胚胎干细胞源性表皮干细胞对小鼠全层皮肤缺损的修复

目的 研究129小鼠胚胎干细胞(ES cell)源性表皮干细胞在同种小鼠全层皮肤缺损的生长和分化,探讨Es细胞源性表皮干细胞对全层皮肤缺损的修复作用.方法 以生物膜为载体,将羊膜诱导后带有核荧光标记的ES细胞源性表皮干细胞直接覆盖小鼠全层皮肤缺损创面.术后1～8周连续取材,HE染色,β1整合素、CK15、CK19、CK10、CEA免疫组织化学和荧光双标显色.结果 术后2周,创面完全长合,较厚的新生皮覆盖创面,基底层细胞增生,形成许多大小不一的细胞柱伸向真皮层,真皮层中可见管腔样结构,免疫荧光双标显示,1～3周新生表皮中可见核标记的细胞呈β1整合素、CK15阳性,真皮层中带有核标记的管状或泡状结构呈β1整合素、CK15阳性;4周后新生表皮开始变薄,基底层细胞呈CK19、CK10阳性,汗腺样结构呈CEA阳性,6～8周新生表皮下可见毛囊样、汗腺样、皮脂腺样等结构.结论 ES细胞源性表皮于细胞植入小鼠全层皮肤缺损创面,可修复缺损的表皮,并在其下真皮层内具有分化为汗腺样、毛囊样和皮脂腺样结构的潜能.     

ES细胞源性表皮干细胞在皮肤缺损创面的分化

目的探讨ES细胞源性表皮干细胞移植入小鼠全层皮肤缺损后对创面的修复作用,为组织工程皮肤的研究提供新的思路。方法将羊膜诱导后的带有核荧光标记的ES细胞源性表皮干细胞以生物膜为载体,覆盖小鼠全层皮肤缺损创面。术后1～8周连续取材,HE染色观察,苏丹Ⅲ染色,β1整合素、CK15、CK19、CEA免疫组化荧光双标观察。结果术后2周,创面完全长合,较厚的新生皮完全覆盖创面,基底层细胞增生,形成细胞柱伸向真皮层,真皮层中可见管腔样结构,4周后新生表皮开始变薄,新生表皮下可见毛囊样、汗腺样、皮脂腺样等结构,皮脂腺样结构苏丹Ⅲ染色阳性。免疫双标结果显示,1～4周新生表皮基底层细胞呈β1整合素、CK19阳性,真皮层中带有核标记的管状或泡状结构呈CK15、CEA阳性。结论ES细胞源性表皮干细胞在小鼠全层皮肤缺损创面可分化为表皮样、汗腺样、毛囊样和皮脂腺样等结构的潜能。     

MSCs构建的类真皮对ES细胞源性表皮干细胞分化潜势的影响

目的 探讨以MSCs构建类真皮对ES细胞源性表皮干细胞分化潜能的影响.方法 大鼠骨髓MSCs与复合凝胶一明胶海绵组成类真皮,Hoechst33342标记E14-ES细胞,经羊膜诱导4 d后,形成表皮干细胞克隆,将二者构成皮肤类似物,埋植于129小鼠皮下.术后2、4、6和8周取材,做HE染色,β1整合素、CK15、CK19、CEA、CK18免疫荧光双标和免疫组化观察.结果 术后2和4周,植块中以形成单层立方或柱状上皮构成的管状和泡状结构为主,6和8周后,可见角化复层上皮、毛囊样、汗腺样、皮脂腺样等结构,皮脂腺样结构多见.免疫双标结果显示,植入2和4周,带有蓝色核标记的细胞形成的管状或泡状结构,呈β1整合素、CK15、CK19、CEA和CK18阳性,6和8周后,HE染色汗腺样结构呈CEA、CK18阳性.结论 ES细胞源性表皮干细胞与骨髓MSCs构建的类真皮,在同种小鼠皮下可分化出角化复层上皮、汗腺样、毛囊样、皮脂腺样等结构.     

胚胎干细胞源表皮样干细胞分化潜能的初步研究

目的 探讨胚胎干细胞(ES)源表皮样干细胞的分化潜能，为研究其分化的调控及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础。方法 将Hoechst33342标记或未标记的小鼠ES细胞，与人羊膜共培养4d，诱导其定向分化为表皮样干细胞克隆，胰酶消化后移植于裸鼠皮下，10、20、30和45d，对移植后细胞的分化进行形态学和免疫组织化学观察分析。结果 10～20d后，标记的细胞可分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状或泡状结构，它们分别呈β1整合素、CK19、CK15、PK、套膜蛋白(invo1ucrin)和CEA阳性；移植45d后，可见角化复层扁平上皮、皮脂腺样、汗腺样和毛囊样等组织结构。结论 小鼠ES源表皮样干细胞具有分化为角化复层扁平上皮和毛囊样、汗腺样和皮脂腺样等结构的潜能。     

体外定向诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞的研究

目的　探索体外定向诱导小鼠胚胎干细胞 (embryonicstemcell,ES)分化为表皮样干细胞的条件 ,为胚胎干细胞来源的表皮样干细胞的临床应用 ,及ES细胞的定向分化机制的研究奠定基础。　方法　采用与人羊膜共培养法对小鼠胚胎干细胞进行定向诱导。实验分 3组 :1 羊膜上皮面向上 ,铺布全孔底 ;2 羊膜上皮面向上 ,铺布半孔底 ;3 以不加羊膜组为对照。用流式细胞仪、免疫组织化学技术对分化后的细胞进行鉴定。　结果　共培养 3～ 4d后 ,在第 1、2实验组中的人羊膜上皮面上 ,小鼠ES细胞形成表皮样干细胞集落 ,表达高水平的表皮干细胞特异标志物整合素 β1 、CK19和CK15。流式细胞仪检测结果显示 :整合素 β1 、CK19和CK15阳性细胞比率均较对照组有显著差异 (P <0 0 1)。而在第 2实验组中无羊膜覆处 ,细胞贴壁生长 ,形成表皮样细胞单层 ,细胞呈多边形 ,排列紧密 ,表达整合素 β1 ,仅见少数CK19和CK15阳性细胞散布于表皮样细胞之间。流式细胞仪检测结果显示 :整合素 β1 阳性细胞率与对照组有显著差异 (P <0 0 1) ,而CK19和CK15阳性细胞率与对照组差异不明显。　结论　人羊膜可诱导小鼠胚胎干细胞向表皮样细胞定向分化 ,并提示生长在羊膜上皮面上的细胞克隆可能是表皮样干细胞 ,而贴壁生长的细胞可能是表皮样细     

胚胎干细胞向表皮样干细胞分化体外条件的研究

目的　探索体外诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞的最佳条件 ,为研究其分化的调控机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础。方法　将小鼠胚胎干细胞与人羊膜共培养 ,以不同的羊膜铺布方式 ,分 4个实验组 :(1)羊膜上皮面向上铺布全孔底 ,(2 )羊膜基底面向上铺放全孔底 ,(3)羊膜上皮面向上铺布半孔底 ,(4)羊膜基底面向上铺布半孔底 ,以未加羊膜为对照组 ,倒置显微镜下观察细胞的生长和形态分化 ,用抗 β1整合素单克隆抗体免疫组化检测胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化。结果　培养 4～ 5d后 ,实验组 (3)中的ES细胞分化为表皮样干细胞 ,细胞呈多边形 ,体积增大 ,排列紧密 ,形成大面积细胞单层 ,而其他各实验组 ,ES细胞虽可分化为表皮样细胞 ,但呈集落生长 ,不形成细胞单层 ;对照组大量细胞死亡 ,形态各异。各实验组的细胞绝大多数呈现 β1整合素阳性 ,而对照组未见 β1整合素阳性细胞。结论　与羊膜共培养可诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞 ,羊膜上皮面向上铺布半孔底的效果最佳     

大鼠胎儿表皮干细胞的分离鉴定和体内分化

目的探索一种简单而又高效的分离大鼠胎儿表皮干细胞方法,以及观察其在体内环境中的分化潜能。方法采集ED14、ED16、ED18及ED20不同发育阶段的SD大鼠胎儿皮肤,HE染色观察其结构。鼠尾胶原快速黏附法筛选胎鼠表皮细胞,在无血清培养基(K-SFM)中进行培养。免疫组织化学方法检测CK-19和1β-整合素表达情况。同时,也对细胞周期和细胞增殖能力进行检验。经荧光染料(PKH26)标记过的胎鼠表皮干细胞与多孔凝胶海绵结合,然后植入大鼠肾被膜下进行诱导分化。结果在ED18之前皮肤表皮和真皮尚未充分完成分化。使用快速黏附法能够有效的从ED18胎鼠皮肤分离到表皮干细胞。获得的细胞CK19和1β整合素呈阳性表达,细胞周期分析显示,细胞呈慢周期性,移植体在肾被膜下分化并展现典型的表皮样结构。结论表皮干细胞存在于早期发育皮肤中,但在ED18才能使用快速黏附法分离到表皮干细胞。此时的胎鼠表皮干细胞具有向表皮分化的能力。     

Marjolin's溃疡鳞状细胞癌组织中K19、β1整合素的表达

目的检测Marjolin's溃疡鳞状细胞癌中K19、β1整合素的表达情况,探讨Marjolin's溃疡鳞状细胞癌发生与皮肤干细胞的关系。方法选取10例Marjolin's溃疡鳞状细胞癌组织标本、10例皮肤慢性溃疡伴假上皮瘤样增生组织标本、10例原发性皮肤鳞状细胞癌标本、5例正常皮肤组织标本,采用免疫组织化学染色分析皮肤干细胞标记物K19、β1整合素的表达。结果 Marjolin's溃疡鳞状细胞癌组织中,部分癌细胞K19、β1整合素阳性表达,K19为胞浆染色阳性,β1整合素为胞浆、胞膜染色阳性;皮肤慢性溃疡伴假上皮瘤样增生组织在不典型增生部位部分细胞有K19、β1整合素阳性表达;原发性皮肤鳞状细胞癌组织中无K19、β1整合素的表达;K19、β1整合素在正常皮肤毛囊的隆突部位以及基底层仅有少量细胞呈阳性表达。结论皮肤慢性溃疡可以癌变成Marjolin's溃疡鳞状细胞癌,癌变的种子细胞可能来源于溃疡局部的皮肤干细胞。     

糖尿病模型皮肤创面中人真皮多能干细胞向表皮细胞的分化

背景：研究表明,干细胞分化为何种细胞与其所处的微环境密切相关。因此设想：人真皮多能干细胞处于皮肤创面的微环境中,可能具有向人皮肤细胞转化的潜能。 目的：探讨糖尿病皮肤创面微环境中的人真皮多能干细胞分化为表皮细胞的可能性。 方法：分离培养人真皮多能干细胞并制作糖尿病裸鼠模型皮肤创面,将标记5-BrdU的第3~5代人真皮多能干细胞以注射方式回植入糖尿病裸鼠创面组织周围,分别于注射后2,3周取材,常规石蜡包埋、连续切片,行BrdU和角蛋白免疫组织化学染色。 结果与结论：BrdU阳性细胞出现在表皮中,且连续切片中部分BrdU阳性细胞也同时表达角蛋白。说明在糖尿病创面愈合过程中,人真皮多能干细胞具有向表皮细胞分化的潜能。     

毛囊干细胞的分离及培养方法研究

目的建立一种分离效率高、创伤小的毛囊干细胞分离方法，筛选毛囊干细胞体外培养的最优条件，考察毛囊干细胞的体外增殖活性。方法获取兔胡须部皮肤全层，比较2种不同分离方法获得细胞的贴壁、增殖及克隆形成情况。通过免疫组化的方法检测毛囊干细胞β1整合素、CK19表达情况。选用MTT法和乳酸脱氢酶来间接反映毛囊干细胞的增殖能力。分析细胞周期考察细胞增殖过程中各期细胞的分布。观察血清浓度梯度条件培养液对毛囊干细胞增殖的影响。结果“两步酶”法的分离能获得大量细胞且细胞迅速贴壁，克隆迅速形成。获取的毛囊干细胞胞浆中有β1整合素、CK19的阳性表达。毛囊干细胞生长曲线及细胞周期都表明毛囊干细胞有高增殖能力。毛囊干细胞增殖表现出血清浓度的依赖。结论“两步酶”法是一种分离效率高、创伤小的方法，能够获取大量高表达β1整合素、CK19的毛囊干细胞。毛囊干细胞在适当条件下表现为高增殖能力，其生长有一定的血清依赖性。     

小鼠表皮干细胞分化潜能的体内植入研究

目的:将小鼠表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)种植到可生物降解的载体内并移植到同基因受者小鼠皮下,研究其分化潜能。方法:在体外诱导ES细胞分化为ESC,经用Hoechst 33342荧光染色后,种植到含有胶原凝胶的聚乙醇酸(polyglycolic acid,PGA)小网内,作为细胞载体移植到与干细胞同基因的129/J小鼠皮下。结果:荧光显微镜观察发现ESC在移植物内至少能存活3周以上,并能分化形成毛囊样和腺样结构,形成与天然真皮相似的结构。在植入后10周内未观察到明显排斥或毒性反应。结论:ESC可作为种子细胞用于制备具有形成真皮附属结构潜能的皮肤替代物的实验研究。     

组织工程皮肤的构建及组织形态学观察

背景：应用于临床的组织工程皮肤具有血管化速度慢、力学强度差以及无法永久性保留等局限,因此,需要对相关技术环节进行改进以制备一种合适的永久性皮肤替代物。 目的：建立一种构建有活性的双层组织工程皮肤的方法,并对其组织形态学进行观察。 方法：以Ⅳ型胶原和成纤维细胞联合修饰的同种脱细胞真皮基质为支架,与表皮干细胞复合后依次经浸没式培养和气液分离界面培养构建组织工程皮肤,利用光镜和扫描电镜对其组织学特点进行观察和分析。 结果与结论：以表皮干细胞和同种脱细胞真皮基质制备的组织工程皮肤具有表、真皮双层结构,其中表皮由多层不同分化程度的表皮细胞组成,真皮为天然三维孔隙结构,胶原纤维完整,且表皮层与真皮层紧密连接,形成整体结构,可满足全层皮肤替代物的基本组织学要求。     

Can hematopoietic stem cells be an alternative source for skin regeneration?

In the past few years, the plasticity of adult cells in several post-natal tissues has attracted special attention in regenerative medicine. Skin is the largest organ in the body. Adult skin consists of epidermis, dermis and appendages such as hair and glands that are linked to the epidermis but project deep into the dermal layer. Stem cell biology of skin has been a focus of increasing interest in current life science. Committed stem cells with a limited differentiation potential for regeneration and repair of epidermis have been known for decades. Recent studies further found that adult skin tissues contain cell populations with pluripotent characteristics. Multipotent stem cells from skin with and without hair follicles, both in epidermal and dermal tissues, can differentiate and generate multiple cell lineages. Especially, the hematopoietic system in epidermal and dermal tissue, like skin, may be a local, acceptable reservoir of various adult stem cell populations. Given their easy accessibility, such stem cells can provide an experimental model not only for skin biology but also for studying the epithelial–mesenchymal cell interactions of organs other than the skin. This review presents an overview of recent advances in research into skin repair and regeneration involving stem cells from epidermis, dermis, and bone marrow. In particular, we focus on the possible use of blood stem cells as an alternative resource for research advances in skin biology.     

热休克汗腺细胞诱导人骨髓间充质干细胞的表型转化

背景：未休克汗腺细胞与骨髓间充质干细胞的共培养和休克汗腺细胞与骨髓间充质干细胞的直接共培养均对骨髓间充质干细胞的表型改变无影响。 目的：在体外建立热休克汗腺细胞模型和骨髓间充质干细胞与汗腺细胞间接共培养体系;分析共培养前后骨髓间充质干细胞的形态学、细胞表型的变化情况,探讨骨髓间充质干细胞向汗腺细胞分化的可行性。 方法：体外分别分离培养、扩增并鉴定骨髓间充质干细胞和汗腺细胞,建立汗腺细胞体外热休克模型,继续孵育3-5 d,收集上清液作为条件培养基对骨髓间充质干细胞分化诱导,对比共培养5,10 d骨髓间充质干细胞形态学变化;应用免疫组织化学和流式细胞仪法检测对比共培养10 d后骨髓间充质干细胞细胞表型的改变。 结果与结论：①骨髓间充质干细胞表面标志 CD29、CD44、CD105阳性,汗腺细胞表面标志CK7、CK8、CK18、CK19、CEA阳性。②骨髓间充质干细胞诱导分化后细胞表型的改变：被诱导的细胞中CEA、CK7、CK8和CK19 染色阳性,而对照组没有检测到CEA、CK7、CK8和CK19染色阳性的细胞;流式细胞仪检测CEA、CK7、CK8和CK19的阳性率分别是60.67%,53.34%,54.11%和58.62%。说明实验成功诱导骨髓间充质干细胞,并获得汗腺细胞表型;通过建立适当的体外汗腺诱导培养体系,中胚层的骨髓间充质干细胞可以通过跨胚层分化途径转变为汗腺细胞。     

人羊膜定向诱导胚胎干细胞分化为表皮样细胞机理的初步探讨

目的:初步探讨人羊膜诱导小鼠胚胎干细胞向表皮样细胞定向分化的机理。方法: 小鼠胚胎干细胞与人羊膜在双层6孔培养板中共培养4-5 d,对照组未加羊膜,观察其形态学分化。分别用β₁整合素、角蛋白19/15和套膜蛋白免疫组化检测胚胎干细胞向表皮样细胞的分化。结果: 共培养4-5 d后,小鼠胚胎干细胞分化为表皮细胞样的单层细胞,细胞排列紧密,呈多边形,免疫组织化学染色显示,大部分细胞呈现β₁整合素阳性,少数细胞呈角蛋白19和角蛋白15阳性,未见套膜蛋白阳性细胞,对照组大部分细胞死亡,存活细胞形态各异,未见β₁整合素、角蛋白19/15和套膜蛋白免疫组化染色阳性细胞。结论: 人羊膜分泌的可溶性物质可能对小鼠胚胎干细胞向表皮样细胞分化起重要作用。     

Tissue-engineered skin preserving the potential of epithelial cells to differentiate into hair after grafting

The aim of this study was to evaluate whether tissue-engineered skin produced in vitro was able to sustain growth of hair follicles in vitro and after grafting. Different tissues were designed. Dissociated newborn mouse keratinocytes or newborn mouse hair buds (HBs) were added onto dermal constructs consisting of a tissue-engineered cell-derived matrix elaborated from either newborn mouse or adult human fibroblasts cultured with ascorbic acid. After 7-21 days of maturation at the air-liquid interface, no hair was noticed in vitro. Epidermal differentiation was observed in all tissue-engineered skin. However, human fibroblast-derived tissue-engineered dermis (hD) promoted a thicker epidermis than mouse fibroblast-derived tissue-engineered dermis (mD). In association with mD, HBs developed epithelial cyst-like inclusions presenting outer root sheath-like attributes. In contrast, epidermoid cyst-like inclusions lined by a stratified squamous epithelium were present in tissues composed of HBs and hD. After grafting, pilo-sebaceous units formed and hair grew in skin elaborated from HBs cultured 10-26 days submerged in culture medium in association with mD. However, the number of normal hair follicles decreased with longer culture time. This hair-forming capacity after grafting was not observed in tissues composed of hD overlaid with HBs. These results demonstrate that epithelial stem cells can be kept in vitro in a permissive tissue-engineered dermal environment without losing their potential to induce hair growth after grafting.     

Participation of adult mouse bone marrow cells in reconstitution of skin

Results of recent studies have indicated that bone marrow cells can differentiate into various cells of ectodermal, mesodermal, and endodermal origins when transplanted into the body. However, the problems associated with those experiments such as the long latent period, rareness of the event, and difficulty in controlling the processes have hampered detailed mechanistic studies. In the present study, we examined the potency of mouse bone marrow cells to differentiate into cells comprising skin tissues using a skin reconstitution assay. Bone marrow cells from adult green fluorescent protein (GFP)-transgenic mice were transplanted in a mixture of embryonic mouse skin cells (17.5 days post-coitus) onto skin defects made on the backs of nude mice. Within 3 weeks, fully differentiated skin with hair was reconstituted. GFP-positive cells were found in the epidermis, hair follicles, sebaceous glands, and dermis. The localization and morphology of the cells, results of immunohistochemistry, and results of specific staining confirmed that the bone marrow cells had differentiated into epidermal keratinocytes, sebaceous gland cells, follicular epithelial cells, dendritic cells, and endothelial cells under the present conditions. These results indicate that this system is suitable for molecular and cellular mechanistic studies on differentiation of stem cells to various epidermal and dermal cells.