宋内氏志贺氏菌（Ipa~＋，Oag~－）菌株的构建及表达

直接用转化方法将质粒ｐＨＳ４１０８转入宋内氏Ⅱ相菌Ｓ１Ｒ（ｌｐａ－，Ｏａｇ－），构建了菌株Ｓ１Ｒ１０１／ｐＨＳ４１０８。该菌株能表达侵袭性外膜多肽ａ，ｂ，ｃ，ｄ，无Ｏ抗原。本实验又将质粒ｐＨＳ４１０８中的１２．５ｋｂＳａｌⅠ片段克隆到质粒ｐＢＲ３２２上，构建质粒ｐＪＭ５６，并把它转入Ｓ１Ｒ株内所得的重组菌Ｓ１Ｒ１０２／ｐＪＭ５６能表达多肽ａ，ｃ，ｄ，但不表达多肽ｂ。     

痢疾菌侵袭性质粒抗原（Ipa）及O抗原与侵入细胞能力的…

采用痢疾菌Ｉｐａ＾＋Ｏａｇ＾－，Ｉｐａ＾－Ｏａｇ＾＋及Ｉｐａ＾＋Ｏａｇ＾＋等三种不同的菌株分别进行了毒力及毒力相关表型实验。结果发现，Ｉｐａ＾＋ＯａＧ＾－株Ｓ１Ｒ１０１／ｐＨＳ４１０８与Ｉｐａ＾＋Ｏａｇ＾＋株ＢＳ１６９／ｐＨＳ４１０８都有侵入ＨｅｌＡ细胞的能力，而Ｉｐａ＾－Ｏａｇ＾＋株Ｔ３２则无侵入ＨｅＬａ细胞的能力，只表达多肽ａ、ｃ、ｄ的菌株Ｓ１Ｒ１０２／ｐＪＭ５６亦不能侵入ＨｅＬａ细胞。从而证     

痢疾菌侵袭性质粒抗原（Ipa）及O抗原与侵入细胞能力的关系研究

采用痢疾菌Ｉｐａ＋Ｏａｇ－，ＩｐａＯａｇ＋及Ｉｐａ＋Ｏａｇ＋等三种不同的菌株分别进行了毒力及毒力相关表型实验。结果发现，Ｉｐａ＋ＯａＧ－株Ｓ１Ｒ１０１／ｐＨＳ４１０８与Ｉｐａ＋Ｏａｇ＋株ＢＳ１６９／ｐＨＳ４１０８都有侵入ＨｅＬａ细胞的能力，而Ｉｐａ－Ｏａｇ＋株Ｔ３２则无侵入ＨｅＬａ细胞的能力，只表达多肽ａ、ｅ、ｄ的菌株Ｓ１Ｒ１０２／ｐＪＭ５６亦不能侵入ＨｅＬａ细胞。从而证明，侵袭性质粒抗原（Ｉｐａ）对于细菌侵入ＨｅＬａ细胞则是足够的，其中多肽ｂ起关键性作用，而Ｏ抗原并不参与侵入过程或不成为其必要的前提条件。     

E—选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定，将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入一以天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ＾－１４３细胞，用     

分泌抗p185合成多肽McAb杂交瘤细胞系的建立

用多肽固相合成仪合成人癌基因产物ｐ１８５ＨＥＲ－２（即ｐ１８５）胞内区的肽段，以之与沙门氏裸菌偶联制成免疫原，经脾内、腹腔、静脉途径免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，获得具有高抗体活性的脾细胞，后者与ＳＰ２／０融合，筛选出５株杂交瘤细胞系并对其分泌的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）特性进行了初步分析，ＥＬＩＳＡ检测腹水效价为１０－４～１０－６，用多肽和沙门氏裸菌分别进行中和试验，多肽抑制率在５０％以上，而沙门氏裸菌则不能中和抗体反应。测定其中两株ＭｃＡｂ亲和常数（Ｋａ）分别为２．５×１０７Ｍ－１，５．０×１０８Ｍ－１。表位分析结果表明这两株ＭｃＡｂ针对同一抗原表位     

恶性疟原虫疫苗研究VIPfCMR基因与人白细胞介素-2基因的连接与克隆

用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ将恶性疟原虫复合抗原基因ＰｆＣＭＲ从质粒ｐＷＲ４５０－１／ＰｆＣＭＲ中切下，插入质粒ｐＢＶ２２０／ＩＬ－２中人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因的ＥｃｏＲＩ位点。重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，通过ＰＣＲ扩增和酶切鉴定，筛选出正向插入的重组载体ｐＢＶ２２０／ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２。为表达ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２融合蛋白打下基础。     

以Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统表达人FGF-9

目的：在Ｂａｃｍｉｄ－杆状病毒－昆虫细胞系统中表达人ＦＧＦ－９。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,自新鲜人脑胶质瘤组织获取人ＦＧＦ－９全编码区ｃＤＮＡ,将其克隆入ｐＣＲ＾ＴＭⅡ质粒及ｐＹＥＸ４Ｔ－１真核表达质粒,经ＤＮＡ自动测序仪进行ＤＮＡ序列测定。将人ＦＧＦ－９ｃＤＮＡ定向克隆入ｐＦａｓｔＢａｃ质粒,进一步将其转座入Ｂａｃｍｉｄ中,在昆虫细胞Ｓｆ９中进行表达,采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对表达产物进行分析。     

应用S基因转染的Sp2/0细胞作为靶细胞研究HBV基因疫苗的细胞免疫应答

构建编码ＨＢｓＡｇ 蛋白的重组真核表达质粒ｐＣＲ３－１Ｓ作为ＨＢＶ 基因疫苗, 免疫接种Ｂａ１ｂ／ｃ 小鼠。以重组质粒ｐＣＲ３－１Ｓ转染的Ｓｐ２／０ 细胞作为靶细胞, 采用５１Ｃｒ ４ｈ 释放法, 体外检测免疫小鼠的淋巴细胞杀伤功能。结果显示, 与空载体对照组相比较, ＨＢＶ基因疫苗可诱导Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠产生ＨＢＶ 特异性细胞毒性Ｔ 细胞应答（ Ｐ＞ ０－０５） , 提示以Ｓｐ２／０ 基因转染的细胞作为靶细胞, 检测免疫Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠淋巴细胞的杀伤功能是可靠的。     

E－选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ－选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了重组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定。将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入到天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位点，构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和ＡＰＡＭ检测，重组痘苗病毒能有效地表达人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ。     

神经肽Y基因在COS—7细胞中的表达

构建大鼠ＮＰＹ基因的瞬时表达载体ｐＳＶＬ－ＮＰＹ，以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ＾ＴＭ介导将其导入ＣＯＳ－７细胞中，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和ＨＰＬＣ检测结果：ｐＳＶＬ－ＮＰＹ质粒转染的ＣＯＳ－７细胞可表达ＮＰＹ ｍＲＮＡ及成熟肽ＮＰＹ。     

中国钩端螺旋体强毒株017膜蛋白基因的质粒载体构建及表达

目的构建表达我国钩体强毒赖型０１７株外膜蛋白的重组质粒。方法用ＰＣＲ方法扩增并回收０１７株钩体外膜蛋白基因片段ＯｍｐＬ１,将其与质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ重组,通过菌落颜色和酶谱分析筛选出重组质粒。然后从该重组质粒切下ＯｍｐＬ１基因片段,重新克隆至质粒ｐＢＶ２２０中,酶谱分析和ＤＮＡ杂交鉴定出正向重组质粒。将含有正向重组质粒的宿主菌诱导表达生长后,提取全菌总蛋白进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。结果筛选出４个与ｐＢＶ２２０正向重组的质粒,其中一株带重组质粒ｐＢＬＭ１的菌株表达了一相对分子质量为３３．５×１０３的新蛋白。结论重组质粒ｐＢＬＭ１的构建和表达成功说明扩增得的ＯｍｐＬ１基因具有完整的阅读框架,并使简便获得大量天然的０１７株钩体ＯｍｐＬ１蛋白成为可能,为新型钩体疫苗的研究奠定了基础     

抗远缘链球菌OMZ176表面蛋白抗原（220kD）单克隆抗体的制备

采用远缘链球菌ＯＭＺ１７６（ｄ血清型）全菌细胞作抗原，通过免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选及亚克隆，最终获得抗远缘链球菌ＯＭＺ１７６表面蛋白抗原（２２０ｋＤ）的单克隆抗体（Ｗｃ３Ａ６）。结果表明：ＭｃＡｂ的Ｉｇ及亚类鉴定为ＩｇＧ２ａ，ＥＬＩＳＡ效价１：８０００，Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂ１－ｏｔｉｎｇ鉴定可见ＭｃＡｂ与２２０ｋＤ蛋白抗原发生特异性结合。与变形链球菌ＭＴ６Ｒ（Ｃ血清型）有弱的     

中国版纳猪MHCI类P1分子全长的原核表达与纯化

目的：获得原核表达的中国版纳猪ＳＬＡＩ类Ｐ１蛋白质分子。方法：ＰＣＲ扩增去信号肽的ＳＬＡＩ类Ｐ１ｃＤＮＡ序列，亚克隆至ｐＧＥＭＴ载体，测序。将亚克隆的Ｐ１　ｃＤＮＡ片段插入表达载体ｐＥＴ４２ｂ（＋），构建重组表达质粒ｐＥＴ－４２ｂ（＋）／ｓｌａ－ｐｌ，转化Ｅ·ｃｏｌｉ表达菌 ＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）－ＲＩＬ，ＩＰＴＧ诱导 Ｐ１－８ ｘ ｈｉｓ融合蛋白表达，经包涵体洗涤，８ ｍｏｌ／Ｌ尿素变性溶解，Ｎｉ２＋亲和层析，梯度透析后，定量保存。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定目的蛋白的表达与纯化。结果：目的蛋白（分子量３９．５ ｋＤ）表达量占细菌总蛋白 １５％，每升表达菌获得纯度９５％的目的蛋白 ４０ ｍｇ～６０ｍｇ。结论：成功建立猪 ＳＬＡ分子全长原核表达、纯化体系，为建立间接识别猪移植抗原ＳＬＡＩ类分子的人Ｔ细胞系及表位分析打下基础。     

应用S基因转染的Sp2／0细胞作为靶细胞研究HBV基因疫？…

构建编码ＨＢｓＡｇ蛋白的重组真核表达质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ作为ＨＢＶ基因疫苗,免疫接种Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,以重组质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ转染的Ｓｐ２／０细胞作为靶细胞,采用＾５１Ｃｒ ４ｈ释放法,体外检测免疫小鼠的淋巴细胞杀伤功能。结果显示,与空载体对照组相比较,ＨＢＶ基因疫苗可诱导Ｂａｌｂ／ｃ小鼠产生ＨＢＶ特生细胞毒性Ｔ细胞应答,提示以Ｓｐ２／０基因转染的细胞作为靶细胞,检测免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠淋巴细胞     

人细胞间粘附分子1基因功能区Ⅰ,Ⅱ的克隆及高效表达

用ＰＣＲ聚合酶链反应技术从人细胞间粘附分子１（ＩＣＡＭ－１）ｃＤＮＡ中获取了其编码细胞外氨基端功能区Ⅰ、Ⅱ１８５个氨基酸的ＤＮＡ序列，构建了重组质粒ｐＥＴ／ｒｓＩＣＡＭ－１。经转化宿主菌，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，薄层扫描和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ，证明目的基因在大肠杆菌中获得了高效表达。     

HSV—1 SM44株糖蛋白D基因真核表达载体的构建及其免？…

目的 构建ＨＳＶ－１型ＳＭ４４株糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因的真核表达载体,并用此重组质粒直接免疫小鼠,探讨ＨＳＶ－１ ｇＤ基因作为基因疫苗的可能性。方法 从ＨＳＶ－１基因组中扩增ｇＤ的全编码基因,克隆入载体ｐＵＣ１９中,测序鉴定后转入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）。所得重组质粒ｐｃＤ－ＮＡ－ｇＤ以电穿孔法转染ＣＨＯ细胞,并以荧光染色法鉴定表达效果。用ｐｃＤＮＡ－ｇＤ免疫小鼠,ＥＬＩＳＡ法检测基因免疫     

抗远缘链或菌OMZ176表面蛋白抗原（220kD）单克隆抗体的制备

采用远缘链球菌ＯＭＺ１７６（ｄ血清型）全菌细胞作抗原，通过免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选及亚克隆，最终获得抗远缘链球菌ＯＭＺ１７６表面蛋白抗原（２２０ｋＤ）的单克隆抗体（ＷＣ３Ａ６）。结果表明：ＭｃＡｂ的Ｉｇ及亚类鉴定为ＪｇＧ２ａ，ＥＬＩＳＡ效价１：８０００，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ鉴定可见ＭｃＡｂ与２２０ｋＤ蛋白抗原发生特异性结合。与变形链球菌ＭＴ６Ｒ（Ｃ血清型）有弱的交叉反应（ＯＤ值＝０．２３）。     

细胞性一氧化氮供体的建立及其对肿瘤细胞凋亡的诱 …

一氧化氮供体细胞系的建立及其对肿瘤细胞凋亡的诱导效应研究。方法采用＾３Ｈ－胍氨酸转移法进行了ＮＯ合成酶活性测定，亚硝酸盐检测；ＤＮＡ片段的提取及凝胶电泳分析；凋亡细胞的ＤＡＰ１染色观察；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果将ｉＮＯＳ真核表达质粒，ｐＣＭＶ／ｉＭＯＳ转染至Ｓｐ２／０骨髓瘤的变异株中，并获得能稳定表达ｉＮＯＳ和合成ＮＯＲ 重组细胞系，表达ｉＮＯＳ的效率为每升培养物含４００μｇ蛋白。     

B群脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白抗原性分析

挑选了１０株具有代表性的菌株，提取了它们的外膜蛋白（ＯＭＰｓ），ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析发现：１０株菌的ＯＭＰｓ带谱不完全相同，但都含有１，２／３，４和５类外膜蛋白，而且纯化的１类外膜蛋白（ＯＭＰ１）显示一条分子量为（４１或４３）×１０＾３的蛋白带。从中选两株菌５４２８５２（Ｂ：ＮＴ：Ｐ１．２：Ｌ３，７，９：克隆Ｉ：ＲＦＬＰ－ｂ２０）和３４０７（Ｂ：１５：Ｐ１．２：Ｌ３，７，９，克隆群Ｉ：ＲＦＬＰ－ｂ     

单核细胞趋化蛋白—1在大肠杆菌中的表达

将人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ插入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１中，构建成质粒ｐＧＥＸ／ＭＣＰ转化大肠杆菌ＪＭ１０９，经ＩＰＴＧ诱导后合成ＧＳＴ－ＭＣＰ－１融合蛋白。用１２％ＳＣＳ－ＰＡＧＥ检测在３０ｋＤ左右有新生蛋白条带出现，表达量约占菌体总蛋白的３１．７％，趋化实验证明，该产物具备明确的单核细胞趋化活性。