巨噬细胞Coronin-1的表达与非Mtb源性自噬相关性的实验研究

目的:研究巨噬细胞Coronin-1与非Mtb源性细胞自噬的相关性及其可能信号通路。方法:分别构建过表达Coronin-1的p EGFP-C1-Coronin-1质粒和干扰Coronin-1表达的p Genesil-1-Coronin-1质粒,通过G418加压筛选其RAW264.7细胞稳定转染株,即Coronin-1高表达细胞株(RAW264.7-Cor.Plus)和Coronin-1低表达细胞株(RAW264.7-Cor.Minus)。将RAW264.7-Cor.Plus组、RAW264.7组和RAW264.7-Cor.Minus组细胞分别采取完全培养基(空白处理对照)、饥饿、雷帕霉素、环孢素A等因素处理后,通过RT-PCR法检测Beclin-1的基因转录水平,Western blot法检测Coronin-1、LC3BⅡ/LC3BⅠ及Beclin-1的蛋白表达水平。结果:Coronin-1过表达质粒和siRNA质粒均构建成功,其细胞稳定筛选株具有过表达或抑制表达Coronin-1特性。1空白处理三组细胞,Western blot法检测LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值:RAW264.7-Cor.Minus组RAW264.7组RAW264.7-Cor.Plus组;Western blot法检测Beclin-1:RAW264.7-Cor.Minus组RAW264.7组RAW264.7-Cor.Plus组;RTPCR法检测Beclin-1转录水平,趋势同Western blot;2饥饿处理三组细胞,LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值:RAW264.7-Cor.Minus组RAW264.7组RAW264.7-Cor.Plus组;3雷帕霉素处理RAW264.7细胞,其Coronin-1蛋白被显著抑制;雷帕霉素和环孢素A分别处理RAW264.7-Cor.Plus细胞,其LC3BⅡ/LC3BⅠ比值明显较空白处理组高。结论:巨噬细胞Coronin-1与非Mtb源性细胞自噬具有相关性。在营养充足状态下,Coronin-1可抑制细胞自噬;在饥饿状态下,Coronin-1可促进细胞自噬。Coronin-1对自噬的调控可能与m TOR和钙离子信号通路有关。     

消耗还原型谷胱甘肽抑制血管紧张素Ⅱ激活巨噬细胞c-Jun/ATF-2及NF-κB

目的:探讨还原型谷胱甘肽(GSH)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)激活巨噬细胞转录因子c-Jun/ATF-2及NF-κB中的作用。方法:用荧光分光光度法测定细胞内GSH含量;用丁基硫堇硫氧胺(BSO)消耗细胞内GSH;用免疫印迹法测定细胞c-Jun/ATF-2磷酸化表达及NF-κBp65表达;用凝胶滞留法测定细胞NF-κB活性;用细胞免疫组化观察细胞c-Jun/ATF-2磷酸化表达的时间模式。结果:AngⅡ(1μmol/L)刺激30-60min可降低RAW264.7细胞内GSH;而后GSH逐渐适应性恢复。同时,AngⅡ刺激60min,呈剂量依赖性降低RAW264.7细胞内GSH。GSH特异性消耗剂BSO(0.5mmol/L)与RAW264.7细胞共同孵育18h,即可完全消耗细胞内GSH。AngⅡ(1μmol/L)可诱导RAW264.7巨噬细胞c-Jun/ATF-2磷酸化表达;BSO预先完全消耗细胞内GSH,AngⅡ(1μmol/L)不能诱导巨噬细胞c-Jun/ATF-2磷酸化。同样,AngⅡ(1μmol/L)可激活RAW264.7巨噬细胞NF-κB;BSO预先完全消耗细胞内GSH,AngⅡ(1μmol/L)不能激活巨噬细胞NF-κB。结论:还原型谷胱甘肽可能参与调控巨噬细胞转录因子c-Jun/ATF-2及NF-κB的转录活性。     

TLR4基因沉默下调TLR2信号通路在RAW264.7细胞中的抗烟曲霉孢子刺激作用

目的 研究单核巨噬细胞RAW264.7受烟曲霉孢子刺激时,TLR2和TLR4信号通路发挥的作用,以及沉默TLR4基因后,对TLR2信号通路的影响.方法 利用RNAi技术将TLR4-siRNA转染RAW264.7细胞24h后给予烟曲霉孢子刺激12h,将细胞随即分为正常组(N组)、正常+烟曲霉孢子刺激组(N+Af组)、正常+TLR4-siRNA组[TLR4(RNAi)组]、正常+TLR4-siRNA+烟曲霉孢子刺激组[ TLR4(RNAi) +Af组],RT-PCR和Western blot法检测细胞受烟曲霉孢子刺激后TLR2、TLR4、MyD88 mRNA及TNF-α蛋白的表达变化.结果 (1)TLR4基因沉默前:与N组比较,N+Af组TLR2、TLR4、MyD88 mRNA及TNF-α蛋白表达量均显著升高(P＜0.05).(2)TLR4-siRNA( 100nmoL/L)转染RAW264.7细胞,沉默效率达83％.(3)TLR4基因沉默后:与N组比较,TLR4( RNAi)组TLR2、MyD88 mRNA的表达量均显著降低(P＜0.05);与N+Af组比较,TLR4( RNAi)+Af组的TLR2、MyD88 mRNA和TNF-α蛋白的表达量均显著降低(P＜0.05);与TLR4( RNAi)组比较,TLR4(RNAi)+ Af组MyD88 mRNA表达量显著升高(P＜0.05),而TLR2 mRNA及TNF-α蛋白表达量却无显著变化(P＞0.05).结论 RAW264.7细胞受烟曲霉孢子刺激时,TLR2和TLR4信号通路被激活,通过释放促炎细胞因子TNF-α发挥抗烟曲霉孢子刺激作用;当沉默TLR4基因后,TLR2信号通路不能被很好地激活来抵抗烟曲霉孢子对细胞的刺激作用,沉默TLR4基因下调了TLR2信号通路在RAW264.7细胞中的抗烟曲霉孢子刺激作用,可能TLR4较TLR2在抵抗烟曲霉孢子刺激时发挥更重要的作用.     

阿霉素诱导下多发性骨髓瘤细胞中自噬和氧化应激的相互作用

 目的: 探讨阿霉素(doxorubicin,DOX)诱导对多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226细胞内自噬和活性氧簇(reactive oxidative species,ROS)生成的影响及其相互作用关系。方法: 不同浓度阿霉素诱导RPMI-8226细胞24 h,采用Western blot技术检测细胞内beclin 1、LC3等自噬相关蛋白的表达水平。采用DCFH-DA荧光染色法检测RPMI-8226细胞内ROS的水平,荧光显微镜采集图像。采用氧自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)及tempol处理RPMI-8226细胞后,通过Western blot技术检测阿霉素诱导下细胞内beclin 1、LC3等蛋白的表达水平。采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)处理PRMI-8226细胞后,检测阿霉素诱导下细胞内ROS和凋亡的表达水平。结果: RPMI-8226细胞内beclin 1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平呈阿霉素剂量依赖性增加,当阿霉素诱导浓度达2 mg/L时,与对照组比较显著增加(P<0.05)。采用2 mg/L阿霉素处理RPMI-8226细胞,通过荧光显微镜观察,ROS水平较对照组明显增加。氧自由基清除剂NAC和tempol处理RPMI-8226细胞后,beclin 1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平较阿霉素处理组下降。采用自噬抑制剂3-MA处理细胞后,RPMI-8226细胞内ROS和凋亡的水平较阿霉素处理组及对照组增加。结论: 阿霉素能增加RPMI-8226细胞内自噬和ROS的生成,抑制自噬能增加阿霉素诱导下ROS和凋亡的水平,抑制ROS后能减少阿霉素诱导下多发性骨髓瘤细胞中的自噬。     

PARP抑制剂PJ34在绿脓菌素引起的巨噬细胞损伤中的作用

目的:研究多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)抑制剂PJ34对绿脓菌素(Pyocyanin,PCN)引起的腹腔来源巨噬细胞RAW264.7损伤的保护作用。方法:分别采用800nM的PJ34预处理细胞2h(对照组给与0.1% Dimethyl sulfoxide,DMSO)后,不同浓度的PCN(50μM,100μM)刺激24h,MTT法检测绿脓菌素及PJ34对RAW264.7细胞存活率的影响;采用800nM的PJ34预处理细胞2h(对照组给与0.1%DMSO),给与PCN(100μM,3h)刺激,荧光显微镜及流式细胞术检测细胞内活性氧自由基(Reactive oxidant species,ROS)的水平,并采用激光共聚焦显微镜观察RAW264.7细胞内钙离子水平;或加入18μg·mL~(-1)碳颗粒继续共孵育2h,显微镜下观察RAW264.7细胞吞噬碳颗粒的情况。结果:PJ34预处理组细胞与单用PCN处理组比较,细胞存活率提高近20%;PJ34预处理缓解了PCN刺激诱导的RAW264.7细胞内ROS和Ca~(2+)水平的升高(P0.05),并降低了RAW264.7细胞由PCN刺激引起的吞噬功能损伤。结论:PJ34通过抑制PCN引起的RAW264.7细胞内ROS和Ca~(2+)水平升高,提高细胞的存活率并增强细胞的吞噬功能。     

沉默HDAC6对嗜肺军团菌干扰RAW264.7自噬作用的影响

目的 以嗜肺军团菌感染HDAC6基因沉默的RAW264.7细胞为研究对象,检测自噬流及自噬相关因子表达水平的变化,探究HDAC6在嗜肺军团菌干扰巨噬细胞自噬中的作用机制。方法 利用RNAi技术介导基因沉默,构建shRNAHDAC6细胞,Western blot验证沉默效果。用嗜肺军团菌活菌和灭活菌[感染复数(MOI)=50]分别感染RAW264.7、sh-NC、shRNA-HDAC6细胞6、12、24 h。应用自噬双标质粒pmCherry-C1-EGFP-LC3B检测巨噬细胞自噬流的变化;透射电镜观察嗜肺军团菌感染24 h后各组细胞内的自噬小体和自噬溶酶体;实时荧光定量PCR及Western blot法检测AMBRA1、ATG9B、P62、Beclin1、α-tubulin、LC3B的表达水平。结果 与RAW264.7对照组相比,shRNA-HDAC6细胞的HDAC6蛋白表达水平显著降低(P<0.05);自噬双标质粒检测自噬流结果显示,嗜肺军团菌活菌及灭活菌感染RAW264.7细胞,自噬流均减弱,沉默HDAC6后嗜肺军团菌感染巨噬细胞自噬流增加。透射电镜可观察到嗜肺军团菌感染巨噬...     

睾酮对结核分枝杆菌感染的RAW264.7细胞自噬的影响

目的探讨睾酮对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染的鼠源巨噬细胞RAW264.7细胞自噬的影响及其分子机制。方法 MTB感染RAW264.7细胞24 h后,给予10~(-8)mol/L睾酮处理24 h;采用透射电镜观察细胞自噬情况,Western blot法检测细胞自噬相关蛋白以及MAPKs信号通路蛋白。结果睾酮干预MTB感染的RAW264.7细胞后自噬体、自噬特异标志物LC3Ⅱ均明显增加(P0.01),通路蛋白JNK磷酸化水平明显上调(P0.001)。结论睾酮可能通过激活JNK信号通路诱导MTB感染的RAW264.7细胞自噬。     

oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物通过激活AKT通路抑制小鼠RAW264.7细胞自噬

目的探讨氧化低密度脂蛋白/β2糖蛋白I/抗β2糖蛋白I抗体(oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体)复合物对RAW264.7小鼠巨噬细胞自噬的影响及机制。方法分别用培养基、 oxLDL、 oxLDL/β2GPI复合物、 oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物、 oxLDL/抗β2GPI抗体复合物和β2GPI/抗β2GPI抗体复合物处理RAW264.7细胞。采用Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、 P62的蛋白水平,采用携带双荧光蛋白和LC3基因的腺病毒(mRFP-GFP-LC3)感染巨噬细胞检测自噬体形成以及自噬流情况,采用蛋白激酶B(AKT)通路抑制剂LY294002 (50μmol/L)预处理,观察AKT通路在oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物介导的RAW264.7细胞自噬中的作用。结果 oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物能够降低LC3Ⅱ蛋白水平,减少自噬体数量,增加P62蛋白水平,阻断自噬流; LY294002预处理可部分恢复细胞自噬水平,改善自噬流阻断情况。结论oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物可以通过激活AKT通路抑制RAW264.7细胞的自噬。     

LC3-LpqH自噬靶向性抗结核DNA疫苗的制备

目的制备结核杆菌脂蛋白抗原前体LpqH基因与微管相关蛋白轻链3(LC3)基因融合的抗结核DNA疫苗,探究其诱导与靶向自噬的效应。方法构建pCMV-LpqH与pCMV-LC3-LpqH重组质粒并转染RAW264.7细胞,免疫印迹法检测LC-3与LC3-LpqH的表达。转染pCMV-LpqH或pCMV-LC3-LpqH至GFP-LC3-RAW264.7细胞,免疫荧光法观察LC3-LpqH蛋白的定位。结果细胞转染pCMV-LpqH后LC-3表达水平增高。pCMV-LC3-LpqH在RAW264.7细胞的表达水平与质粒浓度呈剂量依赖性,并且LC3-LpqH与GFP-LC3体外表达后共定位于自噬体上。结论 pCMV-LC3-LpqH的表达能够增强自噬,并将LpqH抗原靶向定位于自噬体,为设计新型抗结核疫苗提供了新思路。     

稳定表达RFP-GFP-LC3的RAW264.7细胞株的建立

目的建立能够稳定表达红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-微管相关蛋白轻链3(RFP-GFP-LC3)的小鼠RAW264.7巨噬细胞。方法构建含RFP-GFP-LC3基因的慢病毒重组质粒载体,将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,收集病毒上清后感染RAW264.7细胞。经嘌呤霉素筛选获得稳定表达RFP-GFP-LC3的RAW264.7细胞株,用荧光显微镜和流式细胞术分析感染效率。饥饿处理稳定感染细胞,荧光显微镜下观察RFP-GFP-LC3斑点。结果成功构建了慢病毒p LV-CMV-RFPGFP-LC3,经感染和嘌呤霉素筛选获得稳定表达RFP-GFP-LC3的RFP-GFP-LC3-RAW264.7细胞;荧光显微镜和流式细胞术显示RFP和GFP荧光率均达到100%,饥饿处理后自噬斑点显著增多。结论成功建立稳定表达RFP-GFP-LC3的RAW264.7细胞株,为自噬研究建立了可靠细胞平台。     

RIPK2介导自噬对高糖诱导的小鼠肾系膜细胞ROS、caspase-1及IL-1β表达的激活作用

目的观察受体结合丝氨酸/苏氨酸激酶2(RIPK2)介导自噬对高糖诱导的肾系膜细胞(GMCs)ROS、caspase-1及IL-1β表达的调控。方法体外培养正常小鼠GMCs,高糖作为刺激因子,设计siRNA靶向沉默RIPK2表达并构建自噬双荧光(mRFP-GFP-LC3)标记体系,激光共聚焦显微镜观察自噬流变化;DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平;Western blot及RT-PCR检测RIPK2、LC3Ⅱ/Ⅰ、caspase-1、IL-1β蛋白及mRNA表达;ELISA检测IL-1β的分泌。结果 1)高糖呈时间-浓度依赖性增加细胞内ROS水平,诱导caspase-1和IL-1β表达(P0.05)。2)短期(0~12 h)高糖刺激可诱导RIPK2和LC3Ⅱ/Ⅰ表达(P0.05),超过12 h后RIPK2和LC3Ⅱ/Ⅰ表达下调(P0.05)。3)siRNA靶向沉默RIPK2下调LC3Ⅱ/Ⅰ表达和细胞自噬流形成,上调细胞内ROS、caspase-1及IL-1β表达(P0.05)。结论 RIPK2介导自噬负性调控高糖诱导的ROS、caspase-1及IL-1β表达,可能是防治糖尿病肾脏疾病(DKD)的新思路。     

嗜肺军团菌激活Nrf2-Keap1通路抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞自噬

目的观察嗜肺军团菌(LP)对RAW264.7巨噬细胞自噬流及其自噬相关因子表达水平的影响并探讨其作用机制。方法活的LP和灭活的LP[感染复数(MOI)=10, 50, 100]分别处理RAW264.7巨噬细胞1、 2、 3 h,通过筛选得出MOI=50,处理2 h为其最佳作用条件。用雷帕霉素(RAPA)处理RAW264.7巨噬细胞12 h后,再加入活的和灭活的LP共培养2 h,并设正常对照组、 RAPA处理组、活LP组、 RAPA处理的活LP组、灭活LP组和RAPA处理的灭活LP组。用携带双荧光标记蛋白基因和微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)基因的真核过表达质粒pmCherry-C1-EGFP-LC3B转染巨噬细胞,监测巨噬细胞自噬流的变化;用基因芯片在处理的最佳时间点筛选出LP影响巨噬细胞自噬的相关因子溶酶体/内体膜跨膜蛋白封闭蛋白(CLN3)、组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)、 G蛋白信号传导调节蛋白19(RGS19)、肿瘤坏死因子(TNF)、组织蛋白酶B (CTSB)、 GABA A型受体相关蛋白类似物2(GABARAPL2)、 P62、微管相关蛋白1轻链3(LC3);实时荧光定量PCR验证基因芯片结果并检测相关信号通路因子核因子E2相关因子2(Nrf2)、 beclin1和Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)的mRNA水平; Western blot法验证基因芯片结果并检测Nrf2、 beclin1和Keap1的蛋白水平。结果与对照组相比,活LP组和灭活LP组的自噬流受到抑制;与RAPA处理组相比,活LP组和灭活LP组自噬流受到抑制。基因芯片检测显示活LP组和灭活LP组LC3的表达下调, P62的表达上调。实时定量PCR、 Western blot验证结果与基因芯片一致。Keap1、 beclin1的mRNA和蛋白水平明显下降, Nrf2 mRNA和蛋白的水平明显增加。结论 LP可抑制巨噬细胞自噬,可能与激活Nrf2-Keap1信号通路有关。     

氧化低密度脂蛋白通过CD36介导的氧化应激诱导巨噬细胞自噬

目的:研究氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)对巨噬细胞自噬的诱导作用,并探讨可能的分子机制。方法:体外培养RAW264.7巨噬细胞,给予抗CD36单克隆抗体(2 mg/L)、二亚苯基碘鎓(diphenyleneiodonium,DPI;5μmol/L)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA;3 mmol/L)或雷帕霉素(1μmol/L)预处理1 h,再加入ox-LDL(100 mg/L)继续培养12 h。采用MTT法检测细胞活力,采用相应试剂盒测定培养液乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性以及活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,以评价细胞膜完整性和氧化应激反应。采用免疫印迹技术检测自噬标志分子beclin-1和微管相关蛋白1轻链3-II(microtubule-associated protein 1 light chain 3-II,LC3-II)表达变化。结果:ox-LDL诱导巨噬细胞自噬反应,表现为beclin-1和LC3-II上调;与自噬抑制剂3-MA相似,抗CD36单抗可显著抑制ox-LDL所诱导的LC3-II和beclin-1表达。抗CD36单抗明显抑制ox-LDL所诱导的氧化应激,包括抑制NADPH氧化酶活性和ROS、MDA水平以及升高SOD活性,其作用与NADPH氧化酶抑制剂DPI相似。另外,DPI显著抑制ox-LDL所诱导的beclin-1和LC3-II表达,且ox-LDL所诱导的细胞活力降低和LDH漏出可被3-MA促进并可被自噬诱导剂雷帕霉素拮抗。结论:ox-LDL可诱导巨噬细胞自噬,其机制可能与CD36介导ox-LDL摄取进而触发的氧化应激有关,且一定程度的自噬可减轻ox-LDL所诱导的巨噬细胞损伤。     

自噬抑制剂巴弗洛霉素A1对巨噬细胞极化的影响

目的:探讨自噬下游抑制剂巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1,Baf A1)对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7极化的影响。方法:用Baf A1作用于小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,酶联免疫吸附实验检测M1/M2极化相关细胞因子的含量;流式细胞术检测细胞表面M1/M2极化相关标志物;免疫荧光观察自噬小体形成情况;Western blot检测自噬相关蛋白水平变化。结果:Baf A1处理后,RAW264.7细胞分泌的促炎性细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)显著增高(P0.01),而抑炎性细胞因子IL-10和IL-13的含量变化无显著差异。Baf A1处理的细胞表面标志物中CD197和HLA-DR(M1标志物)双阳性率与对照组相比显著升高(P0.05),说明Baf A1可以诱导巨噬细胞向M1方向极化。免疫荧光结果显示,Baf A1处理后细胞自噬小体显著增多(P0.05)。Western blot结果显示Baf A1处理后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达显著升高(P0.05),而P62蛋白表达无显著差异。在自噬激活剂雷帕霉素处理组中,自噬体同样显著增多(P0.05),但P62蛋白表达显著降低(P0.05)。结论:巴弗洛霉素A1可以诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7向M1方向极化,可能与其抑制自噬下游自噬溶酶体的形成有关。     

miR-142-3p 靶向ATG4c 调控RAW264.7 巨噬细胞自噬

目的:研究miR-142-3p 对自噬相关基因ATG4c 的靶向调控作用,探究miR-142-3p 影响RAW264.7 细胞自噬途径的作用机制。方法:生物信息学软件分析miR-142-3p 的靶基因为ATG4c,构建pMIR-Report-ATG4c 和pMIR-Report-ATG4c mut 重组质粒,双荧光素酶报告系统、qRT-PCR、Western blot 验证miR-142-3p 与ATG4c 的靶向作用;将做不同处理的RAW264.7 细胞分为4 组:正常细胞作为对照、50 ng/ ml 雷帕霉素作用2 h、EBSS 饥饿作用12 h、10 nmol/ L 的3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用12 h 后,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-142-3p 不同干预组中的相对表达情况;将miR-142-3p mimics、miR- 142-3p inhibitor 及miR-142-3p control 分别转染到RAW264.7 细胞中,检测miR-142-3p 和LC3域的相对表达。结果:双荧光素酶报告系统、qRT-PCR、Western blot 验证miR-142-3p 通过靶向作用于ATG4c 的3忆-UTR 抑制其表达;与对照组相比,雷帕霉素和饥饿处理的RAW264.7 细胞miR-142-3p 明显上调,而3-MA 处理组miR-142-3p 明显下调;与miR-142-3p control 组相比,转染miR-142-3p mimics 组中LC3域蛋白表达显著下调,而miR-142-3p inhibitor 组中表达显著上调。结论:miR-142-3p 通过靶向调控自噬相关基因ATG4c,参与RAW264.7 小鼠巨噬细胞自噬的调控。     

结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶(SapM)抑制小鼠巨噬细胞自噬

目的研究结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶(Sap M)对小鼠巨噬细胞自噬的影响。方法分别用Sap M、渥曼青霉素、饥饿处理GFP-LC3-Raw264.7细胞。荧光显微镜下观察自噬体的形成,Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ水平;再用Sap M处理GFP-LC3-Raw264.7细胞后加氯喹,Western blot法检测LC3Ⅱ水平。结果 Sap M和饥饿均导致GFP-LC3斑点增多和LC3Ⅱ水平增高,在Sap M处理的细胞中加入氯喹并没有引起LC3Ⅱ的进一步升高。结论 Sap M可阻断自噬体与溶酶体的融合,从而抑制小鼠巨噬细胞自噬。     

miR-144通过靶向Atg4a调控卡介苗和雷帕霉素诱导的RAW264.7细胞自噬

目的研究卡介苗(BCG)对RAW264.7细胞中与细胞自噬相关的miRNA(miR-21、miR-181a、miR-155和miR-144)表达的影响,并以miR-144为研究对象,验证miR-144对自噬相关基因Atg4a的靶向调控关系,探究其在结核分枝杆菌感染宿主细胞过程中调控细胞自噬途径的作用机制。方法分别对RAW264.7巨噬细胞进行饥饿处理12 h、50 ng/m L雷帕霉素作用2 h、10 nmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用12 h;BCG刺激RAW264.7巨噬细胞12 h、24 h、48 h后,收集细胞,提取总RNA;利用实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-21、miR-181a、miR-155及miR-144的表达水平;构建p MIR-Report-Atg4a及p MIR-ReportAtg4a mut重组质粒,利用双萤光素酶报告系统、qRT-PCR及Western blot法验证miR-144与Atg4a的靶向作用关系。结果 BCG刺激RAW264.7巨噬细胞后,可使miR-21、miR-155及miR-144表达上调,miR-181a表达下调;经雷帕霉素诱导的细胞自噬,4种miRNA表达量与正常组相比分别上调约64倍、52倍、14倍、1倍;与正常组相比,3-MA处理细胞组,miR-21、miR-144、miR-155、miR-181a的表达量分别下调1.22倍、1.05倍、1.54倍及12.5倍;双萤光素酶报告系统及Western blot法证实,miR-144可靶向作用于Atg4a-3'UTR并抑制其表达。结论 miR-144可靶向抑制自噬相关基因Atg4a的表达,参与调控RAW264.7巨噬细胞的自噬过程。     

埃索美拉唑抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞产生NO和PGE_2

目的研究埃索美拉唑对LPS诱导RAW 264.7小鼠巨噬细胞一氧化氮(nitric oxide,NO)和前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的影响。方法体外培养小鼠巨噬细胞RAW 264.7,LPS刺激前先用15μg/ml埃索美拉唑处理2 h,ELISA检测NO和PGE2的产生。荧光分光光度计检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生;RT-PCR检测P-ATP的表达情况;比色法测定NADPH氧化酶活性。结果埃索美拉唑能显著抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞产生NO和PGE2,但对P-ATP酶的表达无明显影响。此外,埃索美拉唑也能显著抑制ROS的产生,并抑制NADPH氧化酶活性。NADPH氧化酶抑制剂DPI可减少NO和PGE2水平,ROS抑制剂NAC处理能抑制NO的产生。结论埃索美拉唑通过抑制NADPH氧化酶活性以及ROS产生从而抑制LPS诱导RAW 264.7细胞分泌NO。虽然埃索美拉唑也能抑制PGE2产生,但与ROS关系不大。     

埃索美拉唑抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞产生NO和PGE_2

目的研究埃索美拉唑对LPS诱导RAW 264.7小鼠巨噬细胞一氧化氮(nitric oxide,NO)和前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的影响。方法体外培养小鼠巨噬细胞RAW 264.7,LPS刺激前先用15μg/ml埃索美拉唑处理2 h,ELISA检测NO和PGE2的产生。荧光分光光度计检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生;RT-PCR检测P-ATP的表达情况;比色法测定NADPH氧化酶活性。结果埃索美拉唑能显著抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞产生NO和PGE2,但对P-ATP酶的表达无明显影响。此外,埃索美拉唑也能显著抑制ROS的产生,并抑制NADPH氧化酶活性。NADPH氧化酶抑制剂DPI可减少NO和PGE2水平,ROS抑制剂NAC处理能抑制NO的产生。结论埃索美拉唑通过抑制NADPH氧化酶活性以及ROS产生从而抑制LPS诱导RAW 264.7细胞分泌NO。虽然埃索美拉唑也能抑制PGE2产生,但与ROS关系不大。     

雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤对RAW264.7细胞中8种miRNAs表达的影响

目的探究雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)处理对RAW264.7细胞中miR-181c,miR-101b和miR-1192等8种自噬相关miRNAs的表达水平,为研究miRNAs在细胞自噬中的功能提供理论基础。方法生物信息学预测分析与细胞自噬相关的miRNAs并构建miRNAs调控细胞自噬的网络图;分别用Rapa和3-MA对RAW264.7细胞做不同条件处理,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测不同条件处理后RAW264.7细胞中miR-181b、miR-181c、miR-101b、miR-1192、miR-362-3p、miR-590-3p、miR-875-5p和miR-335-5p的相对表达量。结果生物信息学预测结果显示8种miRNAs可能分别靶向作用于细胞自噬通路中多个关键蛋白,对细胞自噬起到促进或抑制作用;与正常对照组相比,miR-181c、miR-101b、miR-1192、miR-362-3p、miR-335-5p、miR-875-5p在Rapa处理RAW264.7细胞组中表达显著下调(P0.05),而在3-MA处理组则都显著上调(P0.05);miR-181b在Rapa组表达显著上调,在3-MA组表达下调(P0.05);miR-590-3p在Rapa组和3-MA组都无显著性变化(P0.05)。结论 miR-181c、miR-101b等7种miRNAs可能在RAW264.7巨噬细胞自噬过程中发挥重要调控作用。