蛋白质组学检测结直肠腺瘤及早期恶变患者血清的差异蛋白质变化及意义

目的： 通过比较分析结直肠腺瘤及早期恶变患者血清蛋白质的表达差异,寻找结直肠癌早期诊断的血清标记物。方法：建立结直肠腺瘤及腺瘤早期恶变患者血清蛋白双向电泳图谱,比较分析差异蛋白质斑点,切取酶解行MALDI-TOF／TOF质谱分析鉴定。结果：成功建立结直肠腺瘤及早期恶变患者血清蛋白双向电泳图谱,其平均蛋白质点分别为1672±73和1732±46,早期恶变组表达差异大于1.5倍的蛋白质斑点有28个,其中15个下调,13个上升;质谱分析鉴定出23个蛋白质,鉴定率达82.14%;合并重复鉴定的蛋白质,共获得的差异蛋白13种,其中8种为上调蛋白,5种为下调蛋白,分为6类,包括蛋白酶抑制剂、补体系统、免疫球蛋白、角质素、信号转导蛋白及未知蛋白。结论：蛋白质组学技术能灵敏分析结直肠腺瘤及早期恶变患者血清蛋白质的异常改变,本研究鉴定的蛋白质可能成为结直肠癌早期诊断的血清肿瘤标记物。     

脑瘤患者脑脊液肿瘤相关蛋白的蛋白质组学初步研究

通过比较脑肿瘤患者和正常人脑脊液的二维凝胶电泳图谱（two-dimensional electrophoresis，2DE），并对差异蛋白进行质谱鉴定，以寻找肿瘤特异脑脊液蛋白。以脑肿瘤患者和正常人的脑脊液为研究对象，采用固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）2DE分离总蛋白质，凝胶经银染显后，用ImageMaster2D图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质。结果得到肿瘤患者脑脊液蛋白点924个，正常脑组织蛋白点507个，匹配512个，匹配率分别为55．4％和84．3％，去冗余后发现，有35个蛋白点只在脑肿瘤患者脑脊液图谱中出现。肿瘤患者脑脊液和正常对照脑脊液双向电泳图谱有明显差别，但是本实验尚未对这些差异蛋白进行质谱鉴定，所以未找出肿瘤特异蛋白。     

人膝骨关节炎血清生物学标志物的筛选

目的: 比较膝骨关节炎患者与正常人血清蛋白质组的差异,筛选其能用于骨关节炎诊断、治疗或发病机制研究的血清生物学标志物。方法: 利用双向荧光差异凝胶电泳技术比较膝骨关节炎患者血清(4例)与健康志愿者血清(4例)蛋白图谱的差异,使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱及生物信息学相关技术对获得的差异蛋白进行鉴定和初步分析,并用Western blotting进一步验证所鉴定的蛋白。结果: 成功建立了骨关节炎血清差异蛋白质组学的研究方法;通过质谱分析初步鉴定出8个差异蛋白,其中5个蛋白在膝骨关节炎组表达上调,3个蛋白在膝骨关节炎组表达下调。Western blotting进一步验证得到α₂-巨球蛋白在膝骨关节炎组表达上调,与双向荧光胶内差异凝胶电泳技术联合质谱分析的结果一致。结论: 膝骨关节炎患者血清与正常人血清蛋白表达存在明显差异,其中α₂-巨球蛋白可作为骨关节炎潜在的疾病相关生物学标志物进一步研究,为骨关节炎的诊断、治疗和发病机制的研究提供新的线索和实验基础。     

质谱技术分析多发性骨髓瘤患者血清差异蛋白

目的应用双向电泳(2-DE)和质谱技术分析多发性骨髓瘤(MM)患者血清中的差异表达蛋白,寻找MM特异性蛋白标记物。方法收集MM患者5例、其他血液系统恶性肿瘤患者及正常对照者血清各10例,三组样本等体积混合,去除高丰度白蛋白和IgG,应用2-DE分离3组血清样本,凝胶经银染显色和图像数据分析识别差异蛋白质点,以基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对差异蛋白质点进行鉴定。结果通过凝胶软件分析MM与疾病对照组及正常对照组血清2-DE图谱,共得到51个三倍以上差异蛋白点,对上述差异蛋白进行MALDI-TOF-MS质谱分析,共鉴定出22种阳性蛋白,其中13种蛋白表达上调,包括高表达蛋白如丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶RIO1亚型2、Rab相关蛋白Rab37亚型2、HP蛋白、锌指结构α2糖蛋白等;9种蛋白表达下调,包括α2-HS-糖蛋白、转铁蛋白、多聚素-1等。结论 MM组与疾病对照组和正常对照组间存在差异表达的蛋白质,这些差异蛋白有助于MM早期诊断和鉴别诊断,并为MM发病机制的进一步研究提供线索。     

HCV患者外周血单个核细胞蛋白质表达质谱分析

目的:应用比较蛋白质组学的方法分析丙型肝炎患者外周血单个核细胞蛋白质表达模式的变化及寻找丙型肝炎相关生物标记分子,进一步识别鉴定其差异表达蛋白质,分析其对丙型肝炎慢性化机制的意义.方法:应用固相化pH梯度双向凝胶电泳(2-DE)分离健康者(10)及HCV患者(28)PBMC的总蛋白质,凝胶银染显色后,PDQuest图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得差异蛋白点的肽质指纹图谱,通过SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质.结果:得到两张2-DE图谱,HCV患者及健康者PBMC凝胶的蛋白质点数分别为625及614;初步筛选出HCV患者与健康者存在明显差异的12个蛋白点,经质谱分析,初步鉴定了10种蛋白质.这些差异蛋白质包括病毒蛋白、蛋白质合成与分解、三大代谢相关酶类、细胞结构相关蛋白质以及信号转导相关蛋白质.结论:应用2-DE及MALDI-TOF-MS方法建立了HCV患者PBMC双向凝胶电泳图谱,分离并初步鉴定了10种与HCV感染相关的差异表达的蛋白质,为研究HCV慢性化相关机制提供新的线索.     

不同临床类型原发鼻咽癌组织差异表达蛋白

 目的 寻找上行型、下行型和混合型不同临床类型鼻咽癌原发病瘤灶组织中的差异表达蛋白。方法 采用双向凝胶电泳对不同临床类型鼻咽癌患者的鼻咽癌组织和正常人鼻咽组织总蛋白进行分离,对比找出差异表达蛋白质斑点,结合基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析技术和数据库信息检索鉴定差异蛋白点。结果 与正常组比较,混合型鼻咽癌组出现31个差异蛋白质点,其中18个表达上调,13个表达下调;从混合型鼻咽癌组选择10个差异蛋白质斑点进行质谱鉴定,成功鉴定出5个,其中表达上调的有热休克固有蛋白、α1抗胰蛋白酶和巨噬细胞帽蛋白;表达下调的有S100A9蛋白和 蛋白4.1。与下行型鼻咽癌组比较,上行型鼻咽癌组出现31个差异表达蛋白点,其中15个表达上调、16个表达下调;从上行型组选择10个差异蛋白质斑点进行质谱鉴定,成功鉴定出6个,其中表达上调的有线粒体顺乌头酸酶、乙醇脱氢酶、Rab GDP解离抑制因子β;表达下调的有NM23-H1、核氯离子通道蛋白27和乙醛脱氢酶X。结论 不同临床类型鼻咽癌患者肿瘤转移相关蛋白、能量代谢蛋白、解毒蛋白与抗肿瘤转移蛋白表达水平存在差异,这些蛋白可作为临床分型标记物。     

定量蛋白质组学技术构建系统性红斑狼疮疾病的蛋白质组差异表达图谱

目的: 应用定量蛋白质组学技术对系统性红斑狼疮(SLE)病人外周血单个核细胞中的"全组"蛋白进行鉴定和定量分析,获得SLE的蛋白质组差异表达图谱。方法: 利用基于四重相对和绝对定量的等量异位标签结合多维液相色谱-串联质谱分析SLE稳定期和活动期病人以及类风湿关节炎病人和健康人的外周血单个核细胞总蛋白,用肽质量指纹谱经数据库检索鉴定蛋白质,并比较这些蛋白的表达差异。结果: 共鉴定了400多个蛋白质。其中,与健康对照组相比,SLE稳定组和SLE活动组共发现2倍以上表达差异的蛋白质44个,上调的9个,下调的35个;与类风湿关节炎疾病组相比,SLE稳定组和SLE活动组2倍以上表达差异的蛋白共有52个,上调的19个,下调的33个;SLE活动组与SLE稳定组相比,表达上调和下调的蛋白分别为17个和13个。结论: 定量蛋白质组学技术可有效地用于人外周血单个核细胞蛋白鉴定和相对定量;采用该技术获得了SLE病人外周血单个核细胞的蛋白质组差异表达图谱;深入研究这些蛋白的分子机制将有助于进一步阐明SLE的发病机制,为SLE的诊断和治疗提供新途径。     

克罗恩病患者与健康人血清蛋白质组学比较初步研究

目的：应用蛋白质组学方法在患者血清中寻找与克罗恩病相关的蛋白质。方法: 采取克罗恩病患者以及正常成人血清蛋白样本各4例，用不同的CyDye荧光染料标记后进行胶内差异双向凝胶电泳(2-D DIGE)，并对获得的图谱进行分析及对差异蛋白质进行基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS) 鉴定和生物学信息分析。结果: 通过2-D DIGE分析，发现了克罗恩病患者中存在29个表达异常蛋白质点，质谱分析和数据库检索共鉴定出22种蛋白质，包括SER/THR，CD45，APC等。结论: 蛋白质组学能很好显示克罗恩病患者与正常人血清蛋白质表达差异，本研究鉴定的蛋白质可能为研究克罗恩病的生物学行为提供新的分子标记物。     

利用SELDI-TOF质谱技术分析大肠癌患者血清蛋白质谱的变化

目的：研究大肠癌血清蛋白质谱的变化，从而筛选特异性蛋白标志物。 方法： 利用IMAC3蛋白质芯片和SELDI-TOF质谱技术，对64例大肠癌病人和40名正常人的血清蛋白质谱进行分析。获得的蛋白质谱采用Ciphergen公司的Biomarker Wizard和Biomarker Pattern软件分析。 结果： 通过对大肠癌术前血清与正常人血清蛋白质谱分析发现共有19个蛋白质表达量有明显差异。并获得分子量为5 972.67 D、5 927.21 D、6 113.48 D、5 908.55 D和4 292.51 D这5个蛋白质组成的模板，可将大肠癌与正常人正确分组，其正确分组率分别为97.5％（56/64）和80％（32/40）。术后血清蛋白质谱中，原高表达的蛋白质明显下调。 结论： 结果表明通过大肠癌手术前后及正常对照血清中蛋白质谱的比较，筛选得到用以诊断大肠癌的特异性蛋白标志物并用以预后的判断。SELDI-TOF蛋白质芯片技术为建立蛋白质模板从而早期诊断大肠癌提供了可靠的技术平台。     

系统性红斑狼疮肾炎血清差异蛋白质的筛选

目的:对比分析系统性红斑狼疮肾炎(LN)患者和健康人双重滤过血浆置换(DFPP)产物中的差异蛋白质,筛选与LN发生相关的血清蛋白质。方法:利用DFPP的方法分别对4例LN患者和4例健康人血浆进行过滤,将滤下的大分子蛋白混合物行双向电泳分离并银染显影,经图像分析筛选差异表达的蛋白点。应用QSTAR Pulsar I型串连飞行质谱鉴定差异表达的蛋白点,通过生物信息学比对,对其中有意义分子行血清浓度检测验证。结果:2组间筛选出差异蛋白点共317个,其中表达量差异达3倍以上的蛋白点69个,经串连质谱分析鉴定出包括人冷凝集素IgM抗体、免疫球蛋白λ轻链、谷胱甘肽-S-转移酶、结合珠蛋白前原蛋白、甲状腺素转运蛋白、载脂蛋白E、皮质类固醇结合球蛋白、玻连蛋白、角蛋白和转铁蛋白等十多个在SLE活动性肾炎血清中表达改变的蛋白分子。ELISA及RIA检测结果与双向电泳相符。结论:LN患者血清与健康人血清的蛋白表达谱有一定差异,这些差异分子可能成为LN诊断及预后判断的重要标志物。     

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中急性期蛋白反应因子的表达

目的　探讨系统性红斑狼疮 (SLE)患者外周血单个核细胞 (PBMC)中急性期蛋白反应因子 (APRF)的活性水平 ,以及IL 6和IL 10对APRF表达的影响。方法　采用凝胶阻滞电泳 (EMSA)的方法检测 4 0例SLE患者及 2 0例正常对照组PBMC中DNA结合蛋白APRF的表达水平。结果　所有活动期SLE患者均出现APRF电泳条带 ,17例非活动期SLE患者中有 10例出现APRF条带 ,而正常人对照组无 1例出现。 7例未出现APRF电泳条带的非活动期SLE患者PBMC加IL 10处理后均出现不同程度的APRF表达 ,而加IL 6处理时仍未出现APRF电泳条带。结论　SLE患者存在APRF的异常表达。在SLE中 ,IL 10信号转导途径中的某些调控机制 (如蛋白激酶 )可能发生改变 ,从而使得核内的APRF激活转录 ,提示IL 10很可能是通过APRF在SLE的发病机制中起作用 ,相反IL 6在SLE发病的作用机制很可能与APRF无关。     

Surface expression of heat shock protein 90 by blood mononuclear cells from patients with systemic lupus erythematosus.

Previous studies have indicated that blood mononuclear cells from 15-20% of patients with systemic lupus erythematosus (SLE) carry elevated levels of hsp90, a heat shock protein associated with steroid receptors in cells. We analysed surface expression of hsp90 on mononuclear cells (lymphocytes and monocytes) from patients with SLE by monoclonal antibody AC88 and flow cytometry. Whilst all blood mononuclear cells have intracellular hsp90, a significant proportion of patients with SLE expressed hsp90 on lymphocyte and monocyte surfaces. This was significantly higher on SLE lymphocytes than in laboratory controls and was positively correlated with disease activity. Comparison of total hsp90 with surface hsp90 in the same SLE patients' blood mononuclear samples indicated a correlation with a subgroup of patients. There was no correlation with expression of surface hsp90 by lymphocytes and activation markers. Patients with Sj?gren's syndrome, rheumatoid arthritis, dermatomyositis and scleroderma were studied as disease controls and increased levels of shsp90 were detected in only three of the 53 patients studied. It is concluded that surface hsp90 expression is a feature of about 20% of patients with SLE and is correlated with high disease activity. The exposure of this hsp on the surface of some lymphocytes suggests that it is a candidate autoantigen in SLE.     

Nuclear phosphotyrosyl-protein with DNA-binding ability in peripheral blood mononuclear cells from systemic lupus erythematosus patients.

This study examined the phosphorylation of cytoplasmic and nuclear proteins in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of systemic lupus erythematosus (SLE) patients. The cytoplasmic and nuclear protein kinase activity in PBMC from SLE patients was at least five-fold higher than that of normal healthy subjects. PBMC of SLE patients produced different nuclear endogenous substrates on phosphorylation and also displayed distinct protein kinase activity. Nuclear phosphoproteins, with human PBMC DNA-binding ability, of 38 kD and 70 kD were detected from both SLE patients and normal healthy subjects, while the 40 kD phosphoprotein, with tyrosine as the main phosphorylation residue, was found only in SLE patients. Other nuclear phosphoproteins, and most of the detected cytoplasmic phosphoproteins, were present in higher levels in both normal PBMC with mitogen stimulation, such as PHA, and SLE PBMC. The expression level of the 40 kD nuclear phosphotyrosyl-protein showed a positive correlation with the clinical disease activity of SLE. These results suggest that PBMC from SLE patients had distinct tyrosine protein kinase (TPK) activity and/or a different endogenous substrate of nuclear DNA-binding proteins in tyrosine phosphorylation. The possible significance of tyrosine phosphorylation in PBMC of SLE patients in the pathogenesis, and its clinical meaning, are discussed.     

Abnormal production of B cell growth factor in patients with systemic lupus erythematosus.

In order to clarify the role of B cell growth factor (BCGF) in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus (SLE), BCGF production by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and T cells was studied using a new bioassay for BCGF activity. For this purpose, we established an Epstein-Barr (EB) virus-transformed B cell line KS-3.F10 that proliferates only in response to two B cell-specific BCGF, low-mol. wt BCGF (LMW-BCGF) and high-mol. wt BCGF (HMW-BCGF). PBMC from active SLE patients produced less BCGF when stimulated with phytohaemagglutinin (PHA) compared with controls. The decreased BCGF production by PHA-stimulated PBMC from active SLE reverted to control values when SLE became inactive. However, PHA-stimulated T cells from active SLE patients produced more BCGF compared with controls, whereas those from inactive SLE showed normal BCGF production. Spontaneous BCGF production by T cells was not observed in active SLE patients. These findings suggest that decreased BCGF production by SLE PBMC is due to excessive BCGF consumption by B cells in vitro and that SLE T cells produce large amounts of BCGF with appropriate immune stimuli in vivo to promote polyclonal B cell activation.