6种miRNAs在类风湿关节炎患者外周血及关节液中的表达分析

目的:探讨miR-16、miR-17、miR-30a等6种miRNAs在类风湿关节炎(RA)患者外周血血浆、单个核细胞(PBMC)及关节液中的表达水平及其临床意义,为进一步研究其在RA中的作用机制提供理论依据。方法:收集80例RA患者、32例骨关节炎(OA)患者及32例健康人外周血、关节液,分离血浆及PBMC;提取small RNA,用特异性茎环引物反转录成c DNA,构建成熟miRNAs的T载体,绘制标准曲线;stem-loop法Real-time PCR检测血浆、PBMC及关节液miRNAs的表达量,进行相关性分析;并与RA活动性监测指标类风湿因子(RF)、血沉(ESR)、C-反应蛋白(CRP)进行相关性分析。结果:RA组血浆、PBMC和关节液中miR-16、miR-17、miR-30a、miR-106 miR-101和miR-130相对于OA组、健康对照组表达上调(P<0.05),但血浆中miR-101的表达水平与OA组差异无统计学意义。相关性分析显示,6种miRNAs在血浆、PBMC及关节液中有不同程度的正相关(P<0.05)。与RF、ESR、CRP相关分析显示,血浆、PBMC和关节液中miRNAs与一个或多个指标正相关(P<0.05)。结论:miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130在RA患者血浆、PBMC及关节液中有显著变化,表明这些miRNAs可能通过调控某些相关基因在RA的发病过程中发挥重要作用;其表达水平可作为RA疾病活动的有效检测指标,为RA提供新的诊断标志物。     

OPN siRNA慢病毒载体的构建及其对大肠癌细胞增殖的抑制作用

目的构建OPN-siRNA的慢病毒载体,探讨其对结肠癌SW480细胞增殖的调节作用。方法设计合成针对OPN的siRNA序列,退火形成双链DNA并克隆到pSicoR质粒后,包装重组慢病毒。应用Real-time PCR及Western blot检测病毒刺激SW480细胞后OPN的mRNA和蛋白的表达水平,应用MTT法检测慢病毒对SW480细胞增殖的调节作用。结果成功构建了携带OPN-siRNA的重组慢病毒。该重组慢病毒可使SW480细胞内OPN的mRNA和蛋白的表达降低,LV-siRNA-OPN慢病毒对SW480细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.05)。结论成功构建的LVsiRNA-OPN慢病毒可以有效抑制SW480细胞内OPN的mRNA和蛋白表达,并抑制SW480细胞的增殖。     

医学检验专业实验教学模式改革

医学检验是一门发展迅速、多技术、多学科交叉的实践性很强的学科。其新的培养目标提出"本专业培养具有基础医学、临床医学、医学检验等方面的基本理论知识和基本能力的从事医学检验、医学类实验室工作的医学高级专门人才"。但是,由于受应试教育和现行的"单学科叠加式"模式的影响,使医学检验专业教学中存在重理论教学、轻实践教学、轻技能培训,不利于培养学生的创新能力和创新思维。为了促使学生从知识型向能力型、从模仿型向创新型、从单一型向复合型转变,本文提出"多学科渗透式"实验课程教学模式改革。     

SCCmecⅢ型MRSA诱导SD大鼠肺泡巨噬细胞凋亡的研究

目的研究SCCmecIII型耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）诱导SD大鼠肺泡巨噬细胞（AM）凋亡的能力。方法荧光显微镜和流式细胞仪分别用于观察和检测MRSA感染AM 2h、6h和12h后Annexin V-FITC/PI染色的凋亡细胞形态和凋亡率,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测凋亡相关基因。结果 AM在MRSA感染后6h和12h时凋亡率与对照组相比差别均有统计学意义（P〈0.01）;感染12h时凋亡相关基因Apaf-1、caspase-9和Bax表达显著上调,Bcl-2mRNA表达显著下调（P〈0.05）。结论 MRSA可通过线粒体通路经多基因参与诱导AM凋亡;AM凋亡的研究可为MRSA肺部感染时AM凋亡分子机制的进一步研究提供基础。     

抗人CD20纳米抗体的筛选、表达及特性分析

目的筛选出抗人CD20纳米抗体序列,并获得具有高亲和力与特异性的抗CD20-人IgG Fc纳米抗体。方法利用天然噬菌体纳米抗体库,以生物素化的CD20抗原为靶标进行4轮液相亲和筛选,采用ELISA鉴定阳性克隆;将筛选到的阳性克隆基因序列与人IgG Fc片段偶联,构建到原核表达载体pCZN1中,并转化至大肠杆菌Arctic Express,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)低温诱导重组蛋白的表达,利用Ni柱进行亲和纯化;ELISA和Western blot法鉴定纯化产物。结果筛选得到了一条重复性高且亲水性好的CD20纳米抗体序列,纯化获得了纯度高达85%以上的抗CD20-人IgG Fc纳米抗体。ELISA结果显示其与CD20抗原具有较高亲和力, Western blot结果表明该抗体能特异性识别CD20抗原。结论利用天然噬菌体纳米抗体库成功获得了抗CD20纳米抗体序列,经纯化的抗CD20-人IgG Fc纳米抗体具有高亲和力与特异性。     

结核分枝杆菌优势蛋白PPE37重组载体的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ppe37基因的重组原核表达质粒,并将其转化到E.coli BL21中诱导表达。方法以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增ppe37基因,将其克隆至pEasyE2克隆载体中,构建pEasyE2-ppe37重组质粒。经双酶切后将ppe37基因片段亚克隆到pET30a载体中,构建重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE及WesternBlot对表达产物进行鉴定。结果 PCR法扩增出约1600bp的条带。重组质粒pEasyE2-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE37蛋白基因序列一致。重组原核表达质粒pET30a-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确。SDS-PAGE鉴定表达的组氨酸标签重组蛋白相对分子质量约为50KDa,Western blot验证重组蛋白可与抗组氨酸单抗发生特异性反应。结论成功构建结核分枝杆菌ppe37基因重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并成功诱导表达,为PPE37蛋白作为结核病特异性诊断抗原的开发奠定了基础。     

整合素α5的表达下调抑制肝癌Bel-7404细胞的增殖、侵袭及转移

目的 分析整合素α5（ITGA5）与肝癌分级及肝癌患者总体生存率之间的关系,进一步研究整合素ITGA5基因沉默后对人肝癌Bel-7404细胞增殖、侵袭迁移能力的影响及其作用机制探讨。方法（1）利用UALCAN分析ITGA5在肝癌组织及正常组织中的表达,以及在不同分级肝癌组织中的表达及其差异统计;通过GEPIA在线分析ITGA5表达量与肝癌患者生存情况的关系。（2）培养前期已经构建的ITGA5沉默细胞系,采用Western blot方法检测ITGA5蛋白水平的表达,以鉴定ITGA5基因沉默的效果。（3）采用平板克隆形成实验、Transwell等实验方法检测ITGA5基因沉默后Bel-7404细胞的增殖、侵袭迁移能力的变化。（4）通过Oncomine癌标本数据库分析肝癌组织及对照组织中ITGA5与PI3K表达及分析其相关性。结果（1）ITGA5在肝癌中的表达显著高于正常组,差异有统计学意义（P<0.05）;在不同肝癌分级中,Grade 1的ITGA5 表达量显著低于Grade 2,Grade 2的 ITGA5表达量显著低于Grade 3,差异均有统计学意义（P<0.05）。ITGA5高表达组的总体生存率（OS）显著低于低表达组,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）Western blot鉴定ITGA5基因沉默组的蛋白质表达水平比空白、阴性对照组明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）平板克隆形成实验结果显示,基因沉默组比空白、阴性对照组的克隆形成率降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;Transwell结果显示,基因沉默组细胞穿膜数均比空白及阴性对照组显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）ITGA5和PI3K在肝癌组织中高表达且呈正相关,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 ITGA5与肝癌进展及肝癌患者预后密切相关,其表达下调抑制肝癌细胞的增殖、侵袭迁移;ITGA5可能通过调控PI3K信号通路促进促进肝癌增殖及转移。     

抑制miR-21表达的腺病毒载体构建、病毒包装及其对HepG2细胞的作用

目的:构建能高效抑制成熟miR-21小分子表达的腺病毒载体,探讨其对肝癌细胞株HepC2的影响与机制.方法:基于miRNA sponge技术,合成一段与miR-21序列完全互补的8个重复片段,克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中,经酶切、测序鉴定正确无误后,与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒进行同源重组,转染至293A细胞中,包装成重组腺病毒感染HepG2细胞,通过Hochest33258染色、Western blot法及MTT试验检测细胞的凋亡与增殖水平.结果:经酶切、测序及GFP表达证实,成功构建了携带与miR-21互补的DNA片段的重组腺病毒.经Hochest33258染色、Western blot法及MTT试验证实,该重组腺病毒可以抑制HepG2细胞中miR-21的表达并抑制HepG2细胞的增殖,促进细胞的凋亡.结论:重组包装的抑制miR-21表达的腺病毒可有效的降低miR-21在HepG2细胞中的表达,抑制HepG2细胞的增殖.     

重组干扰素-α增强口蹄疫重组疫苗诱导滤泡辅助性T细胞的研究

目的通过观察重组干扰素-α(IFN-α)佐剂在口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)重组疫苗免疫应答中对滤泡辅助性T细胞(follicular T helper cells,Tfh细胞)的免疫调节作用,为IFN-α佐剂免疫调节的新机制提供实验依据。方法 6周龄雌性Balb/c小鼠分为3组,实验组联合免疫表达猪IFN-α的重组腺病毒(r Ad5po IFN-α)和表达FMDV VP1的重组腺病毒(r Ad5VP1),另设2对照组,分别注射r Ad5VP1和空载体腺病毒(Advirus)。免疫后7 d,应用流式细胞术检测脾脏淋巴细胞中Tfh细胞(CD4+CXCR5+PD-1+)和生发中心(germinal center,GC)B细胞(B220+GL-7+)的增殖分化;real-time PCR技术检测Tfh细胞转录因子Bcl-6m RNA的表达水平;ELISA方法检测血清中细胞因子IL-21蛋白的表达水平。结果与单独免疫r Ad5VP1组相比,联合免疫r Ad5po IFN-α和r Ad5VP1能明显促进FMD重组腺病毒疫苗诱导小鼠Tfh细胞和GC B细胞的增殖分化;重组IFN-α能明显促进FMD重组腺病毒疫苗诱导小鼠Bcl-6 m RNA的表达,提高小鼠血清中IL-21蛋白的分泌水平。结论重组IFN-α能有效增强FMD疫苗诱导小鼠Tfh细胞免疫,为IFN-α佐剂免疫调节作用的新机制提供了理论依据。