抗人肺鳞癌单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备和鉴定抗人肺鳞癌单克隆抗体(mAb),为肺癌的早期诊断和靶向治疗提供候选抗体药物及为肺癌抗原的筛选提供工具。方法:用肺癌细胞株YTMLC-90做抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,间接ELISA和有限稀释法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞获得mAb。染色体计数法鉴定杂交瘤细胞,并进行mAb同种型鉴定;对细胞培养上清液和腹水中的mAb采用间接ELISA法进行初步特异性检测及效价测定;采用Western blot法鉴定其与不同组织抗原结合活性;采用免疫组化染色法鉴定其在肺癌组织中的分布。结果:筛选出5株可稳定分泌抗肺鳞癌mAb的杂交瘤细胞株E2、F9、E11、D5和C6,分泌的抗体均为IgG1亚类,κ亚型。C6染色体数目为89～112条,细胞培养上清和腹水效价分别为1∶1 004和1∶104,ELSA和Western blot结果显示其能特异性与肺癌细胞结合,未见与其他高发癌组织和正常组织结合。结论:成功地制备了能够特异识别肺癌组织的mAb。     

肺鳞癌细胞单克隆抗体的建立及鉴定

 目的 制备出高效价的抗人肺鳞癌单克隆抗体。方法 以云南个旧肺鳞癌细胞YTMLC -90免疫的Balb/C小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤NS-1、SP2/0细胞为亲代细胞,应用鼠-鼠杂交瘤技术建立杂交瘤细胞系。ELISA法筛选,有限稀释法克隆化培养,ELISA法测定抗体效价,双抗体夹心法鉴定Ig亚类,制备染色体,Giemsa染色计数染色体数目,ABC免疫组化法行不同组织细胞的交叉检测。结果 获得三株稳定分泌抗YTMLC-90细胞抗体的杂交瘤细胞株S2D1、N2D1及N3C5。培养上清效价分别为1∶512、1∶284及1∶1024,腹水效价分别为1∶105、1∶104及1∶104;Ig亚类分别为IgG1、IgG2a及IgG3;染色体众数在90～110之间;三株抗人肺鳞癌单克隆抗体与其它组织细胞无交叉反应性。杂交瘤细胞体外传代培养6个月仍保持抗体稳定分泌。结论 成功制备高效且特异的抗人肺癌单克隆抗体。     

C-myc单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备与鉴定鼠抗C-myc蛋白单克隆抗体。方法利用C-myc蛋白做免疫原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经间接ELISA法筛选、有限稀释法克隆、单克隆抗体Ig亚型鉴定,获得2株能够稳定分泌抗C-myc特异性抗体的杂交瘤细胞株,再将杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔诱使小鼠产生腹水。结果获得2株可稳定分泌抗C-myc抗体的杂交瘤细胞株,命名为SHH-1H11,SHH-2A9,Ig亚型分别为IgG1亚类和IgM。细胞培养上清效价分别为1:10240、1:5 120;小鼠腹水效价分别为1:64 000、1:32 000。结论制备的C-myc单克隆抗体仅与C-myc蛋白反应,与其他蛋白没有交叉反应,表明获得的单克隆抗体的特异性很高。     

杂交瘤腹水抗体效价的不稳定性及其对策

自1980年以来，本实验室陆陆续续共制备了针对200余种抗原的约2000余株单克隆抗体（mAb）杂交瘤细胞系。在后续工作中发现大部分抗体分泌能力和效价长期稳定，但遇到有3株出现了不同程度的抗体分泌能力下降，腹水mAb效价由原有的1：10^7降至1：10^4或更低。对此，我们采取了再次克隆化的方法，发现这些细胞系中出现高比例的抗体分泌阴性细胞。不仅证明了腹水mAb效价下降是由于mAb分泌阴性细胞竞争性扩增引起的，而且成功地挽救了这些得来不易的宝贵的杂交瘤细胞系。     

抗解脲脲原体单克隆抗体的制备

作者用提纯的解脲脲原体抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞FO融合,获得3株稳定分泌抗解脲脲原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。制备了小鼠腹水抗体,并对杂交瘤细胞株进行了鉴定。用ELISA法测定该抗体腹水效价为1:64000～1:2048000,1F9、2B2抗体的Ig类型为IgG1,5H1为IgG2b。建立的3株能稳定分泌抗解脲脲原体的McAb杂交瘤细胞林,经液氮冻存后复苏,其分泌抗体能力不受影响。     

人源性TPO单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用人源性ＴＰＯ（ｈｕＴＰＯ）皮下免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取脾细胞与ＳＰ２／０实体瘤细胞融合，建立了２株稳定分泌抗ＴＰＯ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为１９Ｄ１２和４９Ａ５，并对其进行了初步鉴定，采用简易正辛酸法从腹水中纯化单克隆抗体。结果：细胞融合率为８２％，杂交瘤细胞染色体数目正常，分泌的抗体为ＩｇＧ，腹水抗体效价为０．６￣１．２×１０＾－３，与ＥＰＯ、ＧＭ－ＣＳＦ无交叉反应，连续培养生物性状     

人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的研制

目的获得针对人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体。方法hCG蛋白免疫Balb／c小鼠，取其脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞NS-1按8：1比例融合，间接ELISA法筛选阳性克隆，有限稀释法进行克隆化培养；制备腹水抗体；采用间接ELISA法鉴定抗体亚型和测定抗体效价。结果得到6株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；抗体经鉴定均为IgG1、κ型，效价均达10^-5以上。结论所获得的6株杂交瘤细胞株均有较强稳定分泌抗-hCG单克隆抗体的能力。这为有关hCG的检测、hCG本身相关研究以及避孕疫苗的研制打下了基础。     

抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定

目的:制备抗人DcR3单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性.方法:纯化的His-DcR3融合蛋白免疫小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人DcR3 mAb并进行纯化,纯化后的抗体经Western blot和ELISA方法鉴定其特异性、Ig亚型和效价.结果:获得5株稳定分泌抗DcR3 mAb的杂交瘤细胞,均属IgG1亚型,其腹水抗体效价为1×10-5 ～1×10-7,Western blot显示5株细胞分泌的mAb均可识别DcR3蛋白,其中1株(1B1)可与SW480细胞成分反应.结论:成功建立稳定分泌抗人DcR3 mAb的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体特异性强、效价高,为研究DcR3在组织中的表达、分布及研制ELISA试剂盒奠定基础.     

人—人杂交瘤免疫球蛋白分泌稳定性的研究

对三株人—人杂交瘤细胞株的免疫球蛋白分泌稳定性作了研究。研究中注意到用有限稀释法多次克隆的杂交瘤细胞(C_(10),13H_2)与未经克隆的细胞株(F_3)在体外培养和扩增中,其细胞形态大小,染色体数和抗体分泌能力有不同程度的变化。研究证实杂交瘤球蛋白分泌稳定性与染色体丢失或不分泌群体的过度生长有关。我们用HAT筛选培养液进行再处理,注意到C_(10)这一株细胞的四倍体细胞数明显增加,抗体分泌量也有所增加。结果提示对杂交瘤细胞及早克隆,或适时用HAT进行重筛选,对稳定分泌群体可能有一定的效果。     

人红细胞凝集型单抗的制备与鉴定

目的制备人红细胞凝集型单克隆抗体并进行鉴定。方法以3种方式处理人血红细胞,获得红细胞免疫原,分别免疫Balb/c小鼠。应用杂交瘤技术,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,以凝集实验筛选分泌凝集型抗体的杂交瘤细胞,继而用有限稀释法克隆3次,并对杂交瘤细胞的稳定性进行测定。通过腹水法制备抗体,亲和层析法纯化抗体,对抗体的特性进行研究。结果 3种方式获得的免疫原均能建立有效的免疫反应,低渗加超声破碎法所获得的小鼠血清抗体效价最高。通过融合获得8株可稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,其中,4A1分泌的抗体凝集效价最高。抗体可使4种人血型的红细胞凝集,无种属交叉凝集反应。结论有效制备了针对人红细胞的凝集性单抗,为其之后的应用研究奠定了基础。     

重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)单克隆抗体,为rLZ-8的药效学及药代动力学研究奠定基础.方法:以纯度99%的rLZ-8免疫BALB/c小鼠;应用常规的细胞融合技术建立一种能够稳定分泌抗rLZ-8单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用小鼠腹腔接种法制备腹水;Protein A Sepharose 亲和层析柱在AKTA纯化仪上对抗体进行纯化;间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价;Western blot胶片曝光方法对rLZ-8单克隆抗体特异性进行分析.结果:筛选出2株可特异性分泌抗rLZ-8单克隆抗体的杂交瘤细胞株.分别命名为clone13-2-3和clone11-4-4.其抗体亚型分别为IgG1亚型和IgG2a亚型.腹水抗体效价分别为1:12 000和1:7 500,细胞培养上清效价分别为1:3 000和1:2 800.Western blot检测证明这两株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体均具有良好的特异性.结论:成功制备出较高效价和较高特异性的鼠抗rLZ-8的单克隆抗体.     

EPF单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本文用纯化的早孕因子免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，通过鼠－鼠杂交瘤技术，成功地建立了２株分泌ＥＰＦ单克隆抗体的杂交瘤细胞。经检测，它们所分泌的抗体亚类均为ＩｇＧ１，毁交瘤染色体数目１００－１０６条，ＥＩＳＡ检测诱生腹水抗体效价为１：１．２８＊１０＾５，连续培养生物学性状稳定。抗ＥＰＦ抗原的单克隆抗体的建立，为深入研究ＥＰＦ的生物学性质、特征提供了有力的工具。     

CK20单克隆抗体研制及鉴定

目的：研制CK20单克隆抗体。方法：采用CK20抗原免疫小鼠，用免疫的脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞通过PEC4000融合，以HT培养基选择培养，间接ELISA法筛选阳性孔和有限稀释法克隆细胞后，接种小鼠腹腔制备腹水抗体，抗体纯化采用以SPA—Sepharose CL-4B为固定相的亲和层析法，最后用双向琼脂扩散法、Western blot和间接ELISA法鉴定抗体的特异性、Ig亚型和效价。结果：获得一株稳定分泌抗CK20单克隆抗体的杂交瘤细胞，染色体众数为101（99～103），其腹水抗体和纯化的抗体效价均为1：10^6，属IgGl亚型。结论：成功获得了CK20单克隆抗体，命名为120031030，其特异性强，效价高。     

鼠抗人PD-L1单克隆抗体的研制和生物学活性鉴定

目的 研制鼠抗人PD-L1功能性单克隆抗体,并对其生物学活性进行鉴定.方法 以前期原核表达的人硫氧还原蛋白-（PD-L1）融合蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,Western-Blot和酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选阳性杂交瘤细胞,竞争抑制法ELISA实验鉴定抗体的特异性亲和力,小鼠腹水法作大量抗体制备.结果 获得4株能够稳定分泌特异性抗PD-L1抗体的杂交瘤细胞,经验证所分泌的抗体具有较强的特异性亲和力,经过大量抗体制备和纯化获得效价大于1∶32000的纯化抗体;同时获得1株能稳定分泌抗硫氧还原蛋白抗体的杂交瘤.结论 成功制备了鼠抗人PD-L1单克隆抗体,为下一步应用研究奠定了基础.     

眼镜王蛇毒单克隆抗体的制备

目的:应用眼镜王蛇毒基因疫苗,免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体(mAb).方法:应用眼镜王蛇Oh-3基因真核表达质粒pIRES-Oh3,佐以脂质体制成基因疫苗,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与同源Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选,有限稀释法克隆,制备mAb.结果:获得了2株分泌抗眼镜王蛇毒mAb的杂交瘤细胞株(F5、 F11),细胞培养上清液的抗体效价分别为3.2×10-1、 6.4×10-1,腹水抗体效价分别为1.28×10-4、 2.56×10-4.结论:成功地制备了2株眼镜王蛇毒mAb.     

抗环孢菌素A单克隆抗体的制备和特性鉴定

目的:制备环孢菌素A(CsA)的单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:采用光化学反应制备CsA全抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆,以ELISA法对杂交瘤细胞的稳定性和mAb的特性进行鉴定。结果:获得1株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞4E1-C4-E12,细胞培养上清效价、腹水效价分别为1∶200和1∶105,为IgG1类,可特异性识别CsA,与其类似物CsC、CsD交叉反应率为13.3%、21.5%。结论:成功地制备了针对CsA的mAb,为进一步研制检测CsA的ELISA试剂盒奠定基础。     

抗狂犬病病毒CVS-11株单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备抗狂犬病毒单克隆抗体,为建立快速准确的狂犬病毒抗原检测方法奠定基础.方法 将狂犬病病毒CVS-11株纯化浓缩后免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经细胞克隆和间接ELISA筛选,获得稳定分泌抗狂犬病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株.小鼠腹腔注射法制备大量单克隆抗体并测定腹水效价,用G蛋白亲和层析柱进行纯化,间接ELISA法和间接荧光法鉴定单克隆抗体的类型、特异性及敏感性.结果 细胞融合率达100%,经克隆筛选获4株稳定分泌抗狂犬病病毒抗体的杂交瘤细胞株,其腹水效价分别为1×104,1×105,1×104和1×105;4株单抗均为IgG类型且特异性好.结论 制备的单抗具有良好特异性和敏感性.     

呼吸道合胞病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的：建立能稳定分泌抗呼吸道合胞病毒（RSV-long株,国际标准株）单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法：杂交瘤技术制备单抗,鉴定各项特性。结果：培育出稳定分泌抗RSV蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞5株。杂交瘤细胞株染色体数目在89～104条之间,其分泌的抗体分别属于鼠IgG1、IgG2a、IgG2b亚类,各种腹水单抗的荧光效价在1∶4000～1∶16000之间。一种单抗识别RSV基质蛋白（M）,两种单抗识别RSV融合蛋白（F）,另两种单抗识别RSV核衣壳蛋白（N）。单抗中和效价最高达1∶64。相加指数证实5种单抗识别不相关的抗原表位。用硫氰酸铵洗脱法比较了五种单抗相对亲和力的大小,依次为：1#〉2#〉4#〉3#〉5#。所有杂交瘤细胞株,经连续3个月培养及冻存半年后复苏,细胞生长良好,检测上清,其分泌抗体效价稳定。结论：已获得抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体,为RSV感染的早期诊断及进一步研究奠定了基础。     

一株中和人IL-17免疫活性的单克隆抗体的制备

目的制备抗人IL-17单克隆抗体,并鉴定其中和活性。方法用hIL-17作为免疫和检测抗原,用间接ELISA法筛选分泌抗人IL-17抗体的杂交瘤细胞株,并对抗体进行中和活性鉴定。结果获得1株稳定分泌抗人IL-17单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型重链为IgG2b,轻链为κ;该株杂交瘤细胞腹水效价为1∶8.192×105;传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;Western Blot检测证明该单抗与人IL-17蛋白特异地结合;单抗亲和常数为8.192×10-9 mol/L;ELISA及Real-time-PCR检测证明该单抗能够有效地阻断人IL-17刺激Hela细胞产生IL-6的作用。结论所制备的抗人IL-17单克隆抗体具有高度的特异性、稳定性及中和活性,为针对IL-17为靶点的抗体药物的开发奠定了基础。     

一组识别人大肠癌相关抗原的McAb的特性及反应性

作者报道用人新鲜大肠癌实体瘤细胞免疫制备的16个McAbs的免疫化学特性。用Sp2/0细胞与新鲜实体瘤细胞免疫小鼠的脾细胞,在PEG—4000作用下细胞融合。ABC免疫组化法筛选,鉴定抗体和抗原理化性质,以及效价测定,琼脂双扩散法鉴定Ig亚类。用放免等3种方法测定与CEA的反应性,APAAP和血凝法鉴定与细胞抗原的结合。免疫转印技术测定抗原分子量。 61次融合获28孔只与大肠癌组织反应的杂交瘤细胞,16孔经3次克隆化培养。16个多月仍分泌抗体,其中13个为IgG1,3个为IgM,上清效价1:20～160,腹水为10~(-4)～10~(-9)。染色体分析符合杂交瘤特征。