大鼠骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的:分离培养和鉴定大鼠骨髓间充质干细胞.方法:分离SD青年大鼠股骨,L-DMEM冲洗骨髓腔,制备细胞悬液接种培养,消化传代纯化细胞.传代的骨髓间充质干细胞进行增殖曲线、克隆形成能力测定,用免疫组化检测增殖细胞vimentin、laminin的表达.结果:传代的细胞在培养第1～2天为潜伏期,第3～6天是细胞快速增殖期,第6天达高峰,第 9天后速度减慢,进入平台期,并且随传代次数的增加,细胞增殖速度逐渐下降.随传代次数增多,克隆形成能力逐渐下降.第5代以后细胞基本纯化为骨髓间充质干细胞,细胞呈长梭形.免疫组化检测增殖细胞vimentin表达阳性、laminin表达阴性.结论:本实验方法能有效扩增大鼠骨髓间充质干细胞,而且简单易行.     

吞噬细胞吞噬作用实验方法的改进

目的探讨和改进实验方法,以便更清晰、有效地观察吞噬细胞对外来异物的吞噬作用。方法小吞噬试验是用金黄色葡萄球菌感染昆明小鼠、大吞噬试验是将鸡红细胞注入Hartly豚鼠体内,然后取鼠腹腔液涂片、甲醇固定,分别用瑞氏染色法和瑞氏-姬姆萨染色法进行染色,镜下观察吞噬细胞对外来异物的吞噬作用。结果瑞氏-姬姆萨染色法制作的标本比瑞氏染色法制作的标本显微镜下观察吞噬细胞的形态结构更清晰,能更好地显示出不同种类的细胞及细胞的不同成分的色彩特征,可以更快、更有效地分辨各类细胞的细胞核、细胞浆和被吞噬的外来异物。结论采用瑞氏-姬姆萨染色法制作的吞噬作用实验标本在镜下形态结构清晰、色彩特征明显,易于分辨细胞成分和外来异物的种类,便于学生观察和计数,有助于学生对吞噬细胞吞噬作用的理解和掌握。     

霍乱毒素及妊娠对金黄地鼠视网膜节细胞再生的作用

目的:观察霍乱毒素(CTx)及妊娠对成年金黄地鼠视神经扎断后视网膜节细胞(RGCs)轴突再生的促进作用.方法:确定成年金黄地鼠交配3d后,扎断视神经(ON)近端,玻璃体内注射CTx.动物随机分为实验组和对照组:对照组为单纯扎断ON为损伤组、损伤PBS组;实验组分为CTx组与妊娠后扎断ON妊娠损伤组与妊娠CTx组.术后动物存活3周.用荧光金逆行标记再生的视网膜节细胞( RGCs),在荧光镜下观察视网膜平铺片再生RGCs的数量变化,并比较实验组各组再生RGCs的周长.结果:CTx组、妊娠损伤组、妊娠CTx组视网膜再生RGCs平均数比损伤组及PBS组增加,差异具有统计学意义.妊娠CTx组比CTx组、妊娠损伤组视网膜再生RGCs平均数增加.实验组各组再生的RGCs周长相比差异无统计学意义.结论:妊娠及玻璃体注入CTx具有促进视神经扎断后视网膜节细胞轴突再生的作用,两者有协同作用,各组再生的RGCs大小无明显差别.     

糖基化终产物受体介导高血压机械牵张力协同促进糖基化终产物激活小鼠血管平滑肌细胞ERK1/2加速血管重构

目的为证实糖基化终产物受体(RAGE)是否介导了机械牵张力和/或糖基化终产物(AGE)对小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的协同激活并加速血管重构。方法①正常血糖小鼠下腔静脉分别连接到正常血糖小鼠和STZ诱导的糖尿病小鼠右颈总动脉形成静脉桥,术后不同时间点(0、4、8周)收获移植静脉作常规切片HE染色,观察移植静脉在动脉压力作用下的血管构筑情况。②体外静息培养的血管平滑肌细胞分别给予机械牵张力和/或糖基化终产物刺激,用Western Blotting法检测细胞内ERK1/2磷酸化水平。③糖基化终产物受体基因沉默(siRNA-RAGE)或过表达(overexpression-RAGE)预处理VSMC后给予机械牵张力和/或糖基化终产物刺激,观察ERK1/2活性的变化。结果高血压(动脉压)可明显改变移植静脉的血管构筑,但移植到高血糖组的比正常血糖组的血管构筑改变更加明显(术后4周和术后8周高血糖组与正常血糖组移植血管厚度分别为73.99±4.45μm比49.67±11.62μm和117.06±17.62μm比88.97±15.78μm,P均<0.05)。机械牵张力和糖基化终产物...     

碱性成纤维细胞生长因子对大鼠骨髓间质干细胞增殖的影响

[目的] 研究碱性成纤维细胞生长因子( bFGF)对大鼠骨髓基质干细胞( MSC)增殖的影响.[方法] 用α- MEM冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞悬液,接种在塑料培养瓶中,经体外扩增、纯化,观察其生长特性,用免疫组织化学 SABC法检测波形蛋白和纤粘连蛋白的表达,并研究不同浓度 bFGF对 MSC生长曲线和克隆形成率的影响.[结果] 原代培养时形成由基质干细胞组成的细胞集落,细胞集落 14 d时接近融合,传代后细胞体积变大,约 5～ 7 d传代 1次;免疫组化显示 MSC呈波形蛋白阳性,而纤粘连蛋白阴性.浓度 10 ng/mL和 20 ng/mL bFGF组的 MSC的细胞数和克隆形成率比 5 ng/mL bFGF组和对照组(无 bFGF)明显增加,具有高度显著性( P< 0.01).[结论] bFGF可明显促进 MSC的增殖.     

骨髓间充质干细胞在受伤大鼠玻璃体内可分化为神经样细胞

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCes)在受损大鼠玻璃体内分化。方法分离SD青年大鼠股骨,L鄄DMEM冲洗骨髓腔,制备细胞悬液接种培养,消化传代纯化MSCs。切断SD大鼠视神经,其近残端缝接一段自体坐骨神经,经玻璃体注射标记的MSCs。动物存活4周,免疫组化检测存活MSCs在玻璃体内是否表达波形蛋白(Vimentin)、NF、GFAP和层黏连蛋白(Laminin)。结果在受损大鼠玻璃体内存活的MSCs表达Vimentin、NF和GFAP,Laminin无表达,NF和GFAP表达率分别为6.0%±3.4%和10.0%±3.1%。结论MSCs移植受损大鼠玻璃体内,存活细胞大部分没有分化,小部分可分化为神经元样细胞和星形胶质样细胞。     

NOD/SCID孕鼠淋巴细胞表型检测和NK细胞活性分析

目的观察NOD/SCID小鼠免疫状况和生育力特征,并分析NK细胞亚群对同基因交配组合NOD/SCID×NOD/SCID妊娠结局的影响。方法采用流式细胞术对未孕和孕13.5 d的NOD/SCID小鼠进行淋巴细胞表型分析,并系统地观察和比较NOD/SCID×NOD/SCID和BALB/c×BALB/c小鼠的生育力特征。分别采用多聚次黄苷酸-胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,poly I∶C)或抗asialoGM1单抗(anti-asialo GM1)刺激或抑制NK细胞活性,并分别观察这些因素对妊娠结局的影响。结果与对照组NOD/SCID小鼠相比,poly I∶C处理组NOD/SCID×NOD/SCID小鼠平均每窝产仔数增多,而注射抗asialo GM1单抗则使胚胎吸收率增高,进而平均每窝产仔数显著减少。结论在NOD/SCID小鼠孕期母-胎界面保持适当水平的NK细胞活性对妊娠结局有利。     

ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构建组织工程皮肤的体内分化

目的以ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞与类真皮构建组织工程皮肤,探讨其在体内的分化。方法胎鼠皮肤成纤维细胞和大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs),分别与复合凝胶-明胶海绵构建类真皮(类真皮Ⅰ、Ⅱ),植入小鼠全层皮肤缺损创面,以生物膜为载体,把羊膜诱导后带有核标记的表皮干细胞覆盖在类真皮上,术后1～8周连续取材,苏木精-伊红染色,β1整合素、CK15、CK19、CK10和CEA免疫荧光双标和免疫组化观察。结果两组组织工程皮肤植入皮肤缺损3～4周后,创面完全长合,较厚新生皮完全覆盖创面,基底层细胞增生,形成短的细胞柱突向真皮层。新生表皮中可见核标记的细胞呈β1整合素、CK15、CK19阳性,真皮中的管腔样结构呈核荧光和CEA免疫组化双标阳性,4～8周新生表皮基底层细胞呈CK19、CK10阳性,新生表皮下可见毛囊样、皮脂腺样结构。结论ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞与类真皮构建的两种组织工程皮肤在体内具有修复缺损皮肤及分化为表皮及毛囊样、皮脂腺样和汗腺样等皮肤附属结构的潜能。     

ES细胞源表皮样干细胞与胶原海绵体外构建组织工程化皮肤

 【目的】 探讨以ES细胞源表皮样干细胞构建组织工程皮肤的方法，为构建新的组织工程皮肤奠定基础。【方法】 先把成纤维细胞放置于胶原海绵真皮支架内，体外培养2d，再放置ES细胞源表皮样干细胞，体外培养3d，观察其形态和进行免疫组化检测。【结果】 成纤维细胞与ES细胞源表皮样干细胞均在真皮支架内黏附，免疫组化表明ES细胞源表皮样干细胞仍呈Bl整合素强阳性和CK15、CK19阳性。【结论】 结果提示ES细胞源表皮样干细胞在体外构建的组织工程化皮肤内仍维持未分化状态。