Activation of TLRs/NF-κB signal pathway and occurrence of different functional cytokines during invasive pulmonary aspergillosis

Objective To study the activation of TLRs/NF-κB signal pathway and production of different functional cytokines during invasive pulmonary aspergillosis( IPA) , in order to probe the pathogene-sis of IPA. Methods Mouse were randomly divided into normal, normal + inoculated with Aspergillus fumigatus( normal inoculation group), and immune suppression + inoculation with Aspergillus fumigatus (IPAmodel group) , the mouse were killed at different time points after inhaling Aspergillus fumigatus spores by nose. Removing the lung tissue in a sterile manner and making pathological section respectively, counting Aspergillus fumigatus colony, dynamiclly detecting the expression of TLR2, TLR4 mRNA, variation of NF-κB p65 protein, pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and anti-inflammatory cytokines IL-10 levels in the lung tissue by RT-PCR and Western blot method during Aspergillus fumigatus infection in mouse. Results (1) When it's 72 h after inhaling Aspergillus fumigatus by nose, IPA model emerged severe lung tissue inflammation, and generated a large number of hyphae, meanwhile, burthen of Aspergillus fumigatus was higher than normal inoculation group at each time point. (2)Compared with the normal inoculation group, IPA group whose TLR2 mRNA was low expression at early stage of infection (24 h), and emerged high expression at late stage of infection (120 h, 144 h); and TLR4 mRNA has been at a state of low expression in the infection process; NF-κB p65 suddenly increased at early stage of infection(24 h) and then continued to decline. (3) After infected by Aspergillus fumigatus in normal mouse, proinflammatory cytokine TNF-α, IL-1β in lung exhibited high expression at the early stages of infection, and the highest expression levels appeared at 48 h or 72 h, then decreased and recovered to normal level. And the expression level of anti-inflammatory cytokine IL-10 rised at late stage of infection; The IP A mouse released a lot of anti-inflammatory cytokine IL-10 at early stage of infection, which significantly reduced at late stage, and released pro-inflammatory cyto-kines TNF-α, IL-1β at slow and low level. Conclusion The abnormal activation of TLRs/NF-β signaling pathway caused the loss of dynamic balance between pro-inflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines, leading to the occurrence and development of IPA.     

TLR4基因沉默下调TLR2信号通路在RAW264.7细胞中的抗烟曲霉孢子刺激作用

目的 研究单核巨噬细胞RAW264.7受烟曲霉孢子刺激时,TLR2和TLR4信号通路发挥的作用,以及沉默TLR4基因后,对TLR2信号通路的影响.方法 利用RNAi技术将TLR4-siRNA转染RAW264.7细胞24h后给予烟曲霉孢子刺激12h,将细胞随即分为正常组(N组)、正常+烟曲霉孢子刺激组(N+Af组)、正常+TLR4-siRNA组[TLR4(RNAi)组]、正常+TLR4-siRNA+烟曲霉孢子刺激组[ TLR4(RNAi) +Af组],RT-PCR和Western blot法检测细胞受烟曲霉孢子刺激后TLR2、TLR4、MyD88 mRNA及TNF-α蛋白的表达变化.结果 (1)TLR4基因沉默前:与N组比较,N+Af组TLR2、TLR4、MyD88 mRNA及TNF-α蛋白表达量均显著升高(P＜0.05).(2)TLR4-siRNA( 100nmoL/L)转染RAW264.7细胞,沉默效率达83％.(3)TLR4基因沉默后:与N组比较,TLR4( RNAi)组TLR2、MyD88 mRNA的表达量均显著降低(P＜0.05);与N+Af组比较,TLR4( RNAi)+Af组的TLR2、MyD88 mRNA和TNF-α蛋白的表达量均显著降低(P＜0.05);与TLR4( RNAi)组比较,TLR4(RNAi)+ Af组MyD88 mRNA表达量显著升高(P＜0.05),而TLR2 mRNA及TNF-α蛋白表达量却无显著变化(P＞0.05).结论 RAW264.7细胞受烟曲霉孢子刺激时,TLR2和TLR4信号通路被激活,通过释放促炎细胞因子TNF-α发挥抗烟曲霉孢子刺激作用;当沉默TLR4基因后,TLR2信号通路不能被很好地激活来抵抗烟曲霉孢子对细胞的刺激作用,沉默TLR4基因下调了TLR2信号通路在RAW264.7细胞中的抗烟曲霉孢子刺激作用,可能TLR4较TLR2在抵抗烟曲霉孢子刺激时发挥更重要的作用.     

灵雷菌质对阿霉素诱导大鼠肾病模型的作用

目的 考察灵芝双向固体发酵雷公藤得到的灵雷菌质 (G30) 对阿霉素诱导的大鼠肾病模型的作用。方法 尾 iv 阿霉素 6.5 mg/kg 复制大鼠肾病模型,分别给予不同剂量的 G30、雷公藤生药、灭菌生药 (灭菌药) 及雷公藤多苷两周,检测大鼠体质量、24 h 尿蛋白量、血清总蛋白 (TP)、总胆固醇 (TC)、甘油三酯 (TG)、丙氨酸转氨酶 (ALT)、天冬氨酸转氨酶 (AST)、血清尿素氮 (BUN)、血清肌酐 (SCr)、血清肌酸激酶 (CK)、肌酸激酶同工酶 (CK-MB) 等生化指标。结果 与模型组比较,G30 增加肾病大鼠体质量,降低 24 h 尿蛋白、血清 TG、TC 量,同时升高血清 TP 水平 (〖WTBX〗P ＜0.05);与生药组比较：G30降低肾病大鼠 24 h 尿蛋白、血清 BUN、SCr,同时使血清 CK、ALT 量保持正常水平,光镜下显示 G30 减轻了肾病大鼠的肾小球充血及空泡样变性等病理变化。结论 G30 对阿霉素诱导的肾病有一定的治疗作用,与雷公藤生药比较毒性低、效果好。     

灵雷菌质对大鼠类风湿性关节炎作用的实验研究

 目的 考察灵雷菌质对佐剂型类风湿性关节炎（adjuvant arthritis,AA）大鼠的治疗作用。方法 建立弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant,CFA)诱导的大鼠类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA) 模型,将大鼠分为空白组、灵雷菌质高剂量给药组、灵雷菌质低剂量给药组、雷公藤多苷片给药组、模型组,连续灌胃给药2周后,检测各组大鼠的体重、关节肿胀度、关节炎指数、关节病理变化、血清肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素（IL）-1β。结果 灵雷菌质能改善大鼠一般状况并提高AA大鼠体重,缓解AA大鼠关节红肿程度,降低其关节炎指数,改善RA大鼠的关节病理变化,显著抑制TNF-α和IL-1β的表达。结论 灵雷菌质对佐剂型关节炎有一定的治疗作用。     

雷公藤提取物重复剂量给药对大鼠胰腺组织的病理损伤北大核心CSCD

目的观察雷公藤对大鼠胰腺组织的病理损伤。方法参照长期毒性实验方法,将清洁级SD大鼠随机分成4组,即空白对照组、0.04 g/kg组、0.16 g/kg组和0.64 g/kg组。连续灌胃(ig)不同剂量雷公藤95%乙醇提取物3个月,取胰腺;0.64 g/kg组分别于用药30和90 d后及停药30 d后取胰腺组织,采用光学显微镜及透射电镜技术动态观察胰腺组织的病理结构变化,采用连续检测法测定各时间点血清淀粉酶含量。结果 0.04 g/kg组用药90 d后大鼠胰腺散在淋巴细胞增多,个别细胞胞浆空亮;0.16 g/kg组用药90 d后胰岛体积大,纤维增生;0.64 g/kg组用药90 d后,细胞胞浆空亮,间质纤维增生;0.64 g/kg组用药30 d后细胞水肿,小灶炎细胞浸润,线粒体肿胀;0.64 g/kg组停药30 d后胰腺内有红色分泌物潴留,纤维组织增生,伴淋巴细胞浸润,细胞线粒体肿胀、空泡化。0.64 g/kg组给药30和90 d和停药30 d后的血液淀粉酶水平无显著的上升或下降。结论雷公藤可引起大鼠胰腺组织的病理损伤,并随给药剂量加大和时间延长损伤加重且呈不可逆性。     

四逆散对蛋氨酸-胆碱缺乏饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝炎的研究

目的 研究四逆散对蛋氨酸-胆碱缺乏（methionine-choline-deficient,MCD）饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝炎的作用及机制。方法 通过MCD饮食诱导小鼠非酒精性脂肪肝炎模型,并同时预防性给药普罗布考及四逆散4周,HE染色观察各组小鼠肝组织病理改变;检测小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、三酰甘油（TG）、含量以及肝脏组织TG、丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力。结果 四逆散高剂量组小鼠血清ALT、AST均有下降,血清中TG含量升高,且肝脏TG含量降低;病理观察显示四逆散高剂量组小鼠肝细胞内脂肪空泡减少,炎性细胞浸润减少;同时肝组织SOD活力增加,MDA含量降低。结论 高剂量四逆散对MCD饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝炎有预防作用,其主要通过调节血清和肝脏TG的分布,增加肝组织抗氧化能力,减少体内过氧化物损害来实现。     

烟曲霉菌感染小鼠肺组织中NOD1信号通路的激活

目的研究天然免疫NOD1信号通路在烟曲霉菌感染小鼠肺组织中是否得以激活。方法小鼠分为正常对照组和感染组,感染组小鼠经鼻滴入烟曲霉菌孢子24 h、48 h、72 h后分别处死,碾碎肺组织平板培养以检测其肺组织烟曲霉菌负荷,观察肺组织病理学改变,RT-PCR检测NOD1及RIP2 mRNA表达量、Western Blot检测胞核NF-κBp65和胞浆TNF-α在小鼠肺组织中的含量。结果①感染组小鼠肺组织48 h时Af负荷达最高且可见严重的充血和出血,有大量的炎症细胞浸润,72 h时Af负荷迅速下降且未见菌丝形成,仅见轻微的充血、出血和炎症反应;正常组烟曲霉菌培养阴性且肺组织结构正常;②RT-PCR及Western Blot结果显示:感染组小鼠肺组织各时相点NOD1 mRNA、RIP2 mRNA、NF-κBp65和TNF-α的表达量均明显高于正常对照组(P<0.05),前三者均在48 h表达最高,TNF-α在72 h表达最高(P<0.05)。结论NOD1信号通路在烟曲霉菌感染的小鼠肺组织中得以活化,其介导的天然免疫对抗烟曲霉菌感染和保护小鼠肺组织起了一定的作用。     

MPO及TNF-α在小鼠侵袭性肺曲霉病中的作用

烟曲霉菌是自然界广泛存在的腐生致病菌,易导致免疫力低下患者发生严重且致死性的侵袭性肺曲霉病(IPA).通过建立小鼠侵袭IPA模型,探讨髓过氧化物酶(MPO)及TNF-α在侵袭IPA中的作用,为阐明IPA的发病机制提供资料.     

灵芝双向发酵雷公藤的解毒持效作用

目的 研究灵芝双向发酵对雷公藤的解毒持效作用.方法 运用双向发酵工程的原理和方法 获得灵雷菌质(G30),用常规急性毒性试验,免疫学试验、自身免疫疾病动物模型试验等进行G30的毒性和药效学研究.结果 G30的LD_(50)较雷公藤生药组显著提高,并且能抑制小鼠T、B淋巴细胞的增殖和血清溶血素的分泌;G30降低阿霉素诱导的肾炎大鼠的24 h尿蛋白量,同时改善肾炎大鼠的多项生化指标,且对各脏器的毒性要小于雷公藤生药;G30缓解佐剂性类风湿关节炎大鼠的足肿胀度,并改善大鼠的生存状况.结论 灵芝与雷公藤构成发酵组合所产灵雷菌质G30毒性降低并仍然保持免疫抑制作用,对佐剂性类风湿关节炎及阿霉素诱导的大鼠肾炎均有一定的治疗作用.显示双向发酵对雷公藤解毒持效是一条可行的途径.     

柠檬醛对小鼠侵袭性肺曲霉病的作用

目的 研究中药活性成分柠檬醛对实验小鼠侵袭性肺曲霉病(IPA)的作用.方法 小鼠随机分成正常组,正常+接种烟曲霉菌组.IPA模型组,IPA+不同剂量(高、中、低3个剂量)柠檬醛给药组及阳性对照组.建立IPA模型后,ip给药不同剂量柠檬醛,阳性对照组ig酮康唑,连续7 d,第8天处死各组小鼠,分别取肺、脾、肝、肾组织行烟曲霉菌培养和观察病理损伤;同时另取各用药组和IPA模型组15只小鼠做生存实验.结果 中、高剂量柠檬醛治疗的IPA小鼠各脏器烟曲霉菌落数均低于IPA模型小鼠,且烟灰色色素明显减少;病理结果显示IPA模型小鼠肺组织可见大量菌丝,炎症细胞浸润.病理损伤明显;中、高剂量柠檬醛组肺组织未见菌丝.生存试验表明柠檬醛中、高剂量组小鼠的生存率和生存质量明显优于未用药组.结论 柠檬醛可缓解IPA小鼠的肺组织病理损伤,明显减缓IPA的发展.