小鼠MIP-1α-DT390重组免疫毒素原核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠MIP-1α基因和白喉杆菌外毒素DT390基因的原核融合表达载体,诱导并鉴定该蛋白的表达.方法 通过RT-PCR获得mMIP-1α基因,通过PCR扩增质粒SPα-DT390获得DT390基因,酶切、连接,构建原核表达载体pET-32a( )-mMIP1-1α-DT390,重组质粒证实构建成功后,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导融合蛋白表达,并用SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法鉴定.结果 成功构建了mMIP-lα与DT390基因的原核融合表达载体pET-32a( )-mMIP-Iα-DT390,重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达,表达蛋白的相对分子质量与预期值一致,并可被抗mMIP-1α和抗白喉毒素的特异性抗体所识别.结论 获得了mM皿1α与DT390融合基因在原核系统中的稳定表达,为研究其临床应用奠定了基础.     

人源His-talin1原核表达载体的构建及其蛋白表达

目的克隆人源talin1 cDNA,构建其高效原核表达载体,并纯化得到高纯度His-talin1融合蛋白。方法 PCR法扩增talin1基因并连接到原核表达载体pET32a(+),筛选和测序鉴定阳性克隆。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经过IPTG诱导表达和亲和层析分离纯化表达产物,对纯化的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果成功扩增了2.4kb的talin1基因,构建了pET32a(+)-talin1重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达出His-talin1融合蛋白。经SDS-PAGE和Western blot方法 ,验证了高纯度纯化的融合蛋白。结论建立了高效稳定的His-talin1表达体系,为进一步研究Talin1蛋白的结构及其与P-selectin之间的关系打下基础。     

人IκBα基因原核表达质粒的构建及TrxA/IκBα融合蛋白的制备

目的利用基因重组技术构建人IκBα基因原核表达质粒,制备TrxA/IκBα融合蛋白,以便进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体. 方法以重组质粒pGEM-T-IκBα为模板,利用PCR方法扩增出带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的人IκBα基因cDNA,经相应酶切后插入原核表达载体pET-32a(+).重组表达质粒pET32a(+)-IκBα转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达TrxA/IκBα融合蛋白.Western blot试验鉴定表达蛋白.超声波破菌后采用Ni-NTA树脂对TrxA/IκBα融合蛋白进行纯化. 结果酶切鉴定证实人IκBα基因cDNA已插入原核表达载体pET-32a(+).重组表达质粒pET32a(+)-IκBα在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达了TrxA/IκBα融合蛋白,其相对分子质量(Mr)约为56×103,表达量约占细菌总蛋白的25%.Western blot试验显示TrxA/IκBα融合蛋白与兔抗IκBα多克隆抗体呈特异性免疫反应.经Ni-NTA树脂纯化后,TrxA/IκBα融合蛋白的纯度可高达95%以上. 结论人IκBα基因原核表达质粒的构建及TrxA/IκBα融合蛋白的制备为进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体奠定了物质基础.     

新基因MAGE-n表位肽与人HSP70融合基因的构建及表达纯化

目的构建MAGE-n159-167(QLVFGIEVV)表位肽与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因并表达纯化。方法应用PCR方法,将QLVFGIEVV的cDNA序列融合到人HSP70基因的3'端,将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70;采用双酶切(Sac Ⅰ、Hind Ⅲ)及PCR鉴定后测序;转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达,Ni Sepharose6FF亲和填料进行分离纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果。结果经PCR扩增成功获得约2.0kb的目的片段,重组体经Sac Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切分析及PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导、SDS-PAGE分析得到71kD左右的目的蛋白条带。用Ni Sepharose6FF亲和填料分离纯化,获得了纯化的融合蛋白。结论成功构建原核表达载体pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70,并获得纯化的融合蛋白,为基于MAGE-n的肿瘤疫苗研制提供良好的抗原奠定了实验基础。     

植原体免疫主导膜蛋白A的原核表达载体构建、表达及其抗血清制备

目的 构建植原体免疫主导膜蛋白A (IdpA)的原核表达载体,表达并纯化目的蛋白,制备抗血清.方法 以重组克隆质粒pMD18-T-IdpA为模板PCR扩增IdpA基因片段,经酶切连接将IdpA基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),PCR和双酶切进行鉴定.IPTG诱导重组菌表达IdpA蛋白,并进行纯化和鉴定,以纯化获得的IdpA蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并采用ELISA和Western blot法检测抗血清的效价和特异性.结果 成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-IdpA,并在大肠杆菌中能稳定表达IdpA蛋白,经纯化获得了纯度大于90％的高纯度目的蛋白,用纯化的IdpA蛋白免疫BALB/c小鼠,获得了效价高于1:320 000的强特异性抗IdpA蛋白抗血清.结论 成功进行了IdpA的原核表达并制备了抗血清.     

结核分枝杆菌rPstS1-HspX融合蛋白的表达、纯化及其免疫反应性分析

目的 构建结核分枝杆菌rPstS1-hspX (rph)融合基因及其原核表达载体pET-23b(+)-rPstS1-hspX[pET-23b(+)-rph],表达、纯化rPstS1-HspX (rPH)融合蛋白,并分析其免疫反应性.方法 采用基因拼接技术将PstS1和HspX编码基因通过多肽接头(GSGSG)的DNA序列进行连接,构建融合基因rph.将融合基因定向克隆入原核表达载体pET-23b(+),构建重组原核表达质粒pET-23b(+)-rph.将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3) pLysE感受态细胞,IPTG诱导融合蛋白表达.SDS-PAGE和Western印迹法鉴定其表达情况.用镍离子鳌合亲和层析柱纯化融合蛋白,Western印迹法初步评价融合蛋白的免疫反应性.结果 融合基因rph及其原核表达载体pET-23b (+)-rph构建成功.融合蛋白rPH主要以可溶性非包涵体形式表达,相对分子质量为51 000,表达量约占菌体总蛋白的23％.经亲和层析后得到了纯度达92％的融合蛋白.Western印迹证实融合蛋白能与结核病阳性血清发生特异性免疫反应.结论 成功构建了原核表达载体pET-23b(+)-rph,获得了rPH融合蛋白,为rPH融合蛋白在结核病诊断中的应用提供了依据.     

结核分枝杆菌调节蛋白RelA的原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆编码结核分枝杆菌调节基因RelA并在大肠杆菌中表达,纯化后制备兔抗RelA的抗体。方法:利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增RelA基因,构建重组表达质粒pET-32a(+)-RelA;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行镍离子亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Westem blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性;以表达的RelA蛋白免疫家兔,制备抗RelA的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果:扩增了RelA基因,克隆于表达载体pET-32a(+)中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确。经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)为120 000的目的蛋白;纯化的RelA免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶6 400以上,且具有良好的特异性。结论:已成功构建RelA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗RelA抗体,效价及特异性均良好,为进一步研究RelA蛋白在结核病中的致病机制奠定了基础。     

β-hCG蛋白在大肠杆菌系统的表达、纯化及活性鉴定

目的 获得β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)融合蛋白β-hCG/GST并验证其抗原活性.方法 利用PCR法扩增β-hCG全长基因,将其克隆至原核表达载体pET-42a中,构建重组质粒pET-42a-β-hCG,将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,亲和层析法纯化融合蛋白,目的蛋白用Western blot法鉴定,ELISA检测纯化得到的融合蛋白的抗原活性.结果 测序结果证实成功扩增出目的基因β-hCG;酶切和测序结果证实pET-42a-β-hCG原核表达载体构建成功;转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;Western blot法及ELISA检测证实纯化后的β-hCG/GST融合蛋白具有良好的免疫原性.结论 成功获得β-hCG/GST融合蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,为以β-hCG为靶位的抗肿瘤主动免疫治疗研究奠定了基础.     

人类新基因CTRP4的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建新基因CTRP4的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化rhCTRP4-his蛋白,制备和鉴定小鼠抗人CTRP4多克隆抗体,为进一步研究人类新基因CTRP4的生物学功能奠定基础。方法:从pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组载体中通过PCR的方法扩增CTRP4基因ORF中不含信号肽的目的基因片段,将得到的片段双酶切定向插入pET-32a中,构建原核表达载体pET-32a-hCTRP4。构建好的质粒在E.coli BL21(DE3)中进行诱导、表达,通过镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组质粒和纯化好的融合蛋白依次免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。并对抗体进行纯化、效价测定以及特异性鉴定。结果:DNA测序证实构建的pET-32a-hCTRP4重组表达载体含有hCTRP4编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中表达相对分子质量(Mr)为35 000的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯度为95%以上。ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Westernblot、免疫荧光细胞化学和免疫组化分析显示抗体能特异性识别重组hCTRP4以及天然状态hCTRP4蛋白。结论:成功构建了hCTRP4蛋白的原核表达载体,并获得较高纯度的融合蛋白,制备了高效价、高特异性的多克隆抗体。     

肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人HSP70融合基因的构建及原核表达

目的:构建及原核表达肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因.方法:采用加端PCR方法,将EPVTKAEML的基因序列融合到人HSP70基因的3′端;将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a( )中,构建重组质粒pET-28a( )/EPVTKAEML-HSP70.经限制性内切酶BamH I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE检测表达结果.结果:应用加端PCR方法扩增出约2.0 kb的目的片段,序列测定结果证实,EPVTKAEML的基因序列成功地融合到人HSP70基因的3′端.经BamH I、Xho I酶切鉴定证实,融合基因成功地克隆到原核表达载体pET-28a( )上;转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析发现在相对分子质量(Mr)约72 000处有表达量明显增多的蛋白条带.结论:成功地构建并表达了肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人HSP70的融合基因.     

肾癌相关抗原G250的原核表达、纯化及抗原活性检测

目的 构建原核表达质粒pET-42a-hG250,表达并纯化肾癌相关抗原G250融合蛋白,并检测G250融合蛋白的抗原活性.方法 利用PCR从pGEM-T-G250质粒中扩增G250基因片段(112～1242 bp),测序正确后将其克隆至原核表达载体pET-42a中构建重组载体pET-42a-hG250.将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,通过IPTG诱导G250蛋白的原核表达,随后将表达的融合蛋白进行纯化.经SDS-PAGE分析后,Western blot法检测纯化的蛋白,将纯化蛋白进一步包板后用ELISA对其抗原活性进行评价.结果 酶切和测序结果证实pET-42a-hG250原核表达载体构建成功;转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的G250融合蛋白;Western b1ot法和ELISA检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应,显示纯化后的G250融合蛋白具有良好的免疫原性.结论 成功构建了肾癌相关抗原G250基因的原核表达载体,纯化获得了G250融合蛋白,该蛋白具有良好的抗原活性.     

人脂联素球状结构域基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建人脂联素球状结构域(gAd)基因的原核表达载体PET-28a(+)-gAd,诱导表达并纯化重组gAd蛋白,制备多克隆抗体。方法:以人基因组为模板,用PCR方法扩增人脂联素球状结构域(gAd)基因,构建原核表达载体PET-28a(+)-gAd,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经SDS-PAGE,免疫印迹法检测并鉴定表达产物,表达的目的蛋白用镍亲和层析柱纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果:原核表达载体PET-28a(+)-gAd转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,获得gAd重组蛋白,免疫印迹证实能与抗his标签检测抗体结合,制备的多克隆抗体经间接ELISA法测得效价为1∶32 000。免疫印迹证实,抗血清不仅能特异性地识别gAd蛋白,还能识别脂联素蛋白,而不与非特异性蛋白结合。结论:成功构建原核表达载体PET-28a(+)-gAd,并表达、纯化重组蛋白gAd,制备的多克隆抗体特异性好,效价较高,为进一步的研究奠定了基础。     

抗HIV-1 gp120单链抗体和白喉毒素融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 构建人源抗HIV-1单链抗体和白喉毒素融合基因的原核表达质粒,并诱导其在大肠杆菌中表达重组蛋白.方法通过PCR扩增,获得目前应用较多的DAB389基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot方法分析鉴定.结果酶切及DNA序列测定鉴定正确.SDS-PAGE和Western Blot分析证实,重组质粒可表达出相对分子质量为75 200的蛋白,与DT-hs120融合基因子量一致,其表达量约占菌体总蛋白的21%,表达形式主要为包涵体.结论 成功构建了DT-hS120表达载体,并获得了高效表达.     

MAGE-D4a融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建肿瘤相关抗原MAGE-D4a的原核重组体系,表达、纯化融合蛋白。方法:PCR法从胶质瘤组织cDNA中扩增MAGE-D4a基因全长编码区,连接入原核表达载体pMAL-c2,筛选、鉴定阳性克隆并测序。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导表达,表达产物经AmyloseResin亲和层析分离纯化,并且对纯化的融合蛋白进行质谱鉴定。结果:成功扩增了MAGE-D4a基因;重组质粒在Rosetta大肠杆菌中诱导表达出MBP/MAGE-D4a融合蛋白;优化了MAGE-D4a原核表达体系的最适条件;蛋白质谱分析结果显示表达的基因重组蛋白与目的蛋白相符。结论:获得了高效表达、可溶性的MAGE-D4a重组蛋白,为抗体的制备及血清学分析奠定了基础。     

宫颈癌相关BLCAP基因的原核表达及条件优化

目的利用大肠埃希菌表达系统表达宫颈癌相关BLCAP基因,并优化表达条件。方法利用PCR技术从逆转录病毒重组载体pL(BLCAP)SN中扩增宫颈癌相关BLCAP基因,将其插入到原核表达载体pET-32(a)中,从而构建原核表达重组质粒pET-32(a)-BLCAP,随后将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,通过IPTG诱导表达并优化表达条件,所表达的带有His标签目的融合蛋白经Ni2 亲和层析纯化回收,并采用SDS-PAGE和Western印迹对目的蛋白进行分析和鉴定。结果构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,含有重组质粒的表达宿主菌经过IPTG诱导表达了分子量约为28ku的融合蛋白,并经优化确定了最佳的诱导表达条件。结论成功构建了pET-32(a)-BLCAP原核表达质粒,表达并经纯化得到了BLCAP目的蛋白,为研究该蛋白的性质及其制备针对该蛋白的抗体奠定了基础。     

大鼠IP-10-PE38KDEL重组免疫毒素原核表达载体的构建及表达

目的 构建大鼠γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)基因和绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL基因的原核融合表达载体,并对其表达进行鉴定.方法 通过PCR获得本实验所需要的IP-10基因片段,通过酶切含有PE38KDEL的质粒PRKL459K获得绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL基因 ,再通过适当的酶切及连接反应,构建IP-10与PE38KDEL融合基因的原核表达载体pET-32a ( )-IP-10-PE38KDEL,重组质粒经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定证实构建成功后, 转化感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western-blotting分析证实其相对分子质量和特异性.结果 酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,IP-10-PE38KDEL融合基因被成功克隆入原核表达载体pET-32a( ),并在大肠杆菌中稳定表达,表达产物的相对分子质量与预期值相符,且所表达蛋白可被抗PE的特异性抗体识别.结论 成功构建了原核表达载体pET-32a( )-IP-10-PE38KDEL,其融合基因在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究其功能奠定了基础.     

人细胞角蛋白8(CK8)基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人细胞角蛋白8(CK8)基因cDNA并在大肠杆菌中表达CK8蛋白产物。方法:运用DNA重组技术,设计CK8基因特异引物,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从人肝细胞癌7721细胞中扩增CK8编码区cDNA,将其插入克隆载体pMD18-T simple vector中,获得重组质粒pMD18-CK8,转化感受态大肠杆菌DH5α。继而采用PCR技术从重组质粒pMD18-CK8中扩增出约1500bp目的片段,再次级克隆到原核表达质粒pET-28a(+)载体中,获得pET-28a-CK8重组原核表达质粒;经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21(DE3)菌株,在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE电泳及Western blot检测CK8蛋白表达水平。结果:成功建立了人CK8基因cDNA重组体的无性繁殖系。②在原核细胞中成功地表达出人CK8蛋白,该蛋白具有很好的免疫原性。结论:运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了人细胞角蛋白8(CK8)基因,为进一步研究CK8的基因型及探讨该基因编码的CK8蛋白的性质和生物学活性创造条件。     

人视黄醇结合蛋白原核蛋白表达和兔多克隆抗体的制备

目的制备兔抗人视黄醇结合蛋白(RBP)多克隆抗体。方法逆转录PCR扩增人RBP基因,将扩增产物连接到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-RBP,转化至大肠杆菌中。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,表达产物经SDS-PAGE分析鉴定出阳性克隆,扩大培养。用组蛋白标签(His-tag)纯化柱纯化重组蛋白。将纯化的重组蛋白皮下注射到新西兰白兔, 4次加强免疫得到抗血清。从抗血清中纯化出抗RBP多克隆抗体,并进行SDS-PAGE、 ELISA和Western blot法鉴定。结果成功构建了重组质粒pET-28a(+)-RBP,并获得高纯度的RBP重组蛋白, ELISA检测结果显示抗体效价达到1∶512 000。结论成功制备兔抗人RBP多克隆抗体。     

乳腺癌特异性转导小肽融合表达载体的构建以及目的蛋白的表达

目的构建乳腺癌特异性转导小肽PI-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白的原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、分离和纯化。方法合成PI的DNA序列,将其定向插入到p EGFPN2中,经双酶切获取PI-EGFP的核苷酸序列,再将其克隆入原核表达质粒pET-28a(+),构建出pET-28a(+)-PI-EGFP的原核表达载体;重组质粒转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导表达,利用His-tag对蛋白进行分离纯化,SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹免疫分析(Western blot)鉴定纯化蛋白质。结果成功构建了pET-28a(+)-PI-EGFP的原核表达载体;其经诱导后,在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白以可溶性形式存在;SDS-PAGE分析显示,在相对分子量约33kD的位置出现目的蛋白条带,与理论值相符;经His TALONTM Cartridge亲和层析纯化获得了高纯度的重组的PI-EGFP融合蛋白,Western blot鉴定结果显示获得了目的蛋白。结论成功构建出乳腺癌特异性转导小肽PI-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白原核表达载体,并能够表达出PI-EGFP的融合蛋白,为进一步研究小肽的乳腺癌特异性转导功能奠定基础。     

结核分枝杆菌毒力分泌基因Rv3872重组卡介苗的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv3872的原核重组表达质粒pET-3872并对其进行表达及鉴定。构建表达结核分枝杆菌抗原蛋白Rv3872即PE35的重组卡介苗。方法:应用PCR技术扩增Rv3872基因,定向克隆入pET32a(+)并转化E.coli BL21(DE3)菌株,测序后用IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE和Western blot对目的蛋白进行检测及鉴定。用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。构建重组穿梭表达质粒pMV-3872,将重组质粒电穿孔进入卡介苗,对重组卡介苗进行诱导表达用SDS-PAGE和Western blot检测和鉴定目的蛋白。结果:表达融合蛋白的pET-3872质粒构建成功,重组蛋白经Western blot检测出特异性阳性信号。重组卡介苗BCG-3872构建成功,热诱导表达后经SDS-PAGE和Western blot,在培养上清中检测到目的蛋白。结论:成功构建了重组质粒pET32a(+),并在大肠杆菌中表达了PE35蛋白,有利于进一步研究Rv3872基因功能。本研究还对表达结核分枝杆菌蛋白PE35的重组卡介苗进行了鉴定,为进一步研究该重组卡介苗的免疫功能奠定了基础。