丙型肝炎病毒基因组部分E2／NS1蛋白基因在大肠杆…

在大肠杆菌中表达了丙型肝炎病毒基因组的部分Ｅ２／ＮＳ１蛋白（氨基酸３６４－５１２）。表达蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，主要表达带的分子量在－４３ ０００左右。表达蛋白用于检测已用Ｃ３３ｃ及Ｃ２２检测过的血清，发现Ｅ２ ＮＳＩ抗体阳性率占Ｃ３３ｃ及Ｃ２２抗体阳性血清的２０％，尚没有发现单独Ｅ２／ＥＳＩ抗体阳性的血清。     

丙型肝炎病毒（HCV）E2／NS1相对保守区多肽抗原在检？…

目的 研究（ＨＣＶ）Ｅ２／ＮＳ１相对保守区多肽抗原在检测抗－ＨＣＶ中的意义。方法 利用ＨＣＶＥ２／ＮＳ１基因编码的膜区糖蛋白合成Ｅ２／ＮＳ１相对保守区多肽抗原,建立酶免疫试验（ＥＩＡ）,对９６例ＨＣＶ感染者及４０例正常献血员进行ＨＣＶＥ２／ＮＳ１抗体的检测,同时平行检测ＨＣＶＲＮＡ肝炎为１３．５５％,慢性丙型肝炎为２５．０４％,无症状感染者为２．０８％;正常献血员中发现３例抗ＨＣＶＥ２／ＮＳ１抗体     

HCV核心抗原C33肽单克隆抗体的研制与初步鉴定

用ＨＣＶ核心抗原（３３肽）与鼠血清白蛋白交联后免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，用杂交瘤技术获得有实用价值的２株ＭｃＡｂ。此两株ＭｃＡｂ除与免疫抗原有较强的抗原－抗体反应外，与ＨＣＶ核心抗原ＣＰ１０也有很好的反应；但与ＨＣＶＮＳ３、ＮＳ５及核心区ＣＰ９抗原无反应性。在竞争ＥＬＩＳＡ中，对抗ＨＣＶ－ＩｇＧ阳性血清有较好的抑制作用。将此两株ＭｃＡｂ用于慢性丙型肝炎病人肝活检免疫组化研究，获得较为满意的结果。     

人巨细胞病毒单克隆抗体的研制检定和应用

采用人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ＡＤ１６９株作为免疫原，制备出１３株鼠－鼠杂交瘤细胞系。对其中的６株进行了检定．免疫印迹试验结果表明：单克隆抗体（ＭｃＡｂ）７Ｂ４、７Ｄ７、７Ｅ１１、８Ｅ８和８Ｄ６相对应的ＨＣＭＶ多肽分子量分别为４６、１５０、３８、５１７２和６５ｋＤ．ＨＣＭＶ感染人胚肺二倍体细胞（２ＢＳ）后不同时间制成抗原片，与ＭｃＡｂ作间接免疫荧光试验。结果表明：ＭｃＡｂ８Ｂ８相应的病毒多肽为即刻早期抗原，其它５株ＭｃＡｂ相应的病毒多肽均为晚期抗原，６株ＭｃＡｂ等量混合后，标上辣根过氧化物酶，用于ＩｇＭ抗体捕获法ＥＬＩＳＡ（ＭａｃＥＬＩＳＡ）中，并与间接ＥＬＩＳＡ（ＩＥＬＩＳＡ）同时检测ＨＣＭＶ－ＩｇＭ．在未经选择的１００份脐带血中，两法均为阳性的３份，两法均为阴性的９４份；ＭａｃＥＬＩＳＡ阳性而ＩＥＬＩＳＡ阴性的２份血清的特异性试验证明，ＨＣＭＶ－ＩｇＭ确为阳性．ＩＥＬＩＳＡ阳性而ＭａｃＥＬＩＳＡ阴性的１份血清的特异性试验证明，它是由ＲＦ引起的假阳性。     

免疫印迹技术检测抗中性粒细胞胞浆抗体的应用研究

用免疫印迹技术（ＩＢＴ）检测了１０１例不同原因的血管炎、ＳＬＥ和类风湿性关节炎（ＲＡ）患者血清中的抗中性粒细胞胞浆抗体（ＡＮＣＡ），ＡＮＣＡ与凝胶电泳时２９ＫＤａ处的中性粒细胞胞浆抗原形成一条明显的沉淀带。韦格纳氏／多血管炎组患者的阳性率为５４．５％（６／１１例），显著高于其他血管炎、ＳＬＥ和ＲＡ患者的１４．２％（３／２１例），４．２％（２／４８例）和０％（０／２１例）。３５份正常人血清全呈阴性。用ＡＮＣＡ阳性血清作用于中性粒细胞，在间接免疫荧光检测时均呈胞浆型（Ｃ－ＡＮ－ＣＡ）。此法特异、简便、易于推广应用，有助于血管炎的诊断。     

利用多组套式引物检测庚型肝炎病毒RNA

利用庚型肝炎病毒（ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ）ＮＳ３～５区序列合成了四组套式引物，建立了灵敏、特异的庚型肝炎病毒ＲＮＡ双扩增聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测方法。用此方法检测了１０份庚型肝炎病毒抗体阳性患者血清及１０份阴性的健康人血清。前者不同组引物的检出率为ＮＳ３（１）引物９份阳性，ＮＳ３（２）引物８份阳性，ＮＳ４引物４份阳性，ＮＳ５（１）引物５份阳性，ＮＳ５（２）引物９份阳性；后者各组引物检测均为阴性。结果表明，庚型肝炎病毒不同区域引物用于ＲＴ－ＰＣＲ检出率差异较大。ＮＳ３（１）及ＮＳ５（２）这两组引物检出率最高，更适合用于ＲＴ－ＰＣＲ检测庚型肝炎病毒ＲＮＡ。     

中国流行株HIV—1gag和hIL—2／hIL—6核酸疫苗构建与实验免疫研究

目的 探讨中国流行株ＨＩＶ－１ｇａｇ与ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６共表达重组核酸疫苗闰的免疫效果。方法 以核酸疫苗质粒ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ为表达载体,构建重组核酸疫苗质料ｐＩＲＥＳ１－ｇａｇ、ｐＩＲＥＳ１－ｇａｇ－ｈＩＬ－２、ｐＩＲＥＳ１－ｇａｇ－ｈＩＬ－６,通过间接免疫荧光试验、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测ｇａｇ／ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６基因的表达产物。另将此重组核酸疫苗质粒免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,进行淋巴细胞转化试验、ＣＤ４＾＋、ＣＤ８＾＋Ｔ淋巴细胞数量测定、细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）特异性杀伤作用检测及血清抗体检测,结果 构建的重组质粒转染ＢＨＫ细胞后可表达目的基因,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖、诱导特异性ＣＴＬ反应,当和ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６共表达时免疫效果更加显著。讨论 与Ｇａｇ蛋白共表达的ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－     

Epstein－Barr病毒核抗原Ⅱ（EBNA2）基因免疫的初步研究

利用基因免疫技术，将重组质粒ＰＳＧ５－ＥＢＮＡ２注入Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠肌肉中，于第２、４、８周检测鼠血清中抗－ＥＢ病毒核蛋白抗原Ⅱ的特异抗体，结果表明，８３％（５／６）的免疫小鼠产生特异抗体，且抗体滴度随时间变化增高。     

何杰金病中EB病毒感染和bcl—2蛋白的表达

目的探讨Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ（ＥＢ）病毒与ｂｃｌ－２基因的关系。方法利用免疫组织化学ＬＳＡＢ法检测了６４例何杰金病ＥＢ病毒的潜在膜蛋白－１（ＬＭＰ－１）和ｂｃｌ－２蛋白的表达。用原位杂交方法检测了４１例何杰金病组织中的ＥＢＥＲ。又用双重染色的方法检测了７例ＥＢＥＲ和ｂｃｌ－２蛋白双阳性的何杰金病例。结果ＬＭＰ－１和ＥＢＥＲ的阳性率分别为３９％和４４％,所有ＥＢＥＲ阳性的病例ＬＭＰ－１均为阳性。ｂｃｌ－２蛋白的阳性率为２３％,其中仅有７例ＬＭＰ－１和ｂｃｌ－２蛋白同时阳性。双重染色结果为,在７例双阳性病例中ｂｃｌ－２阳性的细胞只有约５０％ＥＢＥＲ阳性,约４０％ＥＢＥＲ阳性的肿瘤细胞ｂｃｌ－２阳性。结论研究结果提示,在本组研究的病例中Ｒ－Ｓ细胞的ｂｃｌ－２蛋白的表达与ＥＢ病毒的存在与否无明显相关性。     

丙型肝炎病毒核心抗原C33的测定

目的探索丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｃ３３抗原在正常人群及各类临床病人血清及肝组织中分布状况。方法用人工合成的ＨＣＶ核心抗原Ｃ３３肽（含３３个氨基酸）与小鼠血清白蛋白,经异型双功能交联剂ＳＰＤＰ连接后免疫Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠,制成２株Ｃ３３肽单克隆抗体（ＭｃＡｂ）,分别用作包被抗体和酶标抗体,建立检测血清中Ｃ３３肽抗原的酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）,共检测了１２３６例各类病人。并用免疫荧光及固相免疫酶法检测肝活检组织中的ＨＣＶＣ３３肽抗原。结果急性丙型肝炎（ＨＣ）患者,Ｃ３３肽的阳性检出率为１４．０％（６／４３）;仅抗－ＨＣＶＩｇＧ阳性患者Ｃ３３肽的阳性检出率为８．８％（３５／３９６）;慢性丙型肝炎患者为６．５％（４／６２）;白血病患者为４．３％（１／２３）;血透病人为３．３％（１９／５７６）;普通住院病人为１．５％（２／１３６）;正常供血员为１．４％（６／４３８）。肝活检免疫荧光、固相免疫酶检测显示ＨＣＶＣ３３肽在细胞核、细胞质、细胞膜上均有表达,在胞质中或集中于全胞质一侧或弥散分布于胞质中。结论ＨＣＶＣ３３抗原测定,可以作为ＨＣＶ感染的标志物之一。     

Detection of the putative E2 protein of hepatitis C virus in human liver

The question was asked whether a predicted envelope protein, considered to be processed from the polyprotein precursor encoded by the putative E2/NS1 region of the hepatitis C virus (HCV) genome, may be observed in HCV-infected humans. Two polyclonal antibodies against recombinant E2/NS1 proteins were prepared and their reactivity tested against liver extracts from HCV-infected patients by immunoblotting analysis. A band corresponding to a size of 44 kDa was detected in liver extracts from patients who were positive for the HCV-specific antibody anti-C100-3 but not in liver extracts from patients who did not have anti-C100-3 antibody. Additionally, no band was detected using preimmune sera or antisera which had been preabsorbed with recombinant E2/NS1 proteins. Deglycosylation studies demonstrated that the 44 kDa protein was a glycosylated form of a 38 kDa protein which corresponds to the predicted molecular weight of the putative E2/NS1 protein. These results suggest that the 44 kDa protein is a product of the E2/NS1 region. Frequent observation of the 44 kDa band in cases of chronic active hepatitis C suggests a correlation between the expression of this protein and the progression of hepatitis. © 1994 Wiley-Liss, Inc.     

丙肝病毒NS5B-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及稳定转染HepG2细胞系的建立

目的　构建可表达丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B EGFP融合蛋白的真核表达载体 ;获得重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。方法　利用PCR技术从HCV基因组中扩增出ns5b基因片段 ,XhoⅠ KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP N3真核表达载体 ,转化TG1菌株感受态细胞 ,获得阳性重组质粒pEGFPN3 ns5b。将阳性克隆用脂质体法转染HepG2 细胞 ,经持续G4 18压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系。结果　成功构建了真核表达载体pEGFPN3 ns5b ;建立了其重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。结论　重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系可表达NS5B EGFP融合蛋白 ;该HepG2 细胞系可以应用于以ns5b基因为靶位的抗HCV感染研究     

丙型肝炎病毒非结构区NS3基因在大肠埃希菌中的可诱导性表达

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）NS3基因的原核细胞表达载体。实现在大肠埃希菌中的可诱导性表达。方法 应用聚合酶链反应（PCR）技术，以美国HCV-H株全长cDNA质粒为模板，扩增获得NS3基因片段，克隆到原核表达载体pET-30C( )中，构建原核表达载体pET-NS3，转化BL21（DE3）宿主菌，以IPTG诱导，获得NS3蛋白的可诱导性表达，以HCVNS3的单链可变区抗体（ScFv)证实表达的NS3蛋白的特异性，结果 以HCVNS3基因序列特异性引物，PCR扩增获得1893bp的NS3DNA征段，插入pET-30C( )表达载体，转化BL21（DE3）受体菌，经培养，IPTG诱导，获得了重组HCVNS3蛋白的表达，以HCVNS3的ScFv证实了表达的重组蛋白HCVNS3的特异性。结论 以大肠埃希菌表达了HCVNS3的重组蛋白质。     

丙型肝炎病毒E2／NS1区基因cDNA的克隆及序列分析

从北京地区１份丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者血清中提取ＲＮＡ，经逆转录和套式聚合酶链反应扩增ＨＣＶＥ２／ＮＳ１区基因约９３０ｂｐ，将其插入至ｐＧＥＭ－Ｔ质粒载体中，利用双脱氧链末端终止法测出该基因５’端４３１ｂｐ的核苷酸序列，将此序列与其它９个ＨＣＶ分离株的相应序列进行比较分析，结果表明，此序列与ＨＣＶⅡ型序列同源性较高，核苷酸水平同源性在８０％以上。由其编码的ＨＣＶ外膜蛋白Ｎ端存在两个高变部位（ＨＶＲ），在ＨＶＲ内、外具有几个保守氨基酸残基和氨基酸区域，它们与外膜蛋白空间构型的维持有关。     

Optimization of Dengue-3 recombinant NS1 protein expression in E. coli and in vitro refolding for diagnostic applications

Dengue non-structural protein (NS1) is known to be protective antigen and also has immense application for serodiagnosis. Several serodiagnostic assays available for dengue viral infection are dependent on tissue culture-grown viral proteins. This task is unsafe, laborious, more expensive that makes it unsuitable for routine large-scale production. Although bacterial expression is relatively simple and easy for recombinant protein expression, it is more challenging to make NS1 protein with native structural and immunological features using bacterial expression system. We have successfully developed a method leading to the purification and refolding of recombinant dengue virus type 3 (DENV3) NS1. The gene encoding NS1 was amplified and cloned in pET28a (+) vector. In order to increase the purity of the recombinant NS1, the transgene was engineered to carry 6× Histidine tags at both N and C-terminal ends. The recombinant construct (pETNS1) was transformed into E. coli Rosetta-gami cells and the expression conditions viz IPTG concentration, media type, temperature, and harvest time were optimized. The size of the expressed protein was found to be ~45 kDa and the authenticity of the expressed protein was confirmed using anti-His and anti-NS1 monoclonal antibodies. The NS1 protein was purified under denaturing conditions, to attain the native conformation, NS1 protein was in vitro refolded and dialyzed. The refolded NS1 protein was detected by commercial Immuno chromatographic strip and NS1 specific monoclonal antibodies. IgM antibody capture ELISA was performed using refolded recombinant NS1 protein which recognized the IgM antibodies in dengue-positive samples of acute phase of infection. Our result suggests that rNS1 protein has immense diagnostic potential and can be used in developing point of care diagnostic assays.     

HCV 5′ NCR和结构蛋白编码序列的拼接及在pLNSX中的克隆

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)5′末端非编码区(5′NCR)和结构蛋白编码基因序列逆转录病毒重组体,用于探索控制HCV感染的新途径和基因治疗。方法:对多株HCV核酸序列进行同源性比较设计引物,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增5′NCR、C、E1和E2/NS14个编码区共5个片段,分别克隆。以连接聚合酶链反应(PCR)将这5个片段拼接为一连续的长2547nt的片段,含HCV完整的5′NCR和全部的结构蛋白编码序列。将此序列插入pGEM-Zf(+)载体,与逆转病毒pLNSX载体中,转化大肠杆菌DH5a、转化菌落经酶切、PCR和Southern杂交鉴定。结果:通过RT-PCR和连接聚合酶链式反应(PCR)扩增出2547nt含HCV完整的5′NCR和全部的结构蛋白编码序列,将此序列与pGEM-Zf(+)重组得重组体pHC2547,与逆转录病毒载体pLNSX重组得pL-HC。结论:成功构建了HCV逆转病毒重组体,以利于HCV的胞内基因表达调控研究,更为探索HCV分子致病机制和转基因动物及基因治疗提供可靠的物质基础。     

庚型肝炎病毒(HGV)E2区cDNA的克隆与表达

目的　克隆ＨＧＶ Ｅ２ 基因并在原核细胞系统中表达ＨＧＶ Ｅ２ 蛋白。方法　从ＨＧＶＲＮＡ 阳性血浆中抽提病毒ＲＮＡ,利用半巢式ＲＴＰＣＲ 法扩增ＨＧＶ Ｅ２ 基因片段并进行序列分析。然后将该片段克隆到ｐＧＥＸ５ｘ１ 表达载体上,进行诱导表达。表达产物用抗ＨＧＶ 阳性血浆作Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 活性鉴定。结果　获得ＨＧＶ Ｅ２ Ｎ 端长度为７７９ 个核苷酸的基因片段。该片段与美国株ＨＧＶ（Ｕ４４４０２） 、西非株ＧＢＶＣ（ Ｕ３６３８０） 、中国株ＨＧＶ（ Ｕ７５３５６） 的核苷酸序列同源性分别为８４ ％ 、８５ ％ 、９１ ％ ,推测的氨基酸序列同源性分别为８８ ％ 、９３ ％ 、９４ ％ 。表达产物为相对分子质量约５０ ×１０３的ＧＳＴＥ２ 融合蛋白,在细胞内形成包涵体。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 反应中在约５０ ×１０３ 处有显色条带。结论本研究成功地在原核细胞系统中表达了具有抗原性的ＨＧＶ Ｅ２ 蛋白,为进一步研究ＨＧＶ Ｅ２ 蛋白及Ｅ２ 抗体的生物学功能打下了基础。     

Monoclonal antibody study of antigens E and NS1 of Western Siberian tick borne encephalitis virus strains]

Antigenic structure of tick-borne encephalitis virus proteins was studied by ELISA with monoclonal antibodies (MAb) to E and NS1 glycoproteins of strain Sofyin. Envelope proteins appeared to be conservative which corresponded to previously determined nucleotide sequences of E gene fragments and deduced primary structures of the corresponding E protein. Five of six studied MAb to NS1 nonstructural glycoprotein of strain Sofyin reacted with this protein of all studied strains. The only exception was MAb 17C3 which discriminates West Siberian strains from Far Eastern strain Sofyin.     

人乳头瘤病毒16型L1/E7融合蛋白在原核细胞中的表达及免疫效果观察

目的构建能表达L1E7融合蛋白的原核表达菌株,纯化蛋白,并观察其免疫效果。方法用PCR方法分别扩增出C末端部分缺失的HPV16L1基因和HPV16E7编码基因N端部分序列。将上述基因连接,构建融合基因L1ΔCE7N并将其插到原核表达载体pGEX-2T中进行融合蛋白表达纯化,然后观察其免疫效果。结果L1ΔCE7N融合基因测序结果表明,序列与设计相符,读码框架正确。将其插入原核表达质粒在大肠埃希菌中获得高效表达;经Wester-Blot鉴定在相对分子质量约85×103处有特异性表达带,与预期相符。用亲和层析和分子筛可纯化L1ΔCE7N融合蛋白,将其免疫C57BL/6小鼠,结果表明融合蛋白能诱发高滴度L1、E7抗体,并能保护小鼠免受TC-1肿瘤细胞的攻击。结论本实验在原核系统中高效表达并纯化了L1ΔCE7N融合蛋白,该蛋白可作为预防和治疗HPV16感染以及相关肿瘤的候选疫苗株。为研制HPV16预防治疗性疫苗探索一条经济、易普及的途径。