蓖麻毒素快速ELISA检测法的建立

目的:建立蓖麻毒素快速ELISA检测方法。方法:从8株抗蓖麻毒素的杂交瘤细胞中,筛选亲和力较高的单克隆抗体,用Westernblot和ELISA鉴定、ProteinA纯化、HRP标记,经交叉配伍筛选最佳的抗体组合。结果:建立了蓖麻毒素的快速ELISA检测方法,对蓖麻毒素的最低检出浓度为175ng/L,目视检测最低浓度为625ng/L,整个实验不需仪器可在40min内完成检测。结论:蓖麻毒素快速ELISA检测法为蓖麻毒素生物战剂的快速侦检提供了有效手段。     

尘螨变应原Der f 6 / pET32a( +) 重组质粒构建、表达、纯化及其产物血清 IgE 结合率

目的:获得尘螨变应原第6 组分Der f 6 原核表达产物并检测其与尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体IgE 结合率。方法:酶切质粒pET28a(+)-Der f 6 获得目的基因Der f 6,将其与pET32a(+)载体连接成质粒pET32a (+)-Der f 6,转化BL21细菌后,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni+离子亲和层析柱纯化表达产物,用十二烷基磺酸钠鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹实验(Western blot)和蛋白质串联质谱(MALDI-TOF/ TOF)鉴定纯化产物。以纯化获得的产物为包被抗原建立间接ELISA 法检测尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体反应情况。结果:成功构建了原核表达质粒pET32a (+)-Der f6,将该质粒转化E.coli BL21 诱导表达,亲和层析纯化后,SDS-PAGE 显示获得目的蛋白,Western blot 验证其能够与载体的组氨酸标签结合,质谱鉴定其Der f 6 结构一致。以此产物为包被抗原建立间接ELISA 检测尘螨过敏性哮喘患儿血清,阳性率为41.3% (19/46)。结论:成功构建了原核表达质粒pET32a (+)-Der f 6,亲和纯化获得的目的蛋白具有良好的反应原性。     

抗淋巴样增强因子-1羧基端单克隆抗体的制备及其表位的初步鉴定

目的 制备抗淋巴样增强因子-1(LEV-1)羧基端86个氨基酸(Lct86)特异性单克隆抗体,并初步明确其表位,为进一步研究LEF-1 C端特异序列的功能奠定基础.方法 从Jurkat细胞株中扩增LEF-1 C端特异序列eDNA,并克隆入PQE40、pET32a原核表达载体;分别转化入M15、BL21(DE3)感受态菌,IPIG诱导表达;纯化PQFAO-Lct86融合蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体,以pET32a-Lct86融合蛋白鉴定单克隆抗体特异性.LEF-1 C端特异序列不同长度的基因片段定向克隆人PQE40,鉴定各片段的表达,利用Western blotting初步鉴定单克隆抗体的表位.结果 成功构建了PQE40-Lct86、pET32a-Lct86重组原核表达载体;纯化获得PQE40-Lct86融合蛋白;得到一株特异性的抗LEF-1 C端单克隆抗体TMAb1,证实其表位位于437aa～454aa.结论 成功制备了一株特异性的抗LEF-1 C端单克隆抗体TMAb1,并鉴定其抗原识别表位位于437aa～454aa,为进一步研究LEF-1 C端的功能奠定基础.     

人CD38抗原胞外段基因克隆及表达

目的 克隆并表达人CD38抗原分子的胞外估基因。方法 采用RT－PCR法，从高表达CD38抗原的Daudi细胞系中，扩增CD38全长cDNA，并将其插入pGEM-T载体中。重新设计引物，从重组pGEMT载体中，扩增CD38抗体分子的胞外段基因，再亚克隆到表达载体pET28a( )，转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导表达。结果 经酶切鉴定及序列分析表明，克隆的CD38外段基因的序列与文献^[1,2]的报道完全一致。将该片段亚克隆到表达载体pET28a( ) ,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21中获得表达。结论 获得了人CD38抗原分子胞外段基因及其原核表达产物，对进一步制备单克隆抗体，研究CD38分子的功能具有重要的意义。     

重组蓖麻毒素A链的融合表达、纯化及活性研究

目的: 制备有高生物活性的重组蓖麻毒素A链蛋白(RTA)。方法: 在RTA序列的C末端引入KDEL信号肽,克隆到含有硫氧还蛋白(Trx)的融合表达载体pET32a中, 转入大肠杆菌BL21, 在低温 ( 20℃)下用低浓度 ( 0. 4mmol/L)IPTG诱导重组质粒进行表达。表达上清用钴离子亲和层析柱进行纯化, 20~100mmol/L咪唑溶液洗脱目的蛋白。纯化蛋白经SDS- PAGE电泳与Westernblot鉴定后, 对pUC19质粒进行超螺旋dsDNA裂解研究。结果: 每升细菌培养物回收约60mg的纯化蛋白, 纯度大于 90%, Mr约 45 000, 且 3μg纯化蛋白即可以对 1μg超螺旋dsDNA产生明显的裂解活性。结论: 利用pET32a表达系统可以快速获得大量有高生物活性的可溶性RTA- Trx融合蛋白。     

人survivin蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的 构建人肿瘤抗原survivin的原核表达载体,优化在大肠杆菌中的表达条件,并对survivin/His融合蛋白进行纯化和抗原活性鉴定.方法 设计针对survivin基因序列的特异引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增人survivin全长基因序列(538 bp)克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28 a-survivin,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达survivin/His融合蛋白,并采用Ni亲和层析凝胶纯化重组蛋白.纯化后的重组蛋白经Western blot法、ELISA鉴定其抗原活性.结果 重组表达载体经BamH Ⅰ和HindⅢ鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)24000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90％.Western blot法和ELISA检测证实纯化的survivin蛋白能够与特异性抗体发生反应,表明其具有良好的抗原活性.结论 成功构建了原核表达载体pET28 a-survivin,利用大肠杆菌表达系统实现了融合蛋白的可溶性表达并进行纯化,纯化后survivin蛋白经鉴定具备较高的抗原活性.     

提高树突状细胞腺病毒感染效率的融合蛋白的表达及活性鉴定

目的构建表达靶向树突状细胞融合蛋白CT40L的原核表达载体,在大肠杆菌中表达,并对CT40L融合蛋白进行纯化鉴定及功能验证。方法从GenBank上查找柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)、T4噬菌体fibritin和小鼠CD40L的基因序列,并将其主要功能区域连接形成拼接序列;序列进行原核表达密码子优化后将其克隆至原核表达载体pET42a(+),构建重组表达载体pET42a-CT40L,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达CT40L/GST融合蛋白,并采用GST琼脂糖凝胶纯化重组蛋白。纯化后的重组蛋白经Western blot法、间接ELISA鉴定其免疫活性。结果重组表达载体经NcoⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)78 000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90%。Western blot法和ELISA检测证实纯化的CT40L分子能够与特异性抗体及相应受体发生反应,表明该融合蛋白具有良好的免疫学活性。结论成功构建了原核表达载体pET42a-CT40L,利用大肠杆菌表达系统实现了融合分子的可溶性表达,纯化后CT40L融合蛋白经检测具备较高的免疫学活性。     

人Cyclin E原核表达载体的构建及表达

目的：构建人Cyclin E基因原核表达载体,并在E.coli BL21中表达并纯化。方法：PCR扩增人Cyclin E基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET32a（＋）中,构建重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E。经限制性内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果：获得全长约为1200bp的人的Cyclin E基因片段。以构建的重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E转化E.coli BL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约60000的融合蛋白。经SDS-PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为Cyclin E。结论：成功地构建了表达载体pET32a（＋）-Cyclin E,并表达出重组蛋白His-Cyclin E,为进一步筛选在体内外能与Cyclin E和CDK2结合的新蛋白奠定了基础。     

提高树突状细胞腺病毒感染效率的融合蛋白的表达及活性鉴定北大核心CSCD

目的构建表达靶向树突状细胞融合蛋白CT40L的原核表达载体,在大肠杆菌中表达,并对CT40L融合蛋白进行纯化鉴定及功能验证。方法从GenBank上查找柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)、T4噬菌体fibritin和小鼠CD40L的基因序列,并将其主要功能区域连接形成拼接序列;序列进行原核表达密码子优化后将其克隆至原核表达载体pET42a(+),构建重组表达载体pET42a-CT40L,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达CT40L/GST融合蛋白,并采用GST琼脂糖凝胶纯化重组蛋白。纯化后的重组蛋白经Western blot法、间接ELISA鉴定其免疫活性。结果重组表达载体经NcoⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)78 000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90%。Western blot法和ELISA检测证实纯化的CT40L分子能够与特异性抗体及相应受体发生反应,表明该融合蛋白具有良好的免疫学活性。结论成功构建了原核表达载体pET42a-CT40L,利用大肠杆菌表达系统实现了融合分子的可溶性表达,纯化后CT40L融合蛋白经检测具备较高的免疫学活性。     

人心肌肌钙蛋白I的原核表达及其兔抗体的制备

目的:构建人心肌肌钙蛋白I(hcTnI)基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,并制备兔抗hcTnI抗体。方法:以化学方法合成hcTnI基因并插入融合表达载体pET21a( )的多克隆位点,构建重组表达质粒pET21a( )hcTnI。以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,筛选阳性重组子,经IPTG诱导目的蛋白的表达,表达产物的免疫学活性用Westernblot进行鉴定。以表达的hcTnI蛋白免疫家兔,制备抗hcTnI的抗体并进行纯化及特性鉴定。结果:成功地合成hcTnI基因,测序证实序列正确后亚克隆于表达载体pET21a( )中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,序列分析表明其中的插入序列与cTnI基因完全一致。在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)为24000的目的蛋白,约占菌体总蛋白的28%,Westernblot分析显示,表达的hcTnI蛋白具有良好的免疫反应性。以纯化的hcTnI免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价为3×10-4,且具有良好的特异性。结论:成功地构建hcTnI基因的原核表达载体pET21a( )hcTnI,并在大肠杆菌中获得高效表达。制备出兔抗hcTnI的抗体,且效价及特异性均较良好,为进一步建立酶联免疫吸附法检测hcTnI奠定了基础。     

Expression of intracellular domain of epidermal growth factor receptor and generation of its monoclonal antibody

To prepare monoclonal antibody specific to epidermal growth factor receptor (EGFR) intracellular domain, its gene was amplified from total RNA of A431 cell by RT-PCR. Then the gene was cloned into prokaryotic vector pET30a(+). The recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3) strain for protein expression. Recombinant protein was induced with IPTG and purified using Ni2+-NTA agarose. Then the anti-EGFR monoclonal antibody (mAb) was prepared with classical hybridoma technique. Positive clones were selected using indirect enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA). Totally 4 hybridoma clones were obtained and these mAbs were IgG1 (3 clones) and IgG2a (1 clone), respectively. Their light chains were all kappa chains. Western blotting analysis and confocal immunofluorescence assays demonstrated that mAbs could specifically recognize EGFR expressing on A431 carcinoma cell line. The mAbs will be useful in the study of EGFR-mediated signal transduction.     

人幽门螺杆菌18 000外膜蛋白与HspA双价疫苗的构建和表达

目的 :构建含人幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白A(HspA)和Mr为 180 0 0的外膜蛋白编码基因的重组载体 ,进行核苷酸序列分析 ,并在E .coliBL2 1中表达。方法 :用PCR方法从HpDNA染色体中 ,扩增HspA编码基因片段。将目的基因HspA与载体 pET32a( )分别经kpnⅠ和BamHI双酶切后 ,进行连接、测序。同时将重组载体 pET32a( ) /HspA和pET32a( ) /Omp18,分别经HindIII和BamHI双酶切 ,通过凝胶电泳回收pET32a( ) /HspA和Mr180 0 0OMPDNA片段 ,经T4连接酶将HspA和Mr180 0 0OMP编码基因通过酶切粘端进行连接 ,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE30 )中表达。表达产物经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,以Westernblot分析其抗原性。结果 :经酶切、测序表明 ,插入的基因片段为HpHspA和Mr 为 180 0 0OMP编码基因 ,由 891个碱基组成 ,与GenBank中登录的序列相比较 ,有 1.15 %的碱基发生变异 ,1.2 6 %的氨基酸残基改变。经SDS PAGE分析发现 ,融合基因表达的蛋白Mr 为 5 1× 10 3 ,其中 pET32a( )表达的蛋白Mr 约为 2 0×10 3 ,可溶性表达产物占菌体总蛋白的 18.96 %。重组蛋白经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,其纯度达 95 %以上。用Westernblot分析显示 ,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清及抗Mr为 180 0 0OMP单     

人星状病毒1型衣壳蛋白原核表达、纯化及多克隆抗体制备的研究

目的表达纯化人星状病毒1型(HAstV-1)衣壳蛋白VP26片段,制备多克隆抗体,初步建立夹心酶联免疫吸附分析(ELISA)检测病毒抗原方法,为进一步大量表达VP26片段、构建基因工程疫苗和临床检测奠定基础。方法利用原核表达系统在大肠杆菌中克隆、表达重组VP26蛋白,并以Ni2+-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,运用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、二噻啉甲酸法(BCA)实验、Western blot等方法对重组蛋白纯度、浓度、抗原性进行评价鉴定。以重组VP26蛋白作为抗原,免疫新西兰大耳兔获得多抗血清并对其效价、特异性用ELISA鉴定。结果原核表达载体pET30a(+)-VP26构建成功,重组VP26蛋白可在大肠杆菌Rosetta 2宿主菌中大量表达。免疫兔所得多抗血清效价达到1∶8 000,可以满足夹心法ELISA实验的需要。结论HAstV-1衣壳蛋白原核表达系统建立和多克隆抗体制备可以作为今后相关研究的基础,有助于对HAstV-1感染致病机制、免疫诊断和疫苗研制的更深入研究。     

抗蓖麻毒素A链人源化单域抗体的设计、原核表达及生物活性检测

目的 运用计算机辅助蛋白质分子设计的方法设计针对蓖麻毒素A链(RTA)的拮抗肽,实现在大肠杆菌B121中的可溶性表达,并对其生物学活性进行评价.方法 根据RTA的晶体结构、RTA-rRNA相互作用复合物模型,在CVFF(consistent-valence force field)、Amber力场下,对RTA的空间构象进行理论模拟,初步确定其生物活性功能域;然后针对该功能域设计小分子拮抗肽,并借助人抗体重链町变区骨架,在CDR3区对拮抗肽进行展示,用重叠延伸PCR全基因合成人源化的单域抗体并克隆至载体pET-32a(+);双酶切和DNA测序技术对构建的载体进行鉴定;IPrG诱导人源化的单域抗体表达,用镍离子亲和层析纯化,竞争ELISA和MTT法分别进行结合和中和活性检测.结果 从头搭建并设计合成了人源化的单域抗体,实现了其原核表达,并进行了牛物活性检测;建立了基于人源化的单域抗体的RTA和蓖麻毒素检测方法.结论 研究结果为新型蓖麻毒素小分子拮抗剂的研制奠定了理论和实验基础.     

人MBL-CLR表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素（MBL）胶原样区（CLR）蛋白。方法：应用PCR技术,从含中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增CLR基因片段,将其克隆至pET32a原核表达载体后,转化E.coliBL21（DE3）感受态菌株诱导表达CLR蛋白。通过Ni^2＋-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western blot和ELISA法进行鉴定。结果：从重组质粒pGEM-MBL中扩增到长约180bp的DNA片段。构建的重组表达载体经BamHⅠ和HindⅢ酶切后出现约5900bp和180bp的片段,测序结果同预期的结果完全一致。重组质料在大肠杆菌中诱导表达后,纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳出现Mr约为30000、60000和120000的3条带。Western blot分析表明,3条蛋白带均可与抗His抗体起反应,3条蛋白带对应于融合蛋白的单体和寡聚体。ELISA检测证实,纯化的蛋白能与鼠抗重组人MBL蛋白抗体结合。结论：获得可表达人MBL-CLR的大肠杆菌菌株和重组的人MBL-CLR-Trx融合蛋白,为MBL分子结构、功能关系的进一步研究提供了条件。     

人胱抑素C单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备人胱抑素C(Cystatin C,Cys C)的单克隆抗体(McAb),并建立检测人血清Cys C的颗粒增强透射免疫浊度分析法(PETLA).方法:构建人Cys C的原核表达载体pET32a( )/Cys C,纯化Cys C重组蛋白并免疫BALB/c小鼠,杂交瘤技术制备Cys C的McAb;以自制的McAb包被乳胶颗粒,建立PETIA法测定血清Cys C,并对其分析性能进行初步方法学评价.结果:建立分泌抗Cys C单克隆抗体的杂交瘤细胞株3株,其分泌的McAb为IgG1,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合;将杂交瘤细胞注射于小鼠腹腔,腹水中Cys C McAb效价为1∶4×106;用自制的McAb建立定量测定Cys C的PETIA,方法学评价试验结果证实我们建立的PETIA法,与进口试剂有很好的可比性,具有较满意的方法学性能.结论:成功制备了抗Cys C单克隆抗体,该抗体可用于建立定量检测Cys C的PETIA法.     

人SUMO1蛋白表达纯化及单克隆抗体的制备、鉴定

目的 表达重组人SUMO1(small ubiquitin-related modifier 1)蛋白并制备单克隆抗体.方法 构建含人SUMO1基因的重组表达质粒pET32a-HIS-SUMO1,在大肠杆菌中表达重组蛋白HIS-SUMO1;以纯化后的HIS-SUMO1蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,通过ELISA和Western blot方法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,用免疫双向扩散法鉴定抗体Ig的类型及亚类;取一株筛选细胞按照常规方法制备腹水,利用Millipore抗体纯化试剂盒进行抗体纯化,Western blot方法检测抗体效价.结果 表达纯化了重组人HIS-SUMO1蛋白;3株稳定分泌特异性抗人SUMO1的单克隆抗体杂交瘤细胞株被筛选出,其免疫球蛋白类型均为IgG1类;通过腹水制备和纯化获得效价较高的鼠抗人SUMO1单克隆抗体.结论 通过表达纯化人SUMO1重组蛋白,制备出高效价鼠抗人SUMO1的单克隆抗体,该抗体可用于蛋白质SUMO化的研究.     

EGFRvIII/PEP-3 cDNA与HBcAg重组基因原核表达载体的构建、表达与免疫分析

目的:构建EGFRvIII与HBcAg重组基因的原核表达质粒,进行原核表达、纯化,观察表达蛋白的免疫原性和抗原性。方法:通过双酶切从pGEM-TEasy/PEP-3载体获得编码EGFRvIII突变区的cDNA片段,插入去除了主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/c-PEP-3-c,将重组基因亚克隆于原核表达载体pET28a( )中,通过IPTG诱导蛋白表达,利用Ni2 -NTA亲和层析法对融合蛋白进行纯化;用融合蛋白常规免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清中抗体的滴度。结果:经酶切鉴定、序列测定证实融合基因已插入pET28a( )载体中,融合基因序列与设计序列完全一致。原核表达后表达量占沉淀全菌蛋白的56%,纯化产物占总蛋白的92%,浓度约8g/L。BALB/c小鼠经4次免疫后,其血清中中和抗体的滴度可达1∶16000,第6次免疫后血清中中和抗体的滴度达到1∶2.56×105,抗PEP-3抗体滴度达到1∶1.28×105,抗HBcAg抗体滴度小于1∶4×103。结论:融合基因PEP-3-HBcAg在大肠杆菌中可获得高效表达,表达的融合蛋白可以诱导小鼠产生高滴度和高特异性中和抗体,从而为高表达EGFRvIII恶性肿瘤基因工程疫苗的研究奠定基础。     

抗多囊蛋白1氨基端单克隆抗体的制备和鉴定

目的 :用杂交瘤技术制备抗多囊蛋白 1胞外区氨基端的单克隆抗体 (mAb) ,并对其特异性进行鉴定。方法 :以肾组织总RNA为模板 ,用RT PCR扩增多囊蛋白 1胞外区氨基端的编码基因PKD1cDNA。将该基因克隆到融合蛋白表达载体pQE3 0中 ,转染大肠杆菌M15。以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达多囊蛋白 1胞外区氨基端的组氨酸融合蛋白 (PC1 e2 ) ,用亲和层析法纯化。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠 ,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株Sp2 / 0进行细胞融合 ,间接ELISA筛选阳性克隆 ,有限稀释法进行单克隆化。mAb的特异性用间接ELISA和Westernblot鉴定。结果 :克隆到两个编码多囊蛋白 1氨基端的cDNA片段 (50 2bp和 471bp)。构建的表达质粒经酶切和DNA测序证实 ,为所需要的质粒。表达出相对分子质量 (Mr)分别为 1980 0和 1890 0的融合蛋白 ,经Westernblot鉴定 ,均为多囊蛋白 1的融合蛋白。用Mr 为 1890 0的融合蛋白免疫小鼠 ,得到杂交瘤细胞株 7B1。Westernblot分析表明 ,该细胞株分泌的mAb能特异地与多囊蛋白 1氨基端结合。结论 :本实验表达了PKD1多拷贝区所编码的PC1 e2 ,成功地制备了抗多囊蛋白 1胞外区N端的mAb。