结论 样本中含有HLA-B新等位基因序列.该序列申报后,被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*4609.     

新等位基因HLA-B*9526的确认和序列分析

目的 鉴定中国人群中人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)新等位基因HLA-B*9526,并进行核苷酸序列分析.方法 使用序列特异性寡核苷酸PCR技术进行HLA基因分型,发现1个反应格局异常的等位基因,应用分子克隆和DNA双向测序技术测定新等位基因的核苷酸序列,并与已知等位基因进行序列比对分析.结果 检出反应格局异常的DNA样本,经过克隆测序得到两个等位基因,分型结果一个为B*5403,另一个的核苷酸序列与已知的HLA等位基因均不同,该基因序列与同源性最高的HLA-B*1507基因序列相比在第3外显子区域中425位碱基发生A→G突变,导致142位编码氨基酸由酪氨酸变成半胱氨酸.结论 一个新的HLA-B等位基因被确认,并被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*9526.     

DNA测序鉴定新等位基因HLA-DRB1*1609

目的 鉴定HLA新等位基因DRB1＊1609。方法 应用分子克隆和DNA测序的技术测定HLA新等位基因的核苷酸序列，进行HLA等位基因序列比对分析和新等位基因的血清学分型及家系分析。结果 新等位基因DRB1第二外显子（exon2，Ex2）序列与所有已知的HLA等位基因序列均不相同，与同源性最高的HLA-DRB1＊160101相比，第127位碱基由A→T，引起相应编码第47位氨基酸由酪氨酸Tyr（Y）→苯丙氨酸Phe（F）。血清学分型表明抗原特异性为DR16。家系分析提示该志愿者DRB1＊1609等位基因遗传自母亲。结论 DNA测序表明被测标本含有HLA-DRB1新等位基因，被WHOHLA因子命名委员会正式命名为HLA-DRB1＊1609。     

一例HLA-A新等位基因HLA-A*3113的测序分析

目的研究HLA新的等位基因HLA-A * 3113的分子机制。方法样本DNA抽提采用PEL-FREEZ抽提试剂盒,利用PCR方法扩增先证者HLA-A基因的第1～8外显子,PCR产物直接经TOPO TA克降转染到质粒载体中获得等位基因的单链,对所得克隆进行第2、3、4外显子双向测序分析。应用序列特异性引物PCR方法证实测序所发现的突变。结果先证者样本克隆测序得到两个等位基因,其中一个等位基因为A*2402,另一个经BLAST验证其为新的等位基因,新的等位基因序列已递交GenBank(DQ206619,DQ206620,DQ206621)。与最接近的A*310102等位基因序列相比,新的等位基因在第3外显子上有1个核苷酸不同,第456位G→c,导致第128位氨基酸E→D。结论该等化基因为新的HLA-A等位基因,被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*3113。     

新等位基因HLA-A*240212的认定

目的发现和认定1个HLA新等位基因。方法应用PCR-SSO基因分型技术筛选可能的HLA新等位基因，PCR产物测序，确认与最同源HLA等位基因序列的差异。结果发现一个样品的HLA-A位点结果异常。其序列与已知所有HLA—A等位基因序列不一致，与同源性最高等位基因A＊24020101的差异只是在第2外显子区域中的230位碱基发生了C→T碱基的替换，但并未改变第77密码子编码的氨基酸。结论该等位基因为HLA-A位点的1个新等位基因，已被WHOHLA因子命名委员会于2006年8月23日正式命名为HLA-A＊240212。     

湖南北部汉族人群MICA/B基因多态性研究

目的 研究MICA/B等位基因在湖南北部汉族人群中的分布特点.方法 采用PCR-SSP(PCR-sequence-specific primers)方法和PCR-SBT(PCR-sequence-based typing)方法对95名无亲缘关系的个体进行MICA/B基因分型.结果 在湖南北部汉族人群中共检测到11个MICA等位基因,频率最高的依次为MICA *010 (28.95％)、MICA *008∶01(20.53％)和MICA* 002∶01(15.79％);共检测到5种STR(short tandem repeat)型别,其中MICA* A5 (37.89％)和MICA* A5.1(21.05％)频率最高.在湖南北部汉族人群中共检测到10个MICB等位基因,以MICB* 005∶02/010最常见(58.42％),其他较常见的等位基因有MICB* 002∶01(10.00％)、MICB* 008 (7.89％).在湖南北部汉族人群中,单倍型MICA* 004-MICB* 004∶01与MICA* 010-MICB* 005∶02/010具有显著的连锁不平衡.将MICA/B基因在湖南北部汉族人群中的分布与该基因在其他人群中的分布进行比较,显示MICA/B基因的分布在不同人群之间存在差异.结论 湖南北部汉族人群有自己独特的分布特征.     

强直性脊柱炎患者MICA基因第2、3和4外显子的多态性及其与HLA-B抗原的连锁不平衡

目的探讨皖籍汉族人群MICA基因（major histocompatibility complex class Ⅰchain-related gene A，MICA）第2、3、4外显子的多态性，及其与HLA-B抗原的连锁不平衡在强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）发病中的作用。方法采用聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针杂交（polymerase chain reactionsequence-specific oligonucleotide probing，PCR-SS0）技术对56例AS患者和112名正常对照人群进行MICA基因第2、3、4外显子的多态性和HLA-B抗原的检测。结果AS患者和正常对照人群的MICA等位基因分布均以MICA＊008占优势，频率分别为32．14％和30．36％。两组人群MICA＊007等位基因的分布差异有统计学意义（X^2=10．18，P〈0．05，RR=2．50）。单倍型分析显示，AS患者和正常对照人群的MICA等位基因均显示出与多个HLA-B位点的连锁不平衡现象，两组间差异有统计学意义的单倍型为MICA＊007-B27（X^2=18．46，P〈0．05，RR=7．47）。分层分析结果显示，HLA-B27阳性与AS的相关性有统计学意义（P〈0．05），但MICA＊007基因与AS的相关性无统计学意义（P〉0．05）。结论AS患者中MICA＊007等位基因频率的显著升高可能源于MICA基因与HLA-B位点间的广泛连锁不平衡。     

一例HLA-A新等位基因A*3308的测序分析

目的研究HLA新的等位基因HLA-A＊3308的分子机制。方法样本DNA抽提采用PEL-FREEZ抽提试剂盒，应用PCR方法扩增先证者HLA-A基因的第1～8外显子，PCR产物直接经TOPO转染克隆到质粒载体中获得等位基因的单链，对所得克隆进行第2、3、4外显子双向测序分析。结果先证者样本克隆测序得到两个等位基因，其中1个等位基因为A＊0201，另一个经BIAST验证其为新的等位基因，新的等位基因序列已递交GenBank（DQ089631，DQ089632，DQ089633）。与最接近的A＊3303等位基因序列相比，新的等位基因在第2外显子上有5个核苷酸不同，即第240位A→T，第256位C→G，第259位A→G，第261位C→G和第270位T→A；这导致3个氨基酸改变：第62位Arg→Gly、第63位Asn→Glu和第66位Asn→Lys。结论该等位基因为新的HLA-A等位基因，被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A＊3308．     

HLA新等位基因HLA-DRB1*0453的认定

目的鉴定一个HLA-DRB1＊04的新等位基因。方法从外周血中提取基因组DNA．应用PCR-SSO技术进行中低分辨率的HLA基因分型，PCR产物直接测序技术检测基因序列，通过软件和数据库中的同源等位基因进行序列比对，对先证者进行家系分析。结果样本HLA-DRB1位点的第2外显子序列与所有已知HLA-DRB1等位基因序列不同，该基因序列与同源性最高的等位基因DRB1＊0447相比有3个碱基替代，在外显子2区域中的286位碱基发生了C→A替代，导致相应的67密码子由亮氨酸（L）→异亮氨酸（I），344和345位碱基发生了GT→TG替代，并导致相应的86密码子由甘氨酸（G）→缬氨酸（V）。家系分析结果显示，先证者的新等位基因HLA-DRB1＊0453遗传自父亲。结论该等位基因是HLA-DRB1＊04新的等位基因，被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-DRB1＊0453。     

MICA基因与系统性红斑狼疮关系的研究

目的 明确云南汉族群体中主要组织相容性复合物Ⅰ类链相关基因A（major histocompatibility complex class I chian-related gene,MICA）基因与系统性红斑狼疮（systemic Iupus erythematosus,SLE）的关系。方法 应用STR扫描分型技术、聚合酶链反应－单链构象多态性和DNA双向序列测定，确定MICA基因第4、5外显子在云南汉族70例SLE患者和152名正常对照中的等位基因及其分布频率。结果 共发现MICA第5外显子5种等位基因和第4外显子10种等位基因，并确定了各自在病例组和对照组中的分布频率，表明MICA第4、5外显子各等位基因的分布频率在SLE病例组和对照组中差异无显著性。结论 云南汉族群体中MICA基因第4、5外显子的各等位基因与云南汉族系统性红斑狼疮无相关性。     

一例白血病患者及家系HLA-B基因全长序列及18个点突变分析

文题释义：人类白细胞抗原B(human leucocyte antigen,HLA-B)：HLA-B属于HLA经典一类分子,位于人类6号染色体短臂,具有高度的基因多态性,其表达的产物分布在几乎所有有核细胞表面,参与抗原提呈和特异性免疫应答反应。 下一代测序技术：一种以“边合成边测序”为核心思想的高通量测序技术,能够在短时间内同时对上百亿碱基进行测序。在人类基因组、转录组、肿瘤等研究领域具有巨大的应用价值。 背景：人类白细胞抗原HLA经过长期进化形成丰富的多态性,近几年由于受检人数增加及HLA分型技术快速发展,HLA新基因不断被发现。 目的：采用下一代测序技术对1例白血病患者及家系HLA-B基因的全长序列及18个点突变进行分析。 方法：应用序列特异性寡核苷酸探针杂交(PCR-SSOP)及聚合酶链反应-直接测序法(PCR-SBT)发现患者的HLA-B结果异常。为了鉴定该基因,采用下一代测序技术对该基因全长进行测序,同时采集患者父亲、母亲及2位同胞姐妹的血样进行HLA基因的遗传学分析。 结果与结论：应用序列特异性寡核苷酸探针杂交及聚合酶链反应-直接测序法均提示该样本HLA-B无完全匹配的基因型。应用下一代测序技术分析发现,与同源性最高的等位基因B*15:09:01相比,该基因在外显子、内含子和3′UTR共存在18个碱基突变。5个外显子碱基突变位于第3,4外显子,分别为：第486位G→C、第583位T→C、第636位T→C、第652位A→G和第756位C→T,导致5个相应密码子发生改变,其中2个碱基替换为错义突变,第171位酪氨酸(Tyr)→组氨酸(His)、第194位异亮氨酸(Ile)→缬氨酸(Val)。家系调查显示患者HLA-B新基因来源于父亲。新基因序列已递交给Genbank数据库(MG595995)。应用下一代测序技术鉴定了1个HLA-B新等位基因,该基因于2017年12月被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*15:435。 ORCID: 0000-0002-2210-9889(钟艳平) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

人类白细胞抗原新等位基因HLA-A*3020的鉴定及确认

目的 鉴定及确认1名中国人的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)新等位基因.方法 应用聚合酶链式反应-序列特异性寡核苷酸探针(polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleotide probes,PCR-SSOP)方法基因分型、PCR产物测序和基因克隆DNA测序方法,通过软件分析该基因序列及与最相近HLA等位基因序列的差异.结果 PCR-SSOP基因分型结果显示该样品HLA-A谱型为与已知HLA-A等位基因谱型不一致的新谱型;测序结果显示该样品HLA-A位点第2外显子序列与所有已知HLA-A等位基因序列不一致.软件分析表明该基因序列与序列最相近的等位基因A*300101,在所检测的第1～3外显子中的差异只是在第2外显子区域产生了nt 294 C→A一个碱基替代,并导致相应的密码子98由GAC(D)→GAA(E).结论 该基因为HLA新等位基因,被世界卫生组织HLA因子专用术语命名委员会正式命名为HLA-A*3020.     

湖南汉族人群MICA基因多态性分析

为了解湖南地区汉族人群MICA基因第2、3和4外显子多态性分布特点,采用PCR-SSP方法对162名无亲缘关系湖南汉族人群MICA等位基因进行分析。结果显示:在湖南汉族人群中共检测出12个等位基因和28种基因型,各等位基因分布频率有差异,其中以MICA*00801基因频率最高(37.9%),其次为MICA*00201/020(20.1%)和MICA*010(17.3%),频率最低的是MICA*019和MICA*031。将MICA基因在湖南汉族人群中的分布与该基因在其他人群中的分布进行比较,显示MICA基因的分布在不同人群之间存在差异,可作为中国人群的遗传标志。     

MICA 第5 外显子微卫星多态性与食管癌相关性研究

目的:研究MICA 第5 外显子微卫星多态性与食管癌相关性。方法:采用PCR-STR 微卫星基因分型技术检测103 例食管癌患者和84 例正常对照MICA 基因5 外显子多态性。构建食管癌标本中高频率出现的MICA 等位基因的真核表达载体,转染293T 细胞株,LDH 法检测NK 细胞对不同MICA 等位基因转染的293T 细胞的杀伤作用,效靶比20 1。ELISA法检测转染的293T 细胞上清中sMICA 含量。结果:食管癌患者第5 外显子检测到5 种等位基因,频率分别为:MICA-A4(9.71%),MICA-A5(22.3%),MICA-A5.1(40.8%),MICA-A6(15.5%),MICA-A9(11.7%),其中MICA-A5.1 与对照组对比差异有统计学意义(P<0.05)。MICA 等位基因转染293T 细胞株后,相对于其他第5 外显子A5.1 组对NK 杀伤的敏感性较低[(30.4±6.3)%,P<0.05],上清可溶性MICA 分泌增加(135.7±6.2)pg/ ml。结论:食管癌与MICA 第5 外显子多态性A5.1 显著性相关,其危险性高于其他等位基因。